Análisis de los Rolling fisiológicos de E-selectina leucocitaria mediada por el endotelio microvascular

Este video demuestra el análisis mediante una cámara de flujo de placas paralelas para examinar los factores que desencadenan el rodamiento de leucocitos sobre las superficies de células endoteliales. Las monocapas de células endoteliales se estimulan con la citocina proinflamatoria IL-1β para aumentar la expresión de S-selectina. Luego, se coloca la cámara de flujo de placas paralelas sobre las células endoteliales y se infunden leucocitos positivos para S-selectina sobre la monocapa.

Las interacciones celulares en la cámara reciben así un esfuerzo cortante similar al presente en la adhesión de leucocitos en capilares poscapilares. Los eventos de rodadura se capturan y enumeran utilizando elementos NIS y un ensayo para la independencia de E-selectina. Hola, soy George Weis en el laboratorio del Dr. Charles de Nitro en el Departamento de Dermatología del Hospital Brigman para Mujeres, Escuela de Medicina de Harvard.

Hoy les mostraremos un procedimiento para analizar el papel de la selectina E y de los ligandos de la selectina E en la adhesión de leucocitos humanos a células endoteliales de médula ósea humana bajo condiciones fisiológicas de flujo sanguíneo. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar el papel de las moléculas de la superficie celular que inician la adhesión de glóbulos blancos o de células cancerosas metastásicas a células endoteliales, que revisten la superficie interna de los vasos sanguíneos. Este evento adhesivo se caracteriza por un comportamiento de rodadura, similar a una bola de boliche desplazándose por una pista.

Así que comencemos. El primer paso en este procedimiento consiste en preparar las células endoteliales que recubrirán la cámara de flujo. Este protocolo utiliza células H-B-M-E-C 60 derivadas de médula ósea humana.

Los cultivos de microvasos deben recubrirse previamente con fibronectina; para ello, incubar placas de cultivo de tejidos de 35 mililitros con PBS que contenga 20 microgramos por mililitro de fibronectina. La incubación puede realizarse durante la noche a cuatro grados Celsius o durante tres horas a 37 grados Celsius. Suspender las células H-B-M-E-C 60 en medio 1 99 y sembrar a una densidad de 10 a la quinta células por placa; cultivar las células hasta alcanzar una confluencia superior al 90 %.

Esto tomará aproximadamente dos días para aumentar la expresión de e selectina; aspire el medio de crecimiento y agregue medio fresco con 50 nanogramos por mililitro de IL-1β e incube durante cuatro a seis horas. Las monocapas celulares ya están listas para el ensayo en la cámara de flujo. Placas adicionales de células H-B-M-E-C 60 pueden ser estimuladas con IL-1β y tratadas con un anticuerpo neutralizante anti-e selectina humana a 20 microgramos por mililitro durante una hora a 37 grados Celsius.

Esto servirá como control para la expresión funcional de la selectina E. A continuación, prepare los leucocitos positivos para la selectina E. Estas son las células KG1a, células progenitoras hematopoyéticas humanas.

Estas se cultivan en suspensión hasta alcanzar confluencia o aproximadamente seis células por mililitro en RPMI 1640. Las células KG1a pueden pipetearse directamente del cultivo y contarse en un hemocitómetro. Suspender nuevamente las células a 10⁶ células por mililitro en HBSS con tampón hep o HH de 10 milimolares que contenga cloruro de calcio de 2 milimolares.

Guarde las células en hielo hasta que se realice el ensayo. Los siguientes pasos implican preparar el microscopio, la cámara de flujo de placas paralelas y la bomba de jeringa. Para el ensayo, encienda el microscopio y la bomba de jeringa.

Seleccione el objetivo de 10 x en el microscopio. Coloque un tubo cónico de 50 mililitros en el soporte y llénelo con tampón HH con cloruro de calcio al dos milimolar. Luego coloque tubos de ensayo plásticos de cinco mililitros en el soporte inferior.

A continuación, coloque una jeringa de 60 mililitros en la bomba de jeringa. Asegúrese de que tanto el émbolo como el cuerpo de la jeringa estén firmes. Conecte una llave de paso de tres vías al extremo de la jeringa de 60 ml y luego una jeringa de 5 ml a la llave de paso de tres vías.

Coloque el aparato de cámara de flujo paralelo sobre la platina del microscopio con el tubo de entrada a la derecha, el tubo de salida a la izquierda y el tubo de vacío en la parte trasera. Después de conectar los tubos al vacío, abra la válvula de aire para permitir que el aparato de placas paralelas se adhiera a la platina. Esto comprobará si la falda de vacío de la cámara de flujo es hermética al aire.

Una vez confirmado el sello, cierre la válvula de aire. Ahora conecte la línea de tubo de salida a la llave de paso de tres vías que ya está conectada a la jeringa. El aparato ya está listo para colocarse sobre las células H-B-M-E-C 60.

Encienda el vacío y baje suavemente el aparato de la cámara de flujo sobre la placa, permitiendo que el aparato se fije por succión. No debe haber sonidos de escape de aire y, en este momento, puede ser necesario aplicar presión sobre la cámara para comprimir la junta de goma. Una vez establecido el vacío, coloque el tubo de entrada en el tubo cónico de 50 mililitros.

Abra la llave de paso de tres vías hacia la jeringa de 60 mil y coloque la bomba en modo de bombeo para eliminar el aire de las líneas sin levantar las células de la placa. Utilice la bomba de jeringa ajustada a dos mililitros por minuto para llenar el tubo de entrada. Luego, cambie rápidamente a 0,5 mililitros por minuto.

Poco antes de que el fluido alcance el aparato, es fundamental cebado el sistema cuidadosamente y evitar burbujas de aire, ya que estas levantarían la monocapa de la placa. Una vez que el fluido entra en la jeringa de 60 mil, la cámara de flujo y la bomba de jeringa están cebadas. Ahora, asegure la cámara de flujo al portaobjetos con un trozo de cinta sobre cada una de las líneas de entrada, salida y vacío.

Esto asegura que el campo de visión permanezca constante al visualizar y recopilar los datos. La cámara de flujo ya está lista para usarse. Estos pasos deben repetirse para cada corrida de entrada celular y para cada placa nueva.

Para capturar eventos de desplazamiento en el sitio Lucas, abra NIS Elements en el escritorio y presione el icono de reproducción para obtener una imagen en vivo. La exposición automática le permitirá ver la placa y enfocar la imagen. Asegúrese de que el microscopio esté enfocado correctamente sobre la monocapa celular ajustando manualmente el enfoque en el microscopio.

Una vez que la imagen esté enfocada, restablezca la exposición a un cuadro por segundo y ajuste la luz del microscopio. La imagen debería aparecer en la computadora y ya no debería ser visible a través del microscopio. Luego, se puede ajustar el histograma de luz para eliminar la exposición de fondo o mejorar la claridad celular; haga clic en bin 2x2 o bin en vivo para obtener una imagen ideal para la captura de video.

Haga clic en macro en la barra de menú y seleccione derecho al puerto, elija el puerto com tres y ábralo. Esto abre el puerto para coordinarse con la bomba de jeringa. Ahora la cámara de flujo está lista para ser infundida con células KG1a: pipetee un mililitro de la suspensión de KG1a en el tubo de ensayo de cinco mililitros cerca de la línea de entrada del tubo.

Luego coloque la línea de entrada en la parte inferior del tubo de ensayo. Vaya a la barra de menú y haga clic en captura y adquisición de lapsos de tiempo. Seleccione el protocolo que dura 210 segundos.

Esta es la duración del programa para el flujo sobre células H-B-M-E-C 60. Cada fase está programada para tomar una imagen cada segundo durante toda la duración del protocolo de la bomba. También está configurada para enviar un comando a través del puerto comm tres para iniciar la bomba.

Configure la bomba de jeringa en modo de programación, lo que permite la programación manual de caudales específicos. Esto determinará los niveles de estrés cortante dentro de la cámara y dictará las interacciones entre células KG1a sobre células H-B-M-E-C 60. Los parámetros para estas interacciones son 4,2 dinas por centímetro cuadrado durante 45 segundos.

Punto tres dinas por centímetro cuadrado durante 60 segundos y aumentos progresivos cada 15 segundos hasta un máximo de 4,2 dinas por centímetro cuadrado. El microscopio y la computadora ya están listos para capturar fotografía de lapso de tiempo. Presione iniciar ejecución en la computadora para comenzar la adquisición de datos mientras se ejecuta el programa.

Asegúrese de agregar medio al tubo que contiene las células KG una A para mantener los tubos de entrada y salida llenos de medio y evitar que entren burbujas de aire al sistema. Si se interrumpe el intervalo de tiempo, la bomba no se detendrá por sí sola y deberá reiniciarse. Presione cancelar para regresar a la imagen en vivo.

Una monocapa de células endoteliales no estimuladas sirve como control negativo para este experimento. Para ello, infunda leucocitos KG1a en la cámara de flujo sobre células HBMEC-60 no tratadas para controlar la independencia de la selectina E, estimule la monocapa de células endoteliales con IL-1β e infunda los leucocitos sobre estas células para controlar aún más la independencia del efecto. Trate las células HBMEC-60 con IL-1β y luego con un anticuerpo anti-selectina S humana.

Luego analice los eventos de rodadura de leucocitos sobre estas células. La rodadura celular no solo está determinada por la selectina S, sino también por los residuos de ácido siálico en la superficie de la célula leucocitaria. Para demostrar esto, digiera las células KG1a con 0,1 unidades por mililitro de neuraminidasa durante una hora a 37 grados Celsius.

Luego analice los eventos de rodadura sobre las células H-B-M-E-C 60 estimuladas. Las glicoproteínas en la superficie de los leucocitos también son importantes para el rodadura celular. Esto puede demostrarse tratando las células KG una A con 0,2 unidades por mil de bromelina durante una hora a 37 grados Celsius, y luego infundiéndolas en la cámara de flujo.

Después de adquirir la secuencia temporal, los datos están listos para el análisis. Guarde los datos, vaya a la pestaña de medición en la barra de menú y seleccione umbral definido. Mueva las barras para que las células deseadas se coloreen de rojo, seleccione todas las imágenes y luego haga clic en aceptar; ahora toda la secuencia de lapsos de tiempo debería modificarse con células rodantes visibles en rojo.

Vaya a medir y seleccione restricciones. Esto permite al usuario excluir objetos umbral que no representan células en rodadura. Estos son principalmente el fondo creado por la monocapa de H-B-M-E-C 60; seleccione el área e introduzca los valores mínimos y máximos, que son ideales para los leucocitos en rodadura.

Repita este paso para la alargamiento y circularidad. Seleccione medir y luego seleccione crear binario usando restricciones. Los mismos valores de restricción, que se establecieron en el paso anterior, se utilizarán ahora para optimizar el software de elementos NIS para reconocer leucocitos en rodadura sobre la monocapa de células endoteliales. Vuelva a medir, seleccione datos de campo y luego seleccione restablecer datos.

Cierre el menú, regrese a medir y seleccione el campo de escaneo, abra los datos del campo de medición y seleccione el número u objetos. Luego seleccione todos los campos y exporte los datos a Microsoft Excel. Finalmente, seleccione borrar datos.

Los elementos NIS ya están listos para recopilar más datos. Estos datos representativos muestran cómo las interacciones entre las células endoteliales y los leucocitos responden al esfuerzo cortante fisiológico, probando específicamente el papel del ligando adhesivo E-selectina.

Un rodaje robusto de leucocitos ocurre cuando las células endoteliales se preestimulan con IL-1β. Al comparar este resultado con el control no estimulado, es evidente que el rodaje celular depende de la estimulación con citocinas. Al tratar las células H-B-M-E-C 60 con IL-1β y luego con un anticuerpo anti-E-selectina humana, queda claro que el rodaje celular depende específicamente de la E-selectina.

Este ensayo también puede utilizarse para probar otros parámetros. Por ejemplo, cuando las células estimuladas se tratan previamente con sase o con brolin, los resultados son menos robustos. Estos datos destacan la importancia de los residuos de ácido sialico terminal, así como de las glucoproteínas de la superficie celular.

Para la actividad del ligando de la selectina S, acabamos de mostrarle cómo analizar las interacciones adhesivas mediadas por la selectina E entre leucocitos y células endoteliales bajo condiciones que imitan las fuerzas presentes en una vénula poscapilar, la región del sistema circulatorio donde los leucocitos abandonan la sangre e ingresan a los tejidos. Al realizar este procedimiento, es importante recordar utilizar el anticuerpo bloqueante apropiado o un control con tratamiento enzimático para validar la necesidad de la respectiva selectina y su ligando en este sistema de ensayo. Eso es todo.

Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.