Análisis de los Rolling fisiológicos de E-selectina leucocitaria mediada por el endotelio microvascular

Este video muestra el análisis de la cámara de flujo de placa paralela para examinar los factores que desencadenan el rodaje de los leucocitos en las superficies de las células endoteliales. Las monocapas de células endoteliales se estimulan con la citocina proinflamatoria IL one beta para regular al alza la expresión de S. selectina. A continuación, se coloca la cámara de flujo de placa paralela sobre las células endoteliales y se infunden leucocitos S selectina positivos sobre la monocapa.

De este modo, las interacciones celulares en la cámara se imparten con una tensión pura que es similar a la de la adhesión leucocitaria postcapilar. Los eventos continuos se capturan y enumeran utilizando elementos NIS y se analizan para la independencia de selección E. Hola, soy George Weis en el laboratorio del Dr. Charles de Nitro en el Departamento de Dermatología del Hospital de Mujeres Brigman de la Facultad de Medicina de Harvard.

Hoy vamos a mostrar un procedimiento para analizar el papel de los ligandos de E selectina e selectina en la adhesión de leucocitos humanos a células endoteliales de médula ósea humana en condiciones fisiológicas de flujo sanguíneo. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar el papel de las moléculas de la superficie celular que inician la adhesión de los glóbulos blancos o las células cancerosas metastásicas a las células endoteliales, que recubren la superficie interna de los vasos sanguíneos. Este evento adhesivo se caracteriza por un comportamiento de rodadura como una bola de boliche rodando por un carril.

Así que comencemos. El primer paso en este procedimiento es preparar las células endoteliales que revestirán la cámara de flujo. Este protocolo utiliza células H-B-M-E-C 60 derivadas de la médula ósea humana.

placas de cultivo de microvasculatura deben estar pre-recubiertas con fibronectina para prepararlas, incuben placas de cultivo de tejidos de 35 mililitros con PBS que contengan 20 microgramos por mil de fibronectina. Estos pueden incubarse durante la noche a cuatro grados centígrados o durante tres horas a 37 grados centígrados. Suspender H-B-M-E-C 60 células en medio 1 99 y sembrar de 10 a la quinta celdillas por plato, hacer crecer los cultivos hasta más del 90% de confluencia.

Esto tomará alrededor de dos días para regular al alza e seleccionar y aspirar la expresión del medio de crecimiento y agregar medio fresco con 50 nanogramos por mil de IL una incubación beta durante cuatro a seis horas. Las monocapas celulares ya están listas para el ensayo de la cámara de flujo. Las placas adicionales de células H-B-M-E-C 60 pueden estimularse con IL uno beta y tratarse con un anticuerpo neutralizante anti-selectina humana a 20 microgramos por mil, durante una hora a 37 grados Celsius.

Esto controlará la expresión funcional de la selectina e. A continuación, prepare los leucocitos e selectina positivos. Se trata de células progenitoras hematopoyéticas humanas.

Estos se cultivan en suspensión para confluir o atender a las seis celdas por mil en RPMI 1640. Las células KG one A pueden pipetearse directamente desde el cultivo y contarse en un hemocitómetro. Resus suspende las células a 10 a las seis células por mil en HBSS con 10 milimolares de hep o tampón HH que contiene dos milimolares de cloruro de calcio.

Almacene las células en hielo hasta que se ensayen. Los siguientes pasos consisten en preparar el microscopio, la cámara de flujo de placa paralela y la bomba de jeringa. Para el ensayo, encienda el microscopio y la bomba de jeringa.

Seleccione el objetivo 10 x en el microscopio. Coloque un tubo cónico de 50 mililitros en el soporte y llénelo con tampón HH con dos milimolares de cloruro de calcio. A continuación, coloque tubos de ensayo de plástico de cinco mililitros en el soporte de abajo.

A continuación, coloque una jeringa de 60 mililitros en la bomba de jeringa. Asegúrese de que tanto el émbolo como el cuerpo de la jeringa estén seguros. Coloque una llave de tope de tres vías en el extremo de la jeringa de 60 milésimas de pulgada y luego una jeringa de cinco milésimas de pulgada en la llave de tope de tres vías.

Coloque el aparato de cámara de flujo paralelo en la platina del microscopio con el tubo de entrada a la derecha, el tubo de salida a la izquierda y el tubo de vacío en la parte posterior. Después de conectar el tubo a la aspiradora, abra la válvula de aire para permitir que el aparato de placa paralela se adhiera a la plataforma. Esto probará si el faldón de vacío en la cámara de flujo es hermético.

Cuando el sello esté afirmado, cierre la válvula de aire. Ahora conecte la línea del tubo de salida a la llave de paso de tres vías que ya está conectada a la jeringa. El aparato ya está listo para colocarse sobre las células H-B-M-E-C 60.

Encienda la aspiradora, baje suavemente el aparato de la cámara de flujo sobre la placa y permita que el aparato succione. No debe haber sonidos de escape de aire y en este punto es posible que deba aplicar presión a la cámara para comprimir la junta de goma. Una vez que se haya establecido el vacío, coloque el tubo de entrada en el tubo cónico de 50 mililitros.

Abra la llave de paso de tres vías a la jeringa de 60 milésimas de pulgada y coloque la bomba en modo de bomba para eliminar el aire de las líneas sin levantar las celdas de la placa. Use la bomba de jeringa configurada a dos milésimas de pulgada por minuto para llenar el tubo de admisión. A continuación, ajústelo rápidamente a 0,5 milésimas de pulgada por minuto.

Justo antes de que el fluido llegue al aparato, es fundamental cebar la configuración con cuidado y evitar las burbujas de aire, que levantarán la monocapa de la placa. Una vez que el fluido entra en la jeringa de 60 milésimas de pulgada, la cámara de flujo y la bomba de jeringa se ceban. Ahora, asegure el flujo de la cámara a la etapa con un trozo de cinta adhesiva sobre cada una de las líneas de entrada, salida y vacío.

Esto garantiza que el campo de visión permanezca constante al visualizar y recopilar los datos. La cámara de flujo ya está lista para su uso. Estos pasos deben repetirse para cada ejecución de entrada de celda y para cada placa nueva.

Para capturar eventos continuos del sitio de Lucas, abra los elementos NIS en el escritorio, presione el ícono de reproducción para obtener una imagen en vivo. La exposición automática le permitirá ver la placa y enfocar la imagen. Asegúrese de que el microscopio esté enfocado correctamente en la monocapa celular ajustando el enfoque manualmente en el microscopio.

Una vez que la imagen esté enfocada, restablezca la exposición a un fotograma por segundo y ajuste la luz en el microscopio. La imagen debe aparecer en la computadora y ya no debe ser visible en el microscopio. A continuación, se puede ajustar el histograma de luz Para eliminar la exposición del fondo o mejorar la claridad de la celda, haga clic en la bandeja de dos en dos o en la bandeja en vivo para obtener una imagen que sea ideal para la captura de películas.

Haga clic en macro en la barra de menú y seleccione a la derecha para el puerto, seleccione el puerto com tres y abra. Esto abre el puerto para que se coordine con la bomba de jeringa. La cámara de flujo ahora está lista para ser infundida con celdas KG one A, pipetea una milésima de pulgada de suspensión KG one A S en el tubo de ensayo de cinco milésimas de pulgada cerca de la línea de tubería de entrada.

A continuación, coloque la línea de entrada en la parte inferior del tubo de ensayo. Vaya a la barra de menú y haga clic en captura y adquisición de lapso de tiempo. Seleccione el protocolo que dura 210 segundos.

Esta es la duración del programa para rodar en celdas H-B-M-E-C 60. Cada fase está programada para tomar una fotografía cada segundo durante la duración del protocolo de la bomba. También está configurado para enviar un comando a través del puerto comm three para iniciar la bomba.

Configure la bomba de jeringa en modo de programación, lo que permite la programación manual de caudales específicos. Esto determinará los niveles de tensión dentro de la cámara y dictará las interacciones de la célula KG uno A sobre las células H-B-M-E-C 60. Los ajustes para estas interacciones son 4,2 dinas por centímetro cuadrado durante 45 segundos.

El punto tres cenas por centímetro cuadrado durante 60 segundos y las distancias aumentan cada 15 segundos hasta un máximo de 4,2 cenas por centímetro cuadrado. El microscopio y la computadora ahora están listos para capturar fotografías de lapso de tiempo. Presione iniciar ejecución en la computadora para comenzar a adquirir datos mientras se ejecuta el programa.

Asegúrese de agregar medios al tubo que contiene celdas KG one A para mantener el tubo de entrada y salida lleno de medio y evitar que entren burbujas de aire en el sistema. Si se interrumpe el lapso de tiempo, la bomba no se detendrá por sí sola y deberá restablecerse. Pulse cancelar para volver a la imagen en directo.

Una monocapa de células endoteliales no estimuladas sirve como control negativo para este experimento. Para hacer esto, infunda leucocitos KG uno A en la cámara de flujo sobre células H-B-M-E-C 60 no tratadas para controlar la independencia de selección e, estimular la capa mono de células endoteliales con IL uno beta e infundir los leucocitos sobre estas células para controlar aún más la independencia de eect. Trate las células H-B-M-E-C 60 con IL uno beta y luego con el anticuerpo S selectina humano.

A continuación, analice los eventos de rodadura de leucocitos en estas células. El rodamiento celular no solo está determinado por la selectina S, sino también por los residuos de ácido en rodajas en la superficie celular de los leucocitos. Para demostrar esto, digiera las células KG uno A con 0,1 unidades por mil de neuraminidasa durante una hora a 37 grados centígrados.

A continuación, analice los eventos de rodadura sobre las células H-B-M-E-C 60 estimuladas. Las glicoproteínas en la superficie de los leucocitos también son importantes para la formación de las células. Esto se puede demostrar tratando las células KG uno A con 0,2 unidades por milésima de pulgada durante una hora a 37 grados centígrados, y luego infundiéndolas en la cámara de flujo.

Una vez adquirida la secuencia de tiempo, los datos están listos para el análisis. Guarde los datos y vaya a la pestaña de medición en la barra de menú y seleccione el umbral definido. Mueva las barras para que las celdas deseadas se coloreen en rojo, seleccione todas las imágenes y luego esté bien, toda la secuencia de lapso de tiempo ahora debe modificarse con celdas rojas rodantes visibles.

Ve a medir y selecciona restricciones. Esto permite al usuario excluir objetos de umbral que no representan celdas móviles. Se trata principalmente de un fondo creado por la monocapa H-B-M-E-C 60 que selecciona el área e ingresa los valores mínimos y máximos, que son ideales para los leucocitos rodantes.

Repita este paso para elongación y circularidad: Seleccione medida y, a continuación, seleccione crear binario mediante restricciones. Los mismos valores de restricción, que se establecieron en el paso anterior, ahora se utilizarán para optimizar el software de elementos NIS para reconocer leucocitos rodantes en la monocapa de células endoteliales. Vuelva a medir, seleccione datos de campo y, a continuación, seleccione restablecer datos.

Cierre el menú, vuelva a medir y seleccione el campo de escaneo, abra los datos del campo de medición y seleccione el número o los objetos. A continuación, seleccione todos los campos y exporte los datos a Microsoft Excel. Por último, seleccione borrar datos.

NIS elements ya está listo para una mayor recopilación de datos. Estos datos representativos muestran cómo las interacciones de las células endoteliales leucocitarias responden al estrés fisiológico, probando específicamente el papel del ligando adhesivo. E seleccionando.

El rodaje robusto de los leucocitos se produce cuando las células endoteliales son preestimuladas con IL uno beta. Al comparar este resultado con el control no estimulado, está claro que el rodamiento celular depende de la estimulación de citoquinas. Al tratar las células H-B-M-E-C 60 con IL uno beta y luego con el anticuerpo E selectina humano, queda claro que el rodaje celular depende específicamente de la selectina E.

Este ensayo también se puede utilizar para probar otros parámetros. Por ejemplo, cuando las células estimuladas se tratan previamente con una sase o con brolin, los resultados son menos robustos. Estos datos ponen de manifiesto la importancia de los residuos terminales de ácido cortante, así como de las glicoproteínas de la superficie celular.

Para la actividad del ligando S selectin, acabamos de mostrarle cómo analizar las interacciones adhesivas basadas en E selectina entre leucocitos y células endoteliales en condiciones que imitan las fuerzas presentes en un venial postcapilar, la región del sistema de circulación donde los leucocitos salen de la sangre e ingresan a los tejidos. Al realizar este procedimiento, es importante recordar utilizar el anticuerpo bloqueante adecuado o el control del tratamiento enzimático para validar la necesidad de la selectina respectiva y su ligando en este sistema de ensayo. Así que eso es todo.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.