5.11: Extracción de sangre II

1. sangrado de la vena facial en ratones

1. Equipo
   1. Colección de sangre es de una pesca libre en un tubo de sangre o un tubo de Eppendorf. En algunos casos, es deseable recoger la sangre directamente en tubos de hematocrito.
   2. Lancetas de vara de oro se seleccionará en función del tamaño apropiado para el animal según edad y sexo.
      1. Lancetas se seleccionan según el tamaño y edad de ratones como sigue:
         lanceta de 4mm: ratones de 3-4 semanas de edad (menos de 15 gramos de peso corporal)
         lanceta de 5mm: ratones femeninos menores de 10 semanas (menos de 20 gramos de peso corporal)
         lanceta de 5mm: ratones machos menores de 6 semanas (menos de 20 gramos de peso corporal)
         lanceta de 5mm: para colocar solo muestras (frotis)
         lanceta de 5.5mm: ratones hembra durante 10 semanas (más de 20 gramos de peso corporal)
         lanceta de 5.5mm: ratones machos durante 6 semanas (más de 20 gramos de peso corporal)
         lanceta de 5.5mm: muestras grandes
2. Sistema de seguridad para
   1. Ratones son asegurados mediante la técnica de scruffing.
   2. Es importante minimizar movimiento de lado a lado de la cabeza. Esto asegura la venopunción precisa y segura con la lanceta.
3. Retiro de la sangre
   1. La lanceta de tamaño adecuado se mantiene perpendicular a la superficie de la piel.
   2. El punto de punción es ligeramente inclinado, con la punta hacia la nariz.
   3. La lámina de la lanceta se utiliza mejor en posición vertical.
   4. Mientras el ratón, coloque el área aproximada de la vena facial por la medición de la longitud del ojo debajo del canto lateral y el ancho del ojo caudalmente.
   5. Con la punta de la lanceta, suavemente siento el punto en que termina la mandíbula.
   6. Para mayor precisión en pinchar el vaso, coloque el ratón en recumbency lateral.
   7. Perforar la piel en el hombro de la lanceta en ese momento. Esto se hace con una presión firme y no como lanzando un dardo.
   8. Al retirar la lanceta, sangre comenzará a fluir.
   9. Para ayudar al flujo sanguíneo, coloque el ratón con la cabeza más baja que el corazón.
   10. Recoger la sangre en el vaso de la colección deseada.
   11. Seque la presión del sitio y liberación de punción en el pescuezo para la hemostasia.

Figura 1. Sangrado de la vena facial en ratones.

2. submaxilar purga en los ratones: aunque muy similar a la técnica para el sangrado de la vena facial, hay variaciones en el equipo y las diferencias sutiles en este procedimiento de purga.

1. Equipo
   1. Colección de la sangre es de una pesca libre en un tubo de sangre o un tubo de Eppendorf. En algunos casos, es deseable recoger directamente en los tubos de hematocrito.
   2. agujas de calibre 18-22 se seleccionan según el tamaño adecuado para los animales según edad y sexo.
      1. Las agujas se seleccionan según el tamaño y edad de ratones como sigue:
         calibre 22: ratones de 3-4 semanas de edad (menos de 15 gramos de peso corporal)
         calibre 20: ratones femeninos menores de 10 semanas (menos de 20 gramos de peso corporal)
         calibre 20: ratones machos menores de 6 semanas (menos de 20 gramos de peso corporal)
         calibre 20: para colocar solo muestras (frotis)
         calibre 18: ratones hembra durante 10 semanas (más de 20 gramos de peso corporal)
         calibre 18: ratones machos durante 6 semanas (más de 20 gramos de peso corporal)
         calibre 18: muestras grandes
2. Sistema de seguridad para
   1. Ratones son asegurados mediante la técnica de scruffing.
   2. Es importante minimizar movimiento de lado a lado de la cabeza. Esto asegura la venopunción precisa y segura con la aguja.
3. Retiro de la sangre
   1. La aguja se mantiene perpendicular a la superficie de la piel.
   2. Mientras el ratón, coloque el área aproximada de la vena submaxilar por el punto donde una línea desde la esquina de la boca se cruza con una línea desde el ángulo lateral del ojo. Esto coincide con un hoyuelo pequeño, lampiño encontrado caudal a la esquina de la boca y ligeramente por debajo de la línea de la mandíbula.
   3. Para mayor precisión en pinchar el vaso, coloque el ratón en recumbency lateral.
   4. Perforar la piel con la punta de la aguja en ese punto. Esto se hace con una presión firme y no como lanzando un dardo.
   5. No se inserta la aguja más allá de la punta del bisel.
   6. Al retirar la aguja, sangre comenzará a fluir.
   7. Para ayudar al flujo sanguíneo, coloque el ratón con la cabeza más baja que el corazón.
   8. Recoger la sangre en el vaso de la colección deseada.
   9. Absorba hasta el sitio de punción y librar la presión sobre el pescuezo para la hemostasia.

Figura 2. Sangrado de la vena submaxilar en ratones.

3. safena purga

1. Equipo
   1. Conos de sujeción de plástico transparente y flexible se pueden utilizar el ratón o la rata. Para los ratones, tubos cónicos plásticos modificados mililitro 50 pueden utilizarse para sujeción. Para las ratas, modificado tubos de sujeción de plexiglás-con una ranura de ancho suficiente para extender la pierna trasera-puede ser utilizado.
   2. Cuando se utiliza el cono de plástico, se mide contra la longitud del cuerpo del animal, y se corta un agujero oval a nivel del muslo.
   3. Un tubo cónico puede modificarse para un ratón para este método de recolección de sangre por el corte del extremo del tubo para permitir que un agujero de respiración. Se corta una ranura desde el extremo de la tapa del tubo de 1/2 pulgada de ancho y 2 pulgadas de largo. Los bordes son cubiertos de cinta del paño o suavizados para la seguridad del animal.
   4. Un torniquete es manufacturado usando una jeringa de cc de 3 y una longitud de sutura no absorbible 2-0. ³
   5. Triple ungüento antibiótico o vaselina blanca se utiliza como una barrera a prueba de humedad en la piel.
   6. Una aguja de 22 calibre es el tamaño preferido para la punción venosa.
   7. Sangre se obtiene directamente en los tubos de hematocrito.
2. Sistema de seguridad para
   1. Conos de plástico flexibles
      1. El ratón o rata se coloca en el cono de nariz primero.
      2. El extremo del cono se dobla y cierra con una abrazadera pequeña carpeta para impedir que el animal sale del cono de retención.
      3. La pierna trasera se tira suavemente a través del oval abertura hasta la ingle.
   2. Tubo cónico para los ratones
      1. El ratón se coloca en el primer nariz de tubo.
      2. La pierna trasera es guiada suavemente en la ranura.
      3. El dedo medio se coloca sobre el extremo del tubo para evitar que el ratón sale del tubo.
      4. El dedo índice y el pulgar estabilizan la pata del ratón.
   3. Tubo de sujeción de plexiglás para las ratas
      1. La rata se coloca en el primer nariz de tubo.
      2. La pierna trasera es guiada suavemente en la ranura.
      3. El extremo del tubo se fija para evitar que la rata de copia de seguridad y salir del tubo.
      4. El dedo índice y el pulgar estabilizan la pata de la rata.
3. Retiro de la sangre
   1. El pelo se quita de la cara lateral de la pata desde el corvejón a la Babilla. Esto puede hacerse por punteo, afeitarse o usar una crema depilatoria.
   2. Después de quitar el pelo, una pequeña cantidad de ungüento se aplica y se extendió en una capa muy delgada sobre la zona sin pelo.
   3. El torniquete se aplica como ahora cranially posible y apretados.
   4. El buque safeno corriendo por la superficie externa de la pierna desde la rodilla hasta el tobillo comenzará a llenar y se convertirá en elevado y fácil de visualizar.
   5. La aguja se mantiene perpendicular a la superficie de la piel directamente sobre el vaso sanguíneo. Pinchar el vaso. Tenga cuidado de no insertar la aguja profundamente en la pierna, para evitar pinchar el músculo o hueso de golpear.
   6. La sangre se grano para arriba en la superficie de la pierna para la colección con el tubo de hematocrito.
   7. Una vez que se ha recogido la sangre, afloje el torniquete y aplique presión sobre la punción para la hemostasia.
   8. Una vez que el sangrado se ha detenido, quitar el animal de la restricción y volver a la jaula del hogar.

Figura 3. Sangrado de la vena safena en ratones.

4. femoral vena para las ratas

1. Equipo
   1. Sangre se recoge en un tubo de hematocrito.
   2. Ungüento antibiótico triple es necesario para crear una barrera entre el piel/del pelo y la gota de sangre.
   3. Una aguja de 22 calibre se utiliza para punzar la vena.
   4. Una recortadora de pelo pequeño, portable con aproximadamente 1" amplia hoja se utiliza para recortar el pelo de la pierna.
2. Sistema de seguridad para
   1. Las ratas están sujetos mediante un cono de sujeción plástico transparente, flexible.
   2. Los conos de plástico son medidos contra la longitud del cuerpo y un orificio oval a nivel del muslo. El cono se corta tales que la pierna trasera puede ser exteriorizada con acceso a la vena.
3. Retiro de la sangre
   1. Se afeita el pelo de la superficie interna de la pierna desde la ingle hasta la rodilla.
   2. Ungüento antibiótico triple se aplica en una capa delgada en el sitio de punción.
   3. La persona de alojamiento ocluye la vena y tiene la rata con la superficie interna de la pierna hacia al flebotomista.
   4. Usar la aguja para perforar la vena. La aguja se mantiene perpendicular a los vasos sanguíneos y la punción se realiza directamente en la vena.
   5. La punción se hace como cerca de la rodilla como sea posible, permitiendo para el muestreo adicional anterior el primer sitio de colección de sangre.
   6. El buque es superficial. Por lo tanto, la profundidad de la punción no debe ser más profunda que la longitud del bisel de la aguja.
   7. Para ayudar al flujo sanguíneo, coloque la rata con la pierna más baja que el corazón.
   8. Recoger la sangre en los tubos de hematocrito como granos en la superficie de la piel.
   9. Liberar la presión en la pierna y aplique presión sobre el sitio de punción para conseguir la hemostasia.

Figura 4. Sangrado de la vena femoral en ratas.

La recolección de sangre de ratones y ratas es necesaria para una amplia variedad de estudios científicos, y los investigadores han desarrollado diferentes métodos para lograr objetivos experimentales específicos.

En la primera entrega, discutimos la consideración general de la extracción de sangre y revisamos el sangrado ocular retroorbital, los cortes de cola y los rasguños, así como los métodos de recolección de sangre intracardíaca. Aquí, describiremos los procedimientos para la recolección de sangre de las venas faciales, submandibulares, safenas y femorales. Estos métodos son menos invasivos y no requieren anestesia, lo que los convierte en métodos de elección cuando el uso de anestésicos puede confundir los resultados de sangre u otros datos.

Comencemos con el procedimiento para obtener una muestra de sangre de una vena facial murina. En el ratón, hay una vena facial de fácil acceso que atraviesa la mejilla. Comience por elegir el equipo adecuado para el procedimiento. Básicamente, necesita un pequeño tubo de centrífuga para la extracción de sangre y una lanceta, que está disponible en diferentes tamaños. La selección de la lanceta correcta depende de la edad, el sexo y el peso corporal del animal y del tamaño de la muestra que se va a recolectar. Consulte el protocolo de texto para obtener más información sobre la selección de lancetas.

Comience el procedimiento sujetando al animal con la técnica de desaliñado. La sujeción adecuada minimiza el movimiento de lado a lado de la cabeza y ayuda a garantizar una venopunción precisa y segura con la lanceta. Si el agarre es demasiado apretado, el flujo sanguíneo puede restringirse, lo que resulta en una reducción del volumen recogido. Una vez que el animal está sujeto, localice el área aproximada de la vena facial midiendo la longitud del ojo por debajo del canto lateral y el ancho del ojo caudalmente. Con la punta de la lanceta, palpa suavemente el punto en el que termina la mandíbula. Para una mejor precisión en la perforación de la embarcación, es posible que desee colocar el mouse de lado.

Ahora, en el sitio de inserción, sostenga la lanceta perpendicular a la superficie de la piel con la punta ligeramente hacia la nariz. Esto es crítico, porque si la punta de la lanceta se dirige caudalmente, el canal auditivo se perforará causando sangrado de la oreja. Para perforar la vena, aplique un empuje firme y perfore la piel hasta el hombro de la lanceta. Al retirarla, la sangre comenzará a fluir. Para ayudar al flujo, coloque al animal con la cabeza más baja que el corazón. Para detener el sangrado, seque el sitio de la punción para lograr la hemostasia y evitar la pérdida excesiva de sangre. Por último, libere la presión sobre el pescuezo y devuelva al animal a su jaula. Tenga en cuenta que los volúmenes de recolección variarán, pero es imperativo NO exceder el volumen máximo para la recolección de sangre de supervivencia. Consulte el protocolo de texto del video Extracción de sangre One para obtener detalles sobre el volumen máximo recomendado de recolección. Las muestras en serie se pueden tomar alternando el lado utilizado. Ninguno de los dos lados debe usarse con más frecuencia que cada 5-7 días.

Ahora repasemos el método de sangrado de la vena submandibular. Aunque esto es muy similar a la técnica para el sangrado de las venas faciales, existen variaciones en el equipo y diferencias sutiles en el procedimiento de sangrado.

La vena submandibular corre a lo largo de la mandíbula inferior del ratón y converge con la vena facial en la vena yugular. En lugar de una lanceta, este método se realiza con agujas. Pero al igual que en las lancetas, la selección del calibre de la aguja depende de la edad, el sexo, el peso del animal y el tamaño de la muestra (consulte el protocolo de texto para obtener más detalles).

Para empezar, frote el pescuezo del animal de la misma manera que para el sangrado de las venas faciales para que haya un movimiento mínimo de la cabeza de lado a lado. Recuerde que un agarre demasiado apretado puede disminuir el volumen de la recolección de sangre. Mientras sujetas al ratón, imagina una línea desde la comisura de la boca a través de la cara y una línea desde el canto lateral del ojo. El punto de intersección de estas líneas es el área aproximada de la vena submandibular. Esto coincide con un pequeño hoyuelo sin pelo que se encuentra caudal a la comisura de la boca y ligeramente por debajo de la línea de la mandíbula.

Para una mayor precisión, coloque al animal en decúbito lateral (3.6.1). A continuación, sostenga la aguja perpendicular a la superficie de la piel e insértela con un empujón firme. NO inserte la aguja más allá de la punta biselada, ya que una profundidad de inserción mayor que esa puede provocar un traumatismo en los músculos, nervios y otros vasos que se encuentran en la cabeza, el cuello y la cavidad oral. Al retirar la aguja, la sangre comenzará a fluir. Al igual que para el sangrado de las venas faciales, coloque el ratón con la cabeza más baja que el corazón para ayudar con el flujo sanguíneo. Finalmente, seque el sitio de punción para lograr la hemostasia y libere la presión sobre el pescuezo para que el animal regrese a su jaula.

Ahora, aprendamos cómo recolectar sangre de la vena safena. Esta vena es un vaso superficial que corre dorsalmente y luego lateralmente a través de la articulación del tarso.

El equipo que necesita para este procedimiento incluye un dispositivo de restricción, que puede ser uno de plástico flexible para ratas o, para ratones, se puede usar un tubo cónico de plástico modificado de 50 mililitros. Tenga en cuenta que el extremo del tubo está cortado para permitir un orificio para respirar, y una ranura de media pulgada de ancho y 2 pulgadas de largo se corta desde el extremo de la tapa. Los bordes están cubiertos con cinta adhesiva para la seguridad del animal. Este procedimiento también requiere un torniquete, fabricado con una jeringa de 3 cc y una longitud de sutura no absorbible de 0 a 2, ungüento antibiótico triple con un hisopo, que se utilizará como una barrera a prueba de humedad entre la piel y la gota de sangre, un cortapelos, una aguja de calibre 22 para la venopunción y un tubo de hematocrito para la recolección de sangre.

Para sujetar a un ratón, colóquelo en el tubo, con la nariz primero. Luego, guíe suavemente la pata trasera hacia la ranura y estabilícela con el dedo índice y el pulgar. Posteriormente, afeitar el vello desde la cara lateral de la pierna desde el corvejón hasta la rodilla. A continuación, unta una capa muy fina de la pomada antibiótica triple en la zona sin pelo. A continuación, aplique el torniquete lo más cranealmente posible y apriételo. El vaso safeno que atraviesa la superficie externa desde la rodilla hasta el tobillo comenzará a llenarse y se elevará y será fácil de visualizar.

A continuación, sostenga una aguja de calibre 22 directamente sobre el vaso sanguíneo y perpendicular a la superficie de la piel. Y perforar el vaso, teniendo cuidado de no insertar la aguja demasiado profundamente y perforar el músculo o el hueso. La sangre se acumulará en la superficie de la pierna para recogerla en un tubo de hematocrito. Una vez que se haya recogido la sangre, afloje el torniquete y aplique presión sobre la punción para la hemostasia. Una vez que se haya detenido el sangrado, retire al animal de la sujeción y devuélvalo a su jaula. Los volúmenes recogidos con este método oscilan entre 10 y 150 ? L, dependiendo de la frecuencia de muestreo. Y la calidad de la muestra es variable, ya que puede contener productos de tejido. No se deben tomar más de 4 muestras de sangre en un período de 24 horas de la misma pierna.

Por último, aprenderemos cómo recolectar sangre de la vena femoral, que es otra opción para la recolección de sangre en una rata. La vena femoral corre por la cara medial de la pata trasera desde la ingle hasta la articulación de la rodilla antes de cruzar la rodilla y convertirse en la vena safena lateral, lo que la hace fácilmente accesible.

La ventaja de la hemorragia de la vena femoral es que se recoge más fácilmente un volumen mayor que el de la vena safena. La desventaja es que este procedimiento, en un animal consciente, requiere de dos personas. El equipo necesario para este procedimiento es similar al método de la vena safena, excepto que no requiere el torniquete, y el dispositivo de restricción preferible es un cono flexible. Para seleccionar el cono correcto, mídalo contra la longitud del cuerpo del animal y luego haga un corte de agujero ovalado a la altura del muslo.

Para sujetar al animal, colóquelo en el tubo, con la nariz primero. Luego, dobla el extremo del cono y ciérralo con una pequeña pinza de carpeta para evitar que el animal salga. Ahora tire de la pata trasera a través de la abertura ovalada para acceder a la vena femoral. No agarre con demasiada fuerza, ya que podría exacerbar la formación de hematomas. A continuación, afeita la superficie interna de la pierna desde la ingle hasta la rodilla y aplica una capa fina de ungüento antibiótico triple en la zona sin vello. Posteriormente, la persona que la sujeta debe ocluir la vena femoral y agarrar a la rata con la superficie interna de la pierna mirando hacia la persona que va a extraer sangre. Sosteniendo la aguja de calibre 22 perpendicular al vaso sanguíneo, perfore directamente la vena y recoja la sangre en tubos de hematocrito a medida que se acumula en la superficie de la piel. La punción debe ser lo más cerca posible de la rodilla para permitir la toma de muestras futuras anteriores a este sitio. Además, asegúrese de que la profundidad de la punción no sea más profunda que la longitud del bisel de la aguja. Para ayudar al flujo sanguíneo, coloque la rata con la pata más baja que el corazón. Finalmente, libere la presión sobre la pierna y aplique presión en el sitio de punción para lograr la hemostasia y evitar la pérdida excesiva de sangre. Tenga en cuenta que se puede recolectar una cantidad significativamente mayor de sangre con este procedimiento.

Después de discutir los conceptos básicos de las técnicas de recolección de sangre, revisemos algunos ejemplos de por qué estos procedimientos pueden ser útiles para la investigación científica

La sangre a menudo se analiza para confirmar la respuesta inmune durante el desarrollo de la vacuna. Aquí, los investigadores administraron una vacuna peptídica a animales que padecían cáncer de vejiga. A continuación, recogieron sangre a través de la vena submandibular y separaron el suero para detectar los niveles de diferentes citocinas, que sirven como indicadores de la eficacia de la vacuna.

La extracción de sangre también se realiza comúnmente para probar la eficacia de un tratamiento mediante el estudio de biomarcadores de la enfermedad humana, como los niveles de glucosa en la diabetes. Estos investigadores estaban interesados en probar la eficacia de una nueva terapia génica administrada a través de la vena de la cola en animales diabéticos. Después de la inyección, estos investigadores recolectaron sangre de la vena safena en varios puntos del tiempo para analizar el efecto de diferentes protocolos de tratamiento sobre el nivel de glucosa en sangre.

Por último, para algunos experimentos, es importante conocer el estado básico del animal, como los niveles de inflamación o estrés. En este ejemplo, se recolectó plasma sanguíneo de una rata antes y después de un evento estresante. Y como puede ver, el nivel de corticosterona, o la hormona del estrés, es más alto en los animales diez minutos después del evento estresante.

Acabas de ver la segunda entrega de JoVE sobre técnicas de extracción de sangre para ratones y ratas. Después de ver estos dos videos, debería tener una mejor comprensión de las consideraciones y procedimientos para la recolección de sangre de estos animales y cómo se utilizan en la investigación biomédica en la actualidad. Como siempre, ¡gracias por mirar!