Esta es una guía para modificar la forma de pipetas de vidrio. En concreto, mediante el uso de calor y presión de aire el cono se ensancha sin aumentar la apertura de la punta, lo que lleva a la resistencia a la pipeta inferior. Esto es fundamental para conseguir grabaciones de bajo nivel de ruido de células pequeñas, pero es útil en muchas aplicaciones.
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Artículo de método
Pulido a presión para la Mejora de pipetas de patch-clamp grabación
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Resumen
Resumen
La presión de pulido es un método para dar forma a las pipetas de vidrio para la grabación de patch-clamp. En primer lugar, desarrolló este método para la fabricación de pipetas adecuado para la grabación de los pequeños (<3 m) los cuerpos de las células neuronales. El principio básico es similar al de soplado de vidrio y combina la presión del aire y el calor para modificar la forma de pipetas parche preparado por un extractor de micropipeta convencionales. Se puede aplicar a las llamadas blandas (refresco de limón) y difícil de anteojos (borosilicato). En términos generales, el pulido de presión puede reducir la resistencia a la pipeta en un 25% sin disminuir el diámetro de la abertura de la punta (Goodman y Lockery, 2000). Se puede aplicar a prácticamente cualquier tipo de vidrio y sólo requiere la adición de una válvula de alta presión y la instalación de un microforge. Esta técnica es esencial para la grabación de las células ultra (<5 m) y también puede mejorar de un solo canal de grabación, reduciendo al mínimo la resistencia a la pipeta. La forma contundente es también útil para la grabación de la abrazadera perforada del parche ya que los resultados de la punta en forma de una vesícula de membrana más grande disponible para la perforación.
Protocolo
Pipetas tirando
El uso de un filamento, como un extractor de Sutter P-97 Extractor de microelectrodos Flaming / Brown, tirar de un conjunto de aproximadamente 10-20 pipetas.
- Seleccione su vaso. Usamos borosilicato (BF150-86-10, OD = 1,5 mm, ID = 0,86 mm). Almacenar el vidrio con cuidado para que permanezca limpia y libre de polvo.
- Diseñar un programa de extracción. El objetivo principal es la apertura de una punta de aproximadamente el tamaño deseado, lo que dependerá de la aplicación. P-97 de Sutter Cookbook Pipetear 2 es una excelente referencia.
- Observe sus pipetas bajo un microscopio para determin....
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Discusión
Lo que originalmente se desarrolló este método para pipetas útil para la grabación de patch-clamp 2-3 micras neuronas en C. elegans 1. Es en el uso rutinario en el laboratorio de Goodman. Estamos a la presión de uñas pipetas no sólo para la grabación de pequeñas C. neuronas elegans, pero también para la obtención de grabaciones macropatch y de un solo canal de los canales iónicos expresados en ovocitos de Xenopus. Para que una punta de apertura de diámetro, la forma contundente produce una pipeta de m.......
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Agradecimientos
La técnica de la presión de pulido se ha desarrollado en colaboración con Lockery SR.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| Capilares de vidrio | Material de consumo | Sutter Instrument Co. | BF150-85-10 (o similar) | El método funciona con cualquier tipo de capilar, excepto con los fabricados de cuarzo. Sin embargo, recomendamos usar capilares con filamento. |
| Microscopio invertido | Microscopio | Leica Microsystems | DM IL (o similar) | Cualquier microscopio invertido sencillo es válido. No obstante, es fundamental contar con suficiente aumento para ver las pipetas durante el pulido. Utilizamos una lente metalúrgica de 100x con larga distancia de trabajo para este fin. |
| Kit de microforja | Herramienta | ALA Science | CPM-2 | Incluye bobina de pulido, controlador y pedal. |
| Fuente de presión de aire | Herramienta | ALA Science | PR-60 | Accesorio para proporcionar alta presión, incluye una válvula adecuada. Alternativamente, se puede usar aire comprimido del edificio junto con un filtro/regulador (ajustado a 40 PSI) y una válvula de 4 vías (véase más abajo) |
| Válvula de 4 vías | Herramienta | Cole-Parmer | A-98150-01 | Se necesitarán accesorios para acoplar la válvula al tubo |
| Soporte para pipeta con conector Luer | Herramienta | World Precision Instruments, Inc. | MPH-6S20 | Utilice un accesorio macho Luer-a-barba para conectar el soporte de pipeta al tubo de alta presión |
| Tubo Tygon® | Herramienta | Cole-Parmer | 06408-62 | Utilice este tubo para conectar el soporte de pipeta a la válvula de 4 vías |
Referencias
- Goodman, M. B., Lockery, S. R. Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. . J Neurosci Methods. 100, 13-15 (2000).
- Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. , Sutter Instrument. http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf (2008).
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Reimpresiones y permisos
