Extracción de sangre del cangrejo herradura de América, Limulus polyphemus

Resumen

El cangrejo de herradura de América, Limulus polyphemus, es sin duda la fuente más conveniente para grandes cantidades de sangre de cualquier invertebrado. La sangre es simple en su composición, con un solo tipo de células en la circulación general, los amebocitos granular, y sólo tres abundantes proteínas en el plasma, la hemocianina, la proteína C-reactiva, y la α2-macroglobulina. La sangre se recoge desde el corazón y las células de la sangre y el plasma se separa por centrifugación.

Resumen

El cangrejo de herradura tiene el mejor sistema caracterizado inmune de cualquier invertebrado de larga duración. El estudio de la inmunidad de los cangrejos de herradura ha sido facilitada por la facilidad en la recolección de grandes volúmenes de sangre y de la simplicidad de la sangre. Los cangrejos de herradura mostrar sólo un solo tipo de células en la circulación general, los amebocitos granular. El plasma tiene el contenido de sal del agua del mar y sólo tres abundantes proteínas, hemocianina, la proteína de las vías respiratorias, las proteínas C-reactivas, que funcionan en la destrucción citolítica de las células extranjeras, incluyendo las células bacterianas, y α2-macroglobulina, que inhibe las proteasas de los patógenos invasores. La sangre se recoge mediante punción cardíaca directa en las condiciones que reduzcan al mínimo la contaminación por lipopolisacárido (endotoxina aka, LPS), un producto de las bacterias Gram-negativas. Un animal grande puede producir 200 a 400 ml de sangre. Para el estudio del plasma, células de la sangre inmediatamente eliminado del plasma por centrifugación y el plasma puede ser fraccionado en sus proteínas constituyentes. Las células sanguíneas se encuentran convenientemente estudiado microscópicamente mediante la recopilación de pequeños volúmenes de sangre en LPS libres de solución salina isotónica (0,5 M NaCl) bajo condiciones que permitan el examen microscópico directo mediante la colocación de uno de los más LPS libres de cubres en la superficie del plato de cultivo, y luego montar los cubres en las cámaras de la simple observación después de la adhesión celular. Una segunda preparación para la observación directa es recoger 3 a 5 ml de sangre en un plato de embriones libres de LPS y luego explantar fragmentos de amebocytes agregados a una cámara que sandwiches el tejido entre un portaobjetos y cubreobjetos uno. En esta preparación, el amebocytes móviles migran hacia la superficie cubre objetos, donde fácilmente se puede observar. El sistema de coagulación de la sangre consiste en la agregación de amebocytes y la formación de un coágulo extracelular de una proteína, coagulin, que se libera de los gránulos secretores de las células sanguíneas. El análisis bioquímico de las células de sangre lavada requiere que la agregación y degranulación no se produce, lo cual puede lograrse mediante la recolección de sangre en 0,1 volúmenes de 2% de Tween-20, 0,5 M LPS sin NaCl, seguido de centrifugación de las células y el lavado con 0,5 M NaCl.

Protocolo

Las características anatómicas del cangrejo herradura correspondiente a la hemorragia (Fig. 1)

Figura 1

1. Las tres divisiones principales del cuerpo, de adelante hacia atrás, son el prosoma (P), el opistosoma (O), y el telson (T) ^1.
2. Los márgenes de libertad anterior y lateral del prosoma es la brida.
3. El sangrado posterior-la mayoría de los opistosoma, donde se articula el telson, es la bahía de terminales.

Discusión

Hay cuatro especies de cangrejo de herradura, Limulus polyphemus de la costa este de América del Norte y tres especies que van desde Japón a la Bahía de Bengala. El animal es identificado como un "fósil viviente" porque las formas anatómicas similares se han encontrado fósiles de 445 millones de años ^27. El cangrejo de herradura representa un animal de larga vida, que requieren 10 - 13 años para alcanzar la madurez y la vida al menos 20 años ^28. A pesar de que ha sido sometido a la cosecha extensa co.......