Aquí presentamos un método para aislar y cultivar cerebelosa gránulo células progenitoras de neuronas y las neuronas del cerebelo gránulo de ratón postnatal.
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Artículo de método
Aislamiento y cultivo de Post-Natal células de ratón cerebelosa gránulo Progenitor neuronas y las neuronas
En este artículo
Resumen
Resumen
La corteza del cerebelo es una estructura bien descrito que ofrece oportunidades únicas para el estudio de las propiedades neuronales y 1,2 de desarrollo. De los tipos neuronales del cerebelo (células granulosas, células de Purkinje y las interneuronas inhibitorias), las neuronas granulares son con mucho los más numerosos y son el tipo más abundante de las neuronas en el cerebro de los mamíferos. En roedores, las neuronas del cerebelo gránulo se generan durante las dos primeras semanas después del parto a partir de células progenitoras en la capa más externa de la corteza cerebelosa, la capa granular externa (EGL). El protocolo que aquí se presenta describe las técnicas para enriquecer la cultura y las neuronas granulares y sus células progenitoras de cerebelo de ratón post-natal. Vamos a describir los procedimientos para obtener cultivos de pureza cada vez mayor de 3,4, lo que puede ser usado para estudiar la diferenciación de la proliferación de células progenitoras en 5,6 neuronas granulares. Una vez que las células progenitoras se diferencian, las culturas también proporcionan una población homogénea de las neuronas granulares para la manipulación experimental y caracterización de fenómenos como la sinaptogénesis, la función del receptor de glutamato 7, la interacción con otras células del cerebelo 8,9 purificada o muerte celular 7.
Protocolo
Parte 1: Configuración (1-2 días antes de la disección) (No se muestra el vídeo)
- PREPARACIÓN DE SOLUCIONES CULTURA Y MEDIOS DE COMUNICACIÓN:
- 4X CMF-PBS-EDTA (calcio y magnesio libre de tampón fosfato salino-EDTA para las diluciones de Percoll) por litro, agregar 32 g de NaCl, 1,2 g KCl, 8 g de glucosa, 2 g de NaH 2 PO 4, 1 g KH 2 PO 4, 8 ml 2% NaHCO stock 3, 10 ml 1M EDTA (pH 8,0) a agua destilada / desionizada. Ajuste el volumen a 1 litro y el pH a 7,4. Filtro de esterilización.
- HBSS-glucosa: glucosa Añadir (6 gramos / litro) de calcio y magnesio Solución libre salina equilibrada de ....
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Discusión
Este protocolo se basa en modificaciones de los procedimientos que se han descrito en el pasado 3,7,11. Hay varios puntos importantes que tenga en cuenta como veremos a continuación.
Las neuronas granulares y las células progenitoras se adhieren a las 2 horas de la siembra. Las células sanas tienen una morfología redonda bajo el 4 microscopio de contraste. Dentro de 24 horas después de la siembra, las células sanas se distribuye uniformemente en todo el cubreobjetos o el plástico y así se forma los procesos. En.......
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Agradecimientos
Damos las gracias a Barbara Carletti y Anna Marie Kenney sugerencias invaluable. HYL el apoyo de la Formación Grant "Hormonas: Bioquímica y Biología Molecular", DK07328. Apoyado en parte por el NIH subvención 5R01 NS16951 (CAM).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Filtro celular con malla de poro de 70μm | BD Biosciences | 352350 | |
| Aguja espinal | BD Biosciences | 405182 | 20G x 3-1/2 pulgadas |
| Poli-D-lisina, peso molecular>300.000 | Sigma-Aldrich | P1024 | Debe probarse cada nuevo lote de poli-D-lisina. |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P-1644 | |
| Penicilina-estreptomicina (100X) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175-103 | Debe estar libre de calcio y magnesio. |
| Medio Neurobasal A | Invitrogen | 10888-022 | |
| Suplemento Glutamax I | Invitrogen | 35050-061 | |
| Suplemento libre de suero B-27 (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| Cubreobjetos circulares de 12 mm | Carolina Biological | 63-3029 | Estos se fabrican en Alemania por Deckglaser. |
| Cubreobjetos circulares de 25 mm | Carolina Biological | 63-3037 | Estos se fabrican en Alemania por Deckglaser. |
| Sistema de disociación con papaína | Worthington Biochemical | LK 003150 | El kit sirve para cinco aislamientos. |
| Tijeras Permaset | Roboz Surgical Instruments Co. | RS6782 | |
| Dumont n.º 5 (Dumostar) | Roboz Surgical Instruments Co. | RS4978 | |
| Placa de cultivo de 4 pocillos | Nalge Nunc international | 176740 | |
| Placa de cultivo de 6 pocillos | Nalge Nunc international | 140685 |
Referencias
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of the cerebellar system: in relation to its evolution, structure, and functions. , CRC Press. Boca Raton. (1997).
- Hatten, M. E., Heintz, N. Annual Review of Neuroscience. 18, 385-285 (1995).
- Hatten, M. E., Gao, W. -Q., Morrison, M. E. in Culturing Nerve Cells<....
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Reimpresiones y permisos
