Ensayo de inducción neural en el embrión de pollo

Este video demuestra los diferentes pasos del ensayo para la inducción neural en el embrión de pollo. Primero, el embrión huésped se extrae y se coloca en un nuevo cultivo; el embrión donante se extrae en solución salina y el nodo de Hensen se marca con un colorante fluorescente. El nodo de Hensen se extirpa del embrión donante y se trasplanta al embrión huésped.

El embrión huésped se cultiva durante 24 horas, se fija y se procesa para la fotooxidación bajo fluorescencia fey. Con dab. El embrión se procesa para hibridación in situ con un marcador neural.

Hola, soy Delphine del Laboratorio Fennell en el Centro de Medicina Genómica y Ambiental de la Universidad Texas A y M en Houston. Hoy les mostraremos un procedimiento para realizar ensayos de inducción neural en el embrión de mejilla. Utilizamos este procedimiento en el laboratorio para estudiar los efectos de los fármacos antiepilépticos sobre las propiedades inductoras neurales del nódulo de Hensen.

Así que comencemos. Para el ensayo de inducción neural, es necesario preparar los huevos. Estos huevos deben incubarse colocados de lado en una incubadora húmeda durante 13 horas hasta alcanzar la etapa tres más de Hamburger y Hamilton o HH tres más.

A continuación, prepare el embrión huésped utilizando el nuevo método de cultivo, que ha sido demostrado previamente. En JoVE, cubra la superficie del embrión huésped con 200 microlitros de solución salina. Esto facilitará posteriormente la transferencia y la posición del injerto donante.

Finalmente, cubra el ensamblaje con un plato de cultivo Falcon de 35 milímetros invertido. Para exponer el embrión donante, abra el huevo golpeando la cáscara con pinzas. Retire la parte superior de la cáscara y deséchela.

Retire el albúmina espesa con pinzas e incline la bolsa de yema con pinzas gruesas para que el embrión quede orientado hacia arriba. Después de retirar el albúmina, use tijeras finas para cortar un cuadrado de la bolsa de yema alrededor del embrión. Saque el embrión de la yema con una cuchara y colóquelo en un recipiente que contenga PBS.

A continuación, use pinzas para separar el embrión donante del vitelo y la zona lúcida. Una vez que se haya separado, transfiera el embrión donante a una placa con protector SIL que contenga PBS para etiquetar y trasplantar el injerto. Utilice un micropipeteador de microelectrodos para estirar micropipetas de capilar de vidrio de 50 microlitros bajo el microscopio.

Corte la punta de la micropipeta utilizando pinzas finas. Coloque la micropipeta en una placa de Petri forrada con una tira de arcilla de modelar. A continuación, prepare la solución de colorante, que se utilizará para marcar el injerto antes del trasplante.

Primero, prepare un stock de tinte ocular en un mililitro de etanol absoluto al 0,5 %. Este stock puede almacenarse a menos 20 grados Celsius en la oscuridad. Luego, en un bloque térmico ajustado a 45 grados Celsius, mezcle 10 microlitros del stock de tinte previamente calentado con 90 microlitros de sacarosa 0,3 molar. Esta temperatura es necesaria para evitar la precipitación del tinte y la formación de cristales insolubles.

Gire brevemente la solución en una minicentrífuga SPECT durante cinco a 10 segundos. La solución de DAI ya está lista para usar; sujete el embrión donante con alfileres para insectos en el fondo del recipiente cubierto, con el lado dorsal hacia arriba. Una vez asegurado el embrión, rellene hacia atrás la micropipeta con ojo D aplicando una presión suave.

Utilizando un conjunto de tubo aspirador. Aplique un pequeño bolo de dai al nódulo de Hensen. Repita y asegúrese de que todo el nódulo de Hensen esté marcado a continuación.

Utilizando una pipeta capilar microscópica o un cuchillo microdisector, corte el nodo de Hensen; el lado dorsal del nodo se puede distinguir del lado ventral porque forma un surco, mientras que el lado ventral del nodo es plano. Si es necesario, marque el lado dorsal del injerto con polvo de carmín. Esto asegurará que el injerto se coloque con la orientación dorsal-ventral adecuada.

Utilizando una pipeta Gilson de 10 microlitros, transfiera el injerto al embrión huésped mediante una pipeta de microcapilar. Acérquese con el injerto a la región de área lucida, zona de límite opaco, a nivel del nódulo de Hensen del embrión huésped. A continuación, utilice una pipeta de microcapilar o un bisturí microquirúrgico para realizar una pequeña incisión de 80 a 100 micrómetros en la zona.

Límite opaco del área de Lucita a nivel del nódulo de Hensen del embrión huésped. Utilizando una pipeta micropipeta capilar o un cuchillo microdesecante. Coloque el injerto de modo que el lado ventral quede orientado hacia usted y el extremo posterior esté paralelo a la región equivalente en el embrión huésped O. Una vez en posición, retire la solución salina del embrión huésped, asegurándose de que el injerto permanezca colocado en estrecha proximidad con el sitio del huésped, y procese el embrión huésped para un nuevo cultivo durante 18 a 22 horas, como se describió en nuestra presentación anterior.

Después de 24 horas de cultivo, se retira el embrión del incubador y se fija en un recipiente tipo puro. Se elimina el P-B-S-P-B-S y se reemplaza con paraformaldehído al 4%. A continuación, el embrión se fija durante 24 horas.

Deseche el fijador en un recipiente adecuado para residuos peligrosos y agregue PBS al recipiente de fijación. Retire las agujas para insectos con pinzas después de que las agujas hayan sido eliminadas. Utilice una pipeta Pasteur de extremo romo para transferir el embrión a un vial de centelleo que contenga PBS.

Lave el embrión dos veces con PBS durante cinco minutos cada vez y una vez con tampón twist durante cinco minutos después del lavado; transfiera el embrión a una portaobjetos de vidrio con cavidad que contenga 0,1 mililitros de tampón Tris. Reemplace la solución de Tris con 0,1 mililitro de solución DAB. Deseche la punta einor en un recipiente que contenga una solución de lejía.

Para descontaminar el DAB, coloque un cubreobjetos sobre la cavidad de la portaobjetos bajo el enfoque de fluorescencia de isotiocianato de fluoresceína FEI. El objetivo del microscopio sobre las células donantes del injerto aparecerá de color rojo fluorescente y expuesto a la fluorescencia FEI hasta que todas las células rojas fluorescentes se vuelvan marrones. Esto ocurre como resultado de la conversión fotoquímica del fluorocromo en cristales marrones insolubles mediante la exposición a la longitud de onda de excitación FEI.

4 88 nanómetros en presencia de dab. Este proceso tarda entre 20 minutos y dos horas. Tras completar la reacción de fotooxidación, retire la laminilla utilizando pinzas finas.

Transfiera el embrión a un vial de centelleo de 20 mililitros que contenga PBTW o PBS con Tween 20 al 0,1 %. Finalmente, desactive el DAB de la cubierta, la laminilla y la cavidad de vidrio. Incube en una solución de hipoclorito para procesar el embrión para su visualización.

Continúe con la hibridación in situ, incubando el embrión únicamente con la sonda marcada con DIG. A continuación, comience a fotografiar y a realizar cortes según se describe en JoVE Video dos. A continuación se muestra un ejemplo de un ensayo de inducción neural.

Inicialmente, el injerto se coloca en el límite entre el área lucita y el área alpaca del embrión huésped. Tanto el embrión donante como el huésped son de etapa tres más. Tras nueve horas en cultivo, el injerto comienza a diferenciarse e induce lo que parece ser una cabeza en miniatura en etapa ocho menos.

Después de 24 horas en cultivo, la inducción neural se completa tras la fijación. El embrión se procesa para la fotooxidación. Inicialmente, las células marcadas con el colorante del ojo donante se observan proliferadas, formando una miniatura de Noor, como se ve aquí en rojo.

Después de la fotooxidación, estas células aparecen marrones. Luego, el embrión se procesa mediante hibridación in situ en montaje completo para el marcador neural. O otx dos desarrollado en el laboratorio del Dr. Bonelli.

Se muestra que el injerto donante induce la expresión de OTX dos en tejido derivado del huésped. Acabamos de mostrarle cómo realizar un ensayo de inducción neural en el embrión de mejilla. Al realizar este procedimiento, es importante recordar eliminar todo el líquido en la zona que rodea el injerto tras el trasplante, utilizando una pipeta.

Esto garantizará que el injerto esté firmemente colocado y que no se mueva fuera del embrión huésped durante el cultivo. Eso es todo. Gracias. Que disfruten de la visualización y mucha suerte con sus experimentos.