5.10: Síntesis en fase sólida

1. carga de la resina

1. A un buque de síntesis de péptidos de 100mL, agregar 2-chlorotrityl resina del cloruro (CTC) (1,1 mmol/g, 0,360 g, 0.400 mmol). Añadir 20 mL DMF y permitir que se hinchan durante 30 min bajo N_2.
2. Escurrir los granos bajo vacío y añadir 10 mL DMF.
3. Añadir 500 mg Fmoc-Ala-OH (1.60 mmol) y 2.5 mL i -Pr₂EtN y mezcla de N₂ por 15 min.
4. Drene el disolvente al vacío y repetir la carga con Fmoc-Ala-OH durante 15 minutos.
5. Drene el disolvente al vacío y lavar los granos con 10 mL DMFunder N₂y drenaje al vacío 3 x.

2. la desprotección del grupo Fmoc

1. Agregar 10 mL 20% 4-methylpiperidine en DMF y revolver los granos bajo N₂ durante 15 minutos.
2. Drene el disolvente al vacío y repita la desprotección.
3. Lavar los granos con 10 mL DMF bajo N₂ y drenaje al vacío 3 x.

3. realizar la prueba de Kaiser

1. Realizar la prueba de Kaiser añadiendo 1-2 gotas de solución A (0,5 mL 0,01 M de KCN, piridina 24,5 mL), solución B (1 g ninhidrina, 20 mL n-butanol) y la solución C (20 g fenol, 10 mL n-butanol) cada uno en dos tubos de ensayo. Un tubo de ensayo será el control mientras que el otro controlará la reacción.
2. Añadir unos granos de la resina del recipiente de reacción para tubo de ensayo de reacción y calienta los dos tubos de ensayo a 110 ° C.
3. Si la desprotección es completa, el contenido de la probeta convertirá un color azul/púrpura oscuro. Si la desprotección es incompleto o fallido, la solución seguirá siendo amarillo. Comparar el tubo de ensayo de reacción con el tubo de ensayo de control.

4. acoplamiento de los bloques de construcción de la siguiente

1. Drene el disolvente al vacío.
2. Lavar los granos con 10 mL de N-metil-2-pirrolidona en N₂ y drenaje el disolvente al vacío.
3. Para comenzar el siguiente acoplamiento, añadir 10 mL NMP, 620 mgFmoc-Phe-OH (1,6 mmol), 610 mg HBTU (1,6 mmol) y 2.5 mLi -Pr₂EtN y permitir que la resina a burbujear bajo N₂ durante 30 minutos.
4. Drene el disolvente al vacío.
5. Lavar los granos con 10 mL DMF bajo N₂ y drenaje al vacío 3 x.
6. Realizar el Kaiser prueba (ver pasos 3.1-3.3) para buscar la terminación del acoplamiento. La solución en el tubo de ensayo y los granos deben ser amarillo.

5. hendiendo el péptido de la resina

1. Hender el restante grupo Fmoc pasos 2.1-2.3.
2. Después de que el solvente se escurre bajo vacío, añadir 40 mL de solución de escote (95% TFA, 2.5% H₂O, consejos de 2,5%) a la resina y burbujas bajo N₂ 3 h.
3. Coloque un nuevo recipiente en el sintetizador de péptidos y drenar la solución de theTFA que contiene el péptido deseado bajo vacío en el matraz nuevo.

6. precipitación y I solation del péptido

1. Separar la solución TFA en 4 frascos cónicos y añadir 25 mL de éter de frío (° C −20) a cada vial para precipitar el péptido.
2. Los frascos de la centrífuga (3.000 rpm, 0-4 ° C) durante 20 min, decantar la solución restante de TFA y éter Frascos cónicos y concentrar el precipitado del péptido para permitirse el dipéptido deseado como un sólido blanco.

Añadir 20 mL de dimetilformamida a la resina y dejar los granos de la resina se hinche durante 30 min bajo un flujo de nitrógeno gas. Luego, aplicar vacío para drenar el solvente.

Añadir 10 mL de DMF, 1,6 mmol de un aminoácido protegido de Fmoc y 2,5 mL de N, N -diisopropylethylamine al recipiente. Burbujas en el gas de nitrógeno, que se mezcla la solución, durante 15 min cargar el aminoácido protegido en la resina.

Eliminar el disolvente al vacío y realizar una segunda carga. Después de retirar el disolvente, agitar los granos de resina cargado tres veces en porciones de 10 mL de DMF, drenando cada lavado en el matraz receptor.

A continuación, añadir a los granos de carga 10 mL de una solución al 20% de 4-methylpiperidine en DMF. La burbuja de la mezcla durante 15 minutos quitar el grupo Fmoc.

Drene el disolvente y repetir la operación de desprotección. Lave y escurra la resina cargada tres veces, como antes. Almacenar los granos bajo solvente hasta que están listos para el siguiente paso.

Para verificar que el compuesto cargado fue deprotected totalmente, el primer lugar 1 a 2 gotas de cada solución de ensayo Kaiser en dos tubos de ensayo.

Colocar unos granos cargados en un tubo de ensayo y calentar los tubos a 110 grados en baño de aceite. Desprotección es completa si la mezcla de resina se vuelve oscura azul a púrpura, que indica la presencia de grupos amino en la mezcla.

La síntesis en fase sólida es un método en el que el producto se sintetiza mientras está unido a un material insoluble.

La síntesis en fase sólida se utiliza a menudo para producir oligómeros biológicos y polímeros como péptidos, ácidos nucleicos y oligosacáridos. Estas moléculas están compuestas por cadenas de subunidades moleculares más pequeñas, llamadas monómeros. La síntesis de un oligómero o polímero requiere muchos pasos, ya que los monómeros deben agregarse en el orden correcto.

Un problema con las síntesis de varios pasos es que la purificación y el aislamiento de los productos estables de cada paso, llamados productos intermedios, disminuyen el rendimiento general. En la síntesis en fase sólida, el producto intermedio permanece unido al soporte sólido durante toda la síntesis. Esto permite lavar los reactivos, solventes y subproductos de la fase de solución, eliminando la necesidad de purificar y aislar cada producto intermedio entre pasos.

Este video ilustrará el procedimiento para la síntesis de péptidos en fase sólida e introducirá algunas aplicaciones de la síntesis en fase sólida en química.

En la síntesis en fase sólida, una molécula se sintetiza sobre un soporte sólido en una secuencia de reacciones. Por ejemplo, un oligómero o polímero se sintetizará un monómero a la vez para formar el producto final. El oligómero o polímero en crecimiento permanece fuertemente unido al soporte sólido hasta que se separa, o se escinde, del soporte con reactivos.

Cada monómero debe tener al menos dos sitios de unión para ser parte de la cadena polimérica, pero solo puede haber un sitio de unión disponible a la vez para garantizar que el monómero se una al átomo correcto. Esto se logra con grupos protectores, que son grupos funcionales que no son reactivos durante uno o más pasos de la síntesis. El sitio de unión se restaura, o desprotege, mediante el tratamiento de la molécula con reactivos específicos para convertir el grupo protector en un grupo funcional reactivo.

Para comenzar la síntesis en fase sólida, el material de partida se une a una resina especialmente diseñada o a un polímero insoluble en su único sitio de unión disponible. A continuación, el material de partida unido se desprotege para permitir la unión del segundo monómero de la cadena. A continuación, se añade una solución del segundo monómero de la cadena, junto con un agente de acoplamiento para facilitar la unión entre los monómeros.

Una vez que el segundo monómero se une al material de partida, el producto intermedio dimérico resultante se desprotege. Este proceso se repite hasta que se haya formado el oligómero o polímero objetivo. El producto se escinde del soporte sólido en una solución, a partir de la cual se puede purificar, aislar y analizar.

La síntesis en fase sólida se utiliza a menudo para la síntesis de péptidos, que son cadenas de aminoácidos. Los aminoácidos tienen un grupo amina, un grupo carboxilo y un sustituyente o "cadena lateral". La amina se protege inicialmente. Una vez desprotegida, la amina forma un enlace peptídico con el grupo carboxilo del siguiente aminoácido.

Ahora que comprende los principios de la síntesis en fase sólida, repasemos un procedimiento para la síntesis de péptidos en fase sólida, en el que demostraremos la adición de los dos primeros aminoácidos.

Para comenzar el procedimiento, conecte un matraz receptor de residuos a un recipiente de síntesis manual de péptidos de 100 ml. A continuación, coloque 0,360 g de resina de cloruro de 2-clorotritilo en el recipiente. Conecte una línea de gas nitrógeno al brazo lateral del recipiente y una línea de vacío al adaptador de manguera dentada.

Agregue 20 mL de dimetilformamida a la resina y deje que las perlas de resina se hinchen durante 30 minutos bajo un flujo de gas nitrógeno. Luego, aplique vacío para drenar el solvente.

Agregue 10 mL de DMF, 1.6 mmol de un aminoácido protegido con Fmoc y 2.5 mL de N,N-diisopropiletilamina al recipiente. Burbujea bajo el gas nitrógeno, que mezcla la solución, durante 15 minutos para cargar el aminoácido protegido en la resina.

Retire el disolvente al vacío y realice una segunda carga. Después de retirar el disolvente, agite las perlas de resina cargadas tres veces en porciones de 10 ml de DMF, escurriendo cada lavado en el matraz receptor.

A continuación, agregue a las perlas cargadas 10 mL de una solución al 20% de 4-metilpiperidina en DMF. Burbujee la mezcla durante 15 minutos para eliminar el grupo FMOC.

Drene el disolvente y repita el procedimiento de desprotección. Lava y escurre la resina cargada tres veces, como antes. Guarde las perlas bajo solvente hasta que estén listas para el siguiente paso.

Para verificar que el compuesto cargado estaba completamente desprotegido, primero coloque 1 o 2 gotas de cada solución de prueba de Kaiser en dos tubos de ensayo.

Coloque algunas perlas cargadas en un tubo de ensayo y caliente ambos tubos a 110 grados en un baño de aceite. La desprotección es completa si la mezcla de resina se vuelve de azul oscuro a púrpura, lo que indica la presencia de grupos aminas en la mezcla.

Para comenzar el paso de acoplamiento, primero lave las perlas con 10 mL de NMP bajo un flujo de gas N2.

A continuación, añada 10 mL de NMP, 1,6 mmol del siguiente aminoácido protegido con Fmoc, 1,6 mmol del agente de acoplamiento HBTU y 2,5 mL de DIPEA a la resina cargada.

Burbujea el gas N2 a través de la mezcla de resina durante 30 minutos y luego escurre el solvente. Lave y escurra las perlas con porciones de 10 ml de DMF tres veces, como antes.

Repita la prueba de Kaiser. El acoplamiento se ha producido con éxito si las perlas y la solución se vuelven amarillas, lo que indica que no hay grupos amina presentes.

A continuación, escinda el nuevo grupo Fmoc con un 20% de 4-metilpiperidina en DMF y lave las perlas con porciones de 10 ml de DMF. Repita el acoplamiento y la desprotección para cada aminoácido restante en el péptido objetivo.

Una vez que se haya desprotegido el último aminoácido y se hayan lavado las perlas de resina, agregue 40 ml de solución de escisión de péptidos para separar el producto peptídico de la resina.

Burbujee el gas nitrógeno a través de la mezcla de resina durante 3 h y luego reemplace el matraz receptor. Transfiera la solución de la mezcla de resina al nuevo matraz receptor al vacío.

Para generar el producto final, elimine el solvente con un evaporador rotativo.

La síntesis en fase sólida es ampliamente utilizada en biología y química. Veamos algunos ejemplos.

La síntesis en fase sólida abrió muchas nuevas vías sintéticas a los oligosacáridos, que son cadenas cortas de monómeros de azúcar simples con importantes funciones biológicas, como el almacenamiento de energía. A diferencia de los enlaces peptídicos, cada enlace entre azúcares contiene un estereocentro. Para sintetizar un oligosacárido, no solo los monómeros deben estar en el orden correcto, sino que los enlaces también deben tener la estereoquímica correcta. Se desarrollaron técnicas de síntesis en fase sólida para acoplar cada monómero mediante un proceso altamente estereoselectivo, que hoy en día está lo suficientemente refinado como para ser automatizado.

La síntesis en fase sólida es un enfoque común de la química combinatoria, que es la práctica de sintetizar muchas variantes de un compuesto en un solo proceso sintético. La resina cargada se puede dividir fácilmente en porciones para reaccionar con diferentes monómeros o moléculas. Después de cada reacción, las porciones se lavan y se vuelven a combinar. Esto se repite hasta que se haya generado el número deseado de productos. Esta técnica es particularmente útil en la investigación farmacéutica, ya que se puede utilizar para generar nuevos compuestos o para evaluar la reactividad de un compuesto con una amplia gama de moléculas.

Acabas de ver la introducción de JoVE a la síntesis en fase sólida. Ahora debe comprender los principios subyacentes de la síntesis en fase sólida, el procedimiento para la síntesis de péptidos en fase sólida y algunos ejemplos de cómo se usa la síntesis en fase sólida en química orgánica. ¡Gracias por mirar!