Síntesis en fase sólida

Solid Phase Synthesis

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Organic Chemistry II

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Solid Phase Synthesis

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09:42 min

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February 22, 2017

Overview

Fuente: Vy M. Dong y Diane Le, Departamento de química, Universidad de California, Irvine, CA

Síntesis en fase sólida de Merrifield es un premio Nobel ganador invención donde una molécula de reactivo está limitada en un soporte sólido y somete a sucesivas reacciones químicas para formar un compuesto deseado. Cuando las moléculas están limitadas a un soporte sólido, derivados y reactivos exceso pueden eliminarse lavando las impurezas, mientras que el compuesto objetivo sigue siendo límite a la resina. Específicamente, se muestra un ejemplo de síntesis de péptidos de fase sólida (SPPS) para demostrar este concepto.

Principles

Síntesis en fase sólida es un método utilizado para optimizar la síntesis de moléculas. Es de uso frecuente en química combinatoria (una técnica que se utiliza para preparar un gran número de moléculas en un corto periodo de tiempo) generar bibliotecas de compuestos debido a la facilidad de purificación y síntesis química general. Síntesis en fase sólida implica típicamente el uso de una resina; un material no soluble, a base de polímero, que es pre-functionalized para el blockcan inicial del edificio se unen fácilmente. Los bloques están generalmente protegidos una vez que se agregan a la resina, y puede ser fácilmente deprotected y tratados con el siguiente bloque de edificio deseado en solución (figura 1). Una vez que ha sido sintetizada la molécula deseada, puede fácilmente ser troceado de la resina.

Porque es robusto, síntesis en fase sólida se ha utilizado para sintetizar ácidos nucleicos, oligosacáridos y por lo general, los péptidos. Descubierto y reportado por Robert Bruce Merrifield en 1963, SPPS se ha convertido en el método más utilizado para generar bibliotecas de péptidos. Merrifield ganó el 1984 Premio Nobel por la invención de SPPS. SPPS pueden fácilmente tomar ventaja de Fmoc (base sensible) o Boc (ácido sensible)N-protección de los grupos de los aminoácidos para construir bibliotecas de péptidos en un corto período de tiempo. HBTU (agente de acoplamiento) y i-Pr₂EtN (base) activarán el C-terminal del aminoácido para el acoplamiento con otro aminoácido. Protección de los grupos de Fmoc puede quitarse 4-methylpiperidine, mientras Boc protección de los grupos puede ser eliminado por los ácidos fuertes como el ácido trifluoroacético. En este experimento demostramos SPPS a través de la síntesis de un dipéptido. Utilizamos la prueba de Kaiser, un método cualitativo para detectar la presencia de aminas primarias, para supervisar el progreso de la reacción.

Figura 1. Concepto detrás de la síntesis de péptidos de fase sólida (SPPS).

Procedure

1. carga de la resina

A un buque de síntesis de péptidos de 100mL, agregar 2-chlorotrityl resina del cloruro (CTC) (1,1 mmol/g, 0,360 g, 0.400 mmol). Añadir 20 mL DMF y permitir que se hinchan durante 30 min bajo N_2.
Escurrir los granos bajo vacío y añadir 10 mL DMF.
Añadir 500 mg Fmoc-Ala-OH (1.60 mmol) y 2.5 mL i –Pr₂EtN y mezcla de N₂ por 15 min.
Drene el disolvente al vacío y repetir la carga con Fmoc-Ala-OH durante 15 minutos.
Drene el disolvente al vacío y lavar los granos con 10 mL DMFunder N₂y drenaje al vacío 3 x.

2. la desprotección del grupo Fmoc

Agregar 10 mL 20% 4-methylpiperidine en DMF y revolver los granos bajo N₂ durante 15 minutos.
Drene el disolvente al vacío y repita la desprotección.
Lavar los granos con 10 mL DMF bajo N₂ y drenaje al vacío 3 x.

3. realizar la prueba de Kaiser

Realizar la prueba de Kaiser añadiendo 1-2 gotas de solución A (0,5 mL 0,01 M de KCN, piridina 24,5 mL), solución B (1 g ninhidrina, 20 mL n-butanol) y la solución C (20 g fenol, 10 mL n-butanol) cada uno en dos tubos de ensayo. Un tubo de ensayo será el control mientras que el otro controlará la reacción.
Añadir unos granos de la resina del recipiente de reacción para tubo de ensayo de reacción y calienta los dos tubos de ensayo a 110 ° C.
Si la desprotección es completa, el contenido de la probeta convertirá un color azul/púrpura oscuro. Si la desprotección es incompleto o fallido, la solución seguirá siendo amarillo. Comparar el tubo de ensayo de reacción con el tubo de ensayo de control.

4. acoplamiento de los bloques de construcción de la siguiente

Drene el disolvente al vacío.
Lavar los granos con 10 mL de N-metil-2-pirrolidona en N₂ y drenaje el disolvente al vacío.
Para comenzar el siguiente acoplamiento, añadir 10 mL NMP, 620 mgFmoc-Phe-OH (1,6 mmol), 610 mg HBTU (1,6 mmol) y 2.5 mLi –Pr₂EtN y permitir que la resina a burbujear bajo N₂ durante 30 minutos.
Drene el disolvente al vacío.
Lavar los granos con 10 mL DMF bajo N₂ y drenaje al vacío 3 x.
Realizar el Kaiser prueba (ver pasos 3.1-3.3) para buscar la terminación del acoplamiento. La solución en el tubo de ensayo y los granos deben ser amarillo.

5. hendiendo el péptido de la resina

Hender el restante grupo Fmoc pasos 2.1-2.3.
Después de que el solvente se escurre bajo vacío, añadir 40 mL de solución de escote (95% TFA, 2.5% H₂O, consejos de 2,5%) a la resina y burbujas bajo N₂ 3 h.
Coloque un nuevo recipiente en el sintetizador de péptidos y drenar la solución de theTFA que contiene el péptido deseado bajo vacío en el matraz nuevo.

6. precipitación y I solation del péptido

Separar la solución TFA en 4 frascos cónicos y añadir 25 mL de éter de frío (° C −20) a cada vial para precipitar el péptido.
Los frascos de la centrífuga (3.000 rpm, 0-4 ° C) durante 20 min, decantar la solución restante de TFA y éter Frascos cónicos y concentrar el precipitado del péptido para permitirse el dipéptido deseado como un sólido blanco.

Síntesis en fase sólida es un método en el cual se sintetiza el producto mientras se limite a un material insoluble.

Síntesis en fase sólida se utilizan a menudo para producir biológicos oligómeros y polímeros como oligosacáridos, péptidos y ácidos nucleicos. Estas moléculas se componen de cadenas más pequeñas subunidades moleculares, llamados monómeros. Sintetizar un oligómero o polímero lleva muchos pasos, como los monomers se deben agregar en el orden correcto.

Un problema con varios pasos de síntesis es purificación y aislamiento de los productos estables de cada paso, llamado productos intermedios, disminuye el rendimiento general. En síntesis en fase sólida, el producto intermedio sigue siendo límite al apoyo sólido a lo largo de la síntesis. Esto permite fase de solución reactivos, disolventes y subproductos a ser arrastrados, eliminando la necesidad de purificar y aislar cada producto intermedio entre pasos.

Este video se ilustran el procedimiento de síntesis peptídica en fase sólida y presentar algunas aplicaciones de la síntesis de fase sólida en química.

En síntesis en fase sólida, una molécula se sintetiza sobre un soporte sólido en una secuencia de reacciones. Por ejemplo, un oligómero o polímero será sintetizado un monómero a la vez para formar el producto final. La creciente oligómero o polímero permanece fuertemente enlazado a la sólida hasta que se separa, o troceados, desde el apoyo con reactivos.

Cada monómero debe tener al menos dos sitios de Unión para formar parte de la cadena del polímero, pero solamente un enlace puede estar disponible en un momento para asegurarse de que el monómero se une al átomo de correcto. Esto se consigue con la protección de los grupos, que son grupos funcionales que no son reactivos durante uno o más pasos de la síntesis. El sitio de Unión es restablecido, o deprotected, por el tratamiento de la molécula con reactivos específicos para convertir la protección del grupo a un grupo funcional reactivo.

Para iniciar la síntesis en fase sólida, el material de partida está limitado a una resina especialmente diseñada o un polímero insoluble en su sitio de Unión sólo está disponible. Luego, el material partido encuadernado es deprotected para permitir el enlace del segundo monómero en la cadena. A continuación, se agrega una solución del monómero segundo en la cadena, junto con un agente de acoplamiento para facilitar la unión entre los monómeros.

Una vez que el segundo monómero se une a la materia prima, producto intermedio resultante dimérico es deprotected. Este proceso se repite hasta que el oligómero de destino o polímero ha formado. El producto es dividido de apoyo sólido en la solución, que puede ser purificada, aislada y analizado.

Síntesis en fase sólida es de uso frecuente para la síntesis de péptidos, que son cadenas de aminoácidos. Los aminoácidos tienen un grupo amino, un grupo carboxilo y un sustituto o “cadena lateral”. La amina inicialmente está protegida. Una vez deprotected, la amina forma un enlace peptídico con el grupo carboxilo del siguiente aminoácido.

Ahora que usted entiende los principios de la síntesis de fase sólida, vamos a ir a través de un procedimiento de síntesis de péptidos de fase sólida, en la que demostramos la adición de los dos primeros aminoácidos.

Para comenzar el procedimiento, conecte un recipiente para residuos a un buque de la síntesis de péptidos manual 100 mL. Luego coloque 0,360 g de resina de cloruro de 2-chlorotrityl en el recipiente.

Conecte una línea de gas de nitrógeno a la nave de la mano y una línea de vacío al adaptador de manguera serrada.

Añadir 20 mL de dimetilformamida a la resina y dejar los granos de la resina se hinche durante 30 min bajo un flujo de nitrógeno gas. Luego, aplicar vacío para drenar el solvente.

Añadir 10 mL de DMF, 1,6 mmol de un aminoácido protegido de Fmoc y 2,5 mL de N, N –diisopropylethylamine al recipiente. Burbujas en el gas de nitrógeno, que se mezcla la solución, durante 15 min cargar el aminoácido protegido en la resina.

Eliminar el disolvente al vacío y realizar una segunda carga. Después de retirar el disolvente, agitar los granos de resina cargado tres veces en porciones de 10 mL de DMF, drenando cada lavado en el matraz receptor.

A continuación, añadir a los granos de carga 10 mL de una solución al 20% de 4-methylpiperidine en DMF. La burbuja de la mezcla durante 15 minutos quitar el grupo Fmoc.

Drene el disolvente y repetir la operación de desprotección. Lave y escurra la resina cargada tres veces, como antes. Almacenar los granos bajo solvente hasta que están listos para el siguiente paso.

Para verificar que el compuesto cargado fue deprotected totalmente, el primer lugar 1 a 2 gotas de cada solución de ensayo Kaiser en dos tubos de ensayo.

Colocar unos granos cargados en un tubo de ensayo y calentar los tubos a 110 grados en baño de aceite. Desprotección es completa si la mezcla de resina se vuelve oscura azul a púrpura, que indica la presencia de grupos amino en la mezcla.

Para comenzar la etapa de acoplamiento, primero lave los granos con 10 mL de NMP bajo un flujo de N2 gas.

A continuación, añadir 10 mL de NMP, 1,6 mmol del siguiente aminoácido protegido de Fmoc, 1,6 mmol del agente de acoplamiento HBTU y 2,5 mL de DIPEA a la resina cargada.

Burbuja de gas N2 a través de la mezcla de resina durante 30 minutos y luego drenar el solvente. Lavar y escurrir los granos con porciones de 10 mL de DMF tres veces, como antes.

Repita la prueba de Kaiser. Acoplamiento se ha producido con éxito si la solución y granos vuelven amarillos, indicando que no hay grupos de Amina.

A continuación, unirse al nuevo grupo Fmoc con 20% 4-methylpiperidine en DMF y lavar los granos con porciones de 10 mL de DMF. Repita el acoplamiento y desprotección para cada resto aminoácido en el péptido de destino.

Después del último aminoácido ha sido deprotected y los granos de resina hayan sido lavadas, añadir 40 mL de solución de clivaje de péptidos para separar el producto del péptido de la resina.

Burbuja de gas nitrógeno a través de la mezcla de resina de 3 h y vuelva a colocar el recipiente. Transferir la solución de la mezcla de resina en el nuevo recipiente al vacío.

Para generar el producto final, eliminar el disolvente con un evaporador rotatorio.

Síntesis en fase sólida es ampliamente utilizado en biología y química. Echemos un vistazo a algunos ejemplos.

Síntesis en fase sólida había abierto muchos nuevos caminos sintéticos a oligosacáridos, que son cadenas cortas de monómeros de azúcar simple con importantes funciones biológicas, tales como almacenamiento de energía. A diferencia de los enlaces peptídicos, cada enlace entre azúcares contiene un stereocenter. Para sintetizar un oligosacárido, no sólo los monómeros se debe en el orden correcto, pero los bonos deben tener también la estereoquímica correcta. Se desarrollaron técnicas de síntesis en fase sólida para acoplar cada monómero mediante un proceso altamente estereoselectiva, que hoy en día es lo suficientemente refinado para ser automatizado.

Síntesis en fase sólida es un enfoque común a la química combinatoria, que es la práctica de la síntesis de muchas variantes de un compuesto en un solo proceso sintético. La resina cargada se puede dividir fácilmente en porciones para reaccionar con diferentes monómeros o moléculas. Después de cada reacción, las porciones son lavadas y recombinadas. Esto se repite hasta el número deseado de productos se ha generado. Esta técnica es particularmente útil en la investigación farmacéutica, como se puede utilizar para generar nuevos compuestos o para evaluar la reactividad de un compuesto con una gran variedad de moléculas.

Sólo ha visto la introducción de Zeus para síntesis en fase sólida. Ahora debe entender los principios subyacentes de la síntesis en fase sólida, el procedimiento de síntesis peptídica en fase sólida y algunos ejemplos de cómo sólida fase de síntesis se utiliza en química orgánica. ¡Gracias por ver!

Results

Resultados representativos para la fase sólida péptido synthesisfor procedimiento 3.

Procedimiento paso	Color de la solución
3.1	Control – claro, amarillo claro Reacción – claro, amarillo claro
3.2	Control – claro, amarillo claro Reacción – azul oscuro
3.3	Solución azul oscuro, azules – los granos completa desprotección o acoplamiento de error Incoloros, granos amarillos – desprotección fracasado o completar completo Solución descolorida, granos rojos – incompleta desprotección acoplador o incompleta

Tabla 1. Representante da para Procedure 3.

Applications and Summary

En este experimento, hemos demostrado un ejemplo de síntesis en fase sólida mediante SPPS a través de la síntesis de un dipéptido.

Síntesis en fase sólida es ampliamente utilizado en química combinatoria para construir bibliotecas de compuestos para la detección rápida. Se ha utilizado comúnmente para sintetizar péptidos, oligosacáridos y ácidos nucleicos. Por otra parte, este concepto se ha aplicado en síntesis química. Porque es heterogénea, estos reactivos de apoyo sólido a menudo pueden ser reciclados y reutilizados en posteriores reacciones.

Transcript

Solid phase synthesis is a method in which the product is synthesized while bound to an insoluble material.

Solid phase synthesis is often used to produce biological oligomers and polymers such as peptides, nucleic acids, and oligosaccharides. These molecules are composed of chains of smaller molecular subunits, called monomers. Synthesizing an oligomer or polymer takes many steps, as the monomers must be added in the correct order.

An issue with multi-step syntheses is that purification and isolation of the stable products of each step, called intermediate products, decreases the overall yield. In solid phase synthesis, the intermediate product remains bound to the solid support throughout synthesis. This allows solution-phase reagents, solvents, and byproducts to be washed away, eliminating the need to purify and isolate each intermediate product between steps.

This video will illustrate the procedure for solid phase peptide synthesis and introduce a few applications of solid phase synthesis in chemistry.

In solid-phase synthesis, a molecule is synthesized on a solid support in a sequence of reactions. For instance, an oligomer or polymer will be synthesized one monomer at a time to form the final product. The growing oligomer or polymer remains strongly bound to the solid support until it is separated, or cleaved, from the support with reagents.

Each monomer must have at least two binding sites to be part of the polymer chain, but only one binding site can be available at a time to ensure that the monomer binds to the correct atom. This is achieved with protecting groups, which are functional groups that are not reactive during one or more steps of the synthesis. The binding site is restored, or deprotected, by treating the molecule with specific reagents to convert the protecting group to a reactive functional group.

To begin solid-phase synthesis, the starting material is bound to a specially designed resin or insoluble polymer at its only available binding site. Then, the bound starting material is deprotected to allow binding of the second monomer in the chain. Next, a solution of the second monomer in the chain is added, along with a coupling agent to facilitate bonding between the monomers.

Once the second monomer binds to the starting material, the resulting dimeric intermediate product is deprotected. This process is repeated until the target oligomer or polymer has formed. The product is cleaved from the solid support into solution, from which it can be purified, isolated, and analyzed.

Solid phase synthesis is often used for the synthesis of peptides, which are chains of amino acids. Amino acids have an amine group, a carboxyl group, and a substituent, or ‘side chain’. The amine is initially protected. Once deprotected, the amine forms a peptide bond with the carboxyl group of the next amino acid.

Now that you understand the principles of solid phase synthesis, let’s go through a procedure for solid phase peptide synthesis, in which we will demonstrate the addition of the first two amino acids.

To begin the procedure, connect a receiving flask for waste to a 100-mL manual peptide synthesis vessel. Then place 0.360 g of 2-chlorotrityl chloride resin into the vessel. Connect a nitrogen gas line to the vessel sidearm and a vacuum line to the serrated hose adapter.

Add 20 mL of dimethylformamide to the resin and allow the resin beads to swell for 30 min under a flow of nitrogen gas. Then, apply vacuum to drain the solvent.

Add 10 mL of DMF, 1.6 mmol of an Fmoc-protected amino acid, and 2.5 mL of N,N-diisopropylethylamine to the vessel. Bubble under the nitrogen gas, which mixes the solution, for 15 min to load the protected amino acid onto the resin.

Remove the solvent under vacuum and perform a second loading. After removing the solvent, agitate the loaded resin beads three times in 10-mL portions of DMF, draining each wash into the receiving flask.

Next, add to the loaded beads 10 mL of a 20% solution of 4-methylpiperidine in DMF. Bubble the mixture for 15 min to remove the Fmoc group.

Drain the solvent and repeat the deprotection procedure. Wash and drain the loaded resin three times, as before. Store the beads under solvent until they are ready for the next step.

To verify that the loaded compound was completely deprotected, first place 1 to 2 drops of each Kaiser test solution in two test tubes.

Place a few loaded beads in a test tube and heat both tubes to 110 degrees in an oil bath. Deprotection is complete if the resin mixture turns dark blue to purple, indicating the presence of amine groups in the mixture.

To begin the coupling step, first wash the beads with 10 mL of NMP under a flow of N2 gas.

Then, add 10 mL of NMP, 1.6 mmol of the next Fmoc-protected amino acid, 1.6 mmol of the coupling agent HBTU, and 2.5 mL of DIPEA to the loaded resin.

Bubble N2 gas through the resin mixture for 30 minutes, and then drain the solvent. Wash and drain the beads with 10-mL portions of DMF three times, as before.

Repeat the Kaiser test. Coupling has occurred successfully if the beads and solution turn yellow, indicating that no amine groups are present.

Next, cleave the new Fmoc group with 20% 4-methylpiperidine in DMF and wash the beads with 10-mL portions of DMF. Repeat the coupling and deprotection for each remaining amino acid in the target peptide.

After the last amino acid has been deprotected and the resin beads have been washed, add 40 mL of peptide cleavage solution to separate the peptide product from the resin.

Bubble nitrogen gas through the resin mixture for 3 h, and then replace the receiving flask. Transfer the solution from the resin mixture to the new receiving flask under vacuum.

To generate the final product, remove the solvent with a rotary evaporator.

Solid phase synthesis is widely used in biology and chemistry. Let’s look at a few examples.

Solid-phase synthesis opened many new synthetic pathways to oligosaccharides, which are short chains of simple sugar monomers with important biological roles, such as energy storage. Unlike peptide bonds, each bond between sugars contains a stereocenter. To synthesize an oligosaccharide, not only must the monomers be in the correct order, but the bonds must also have the correct stereochemistry. Solid-phase synthesis techniques were developed to couple each monomer by a highly stereoselective process, which today is sufficiently refined to be automated.

Solid-phase synthesis is a common approach to combinatorial chemistry, which is the practice of synthesizing many variants of a compound in a single synthetic process. The loaded resin can easily be split into portions to react with different monomers or molecules. After each reaction, the portions are washed and recombined. This is repeated until the desired number of products has been generated. This technique is particularly useful in pharmaceutical research, as it can be used to generate new compounds or to evaluate the reactivity of a compound with a wide array of molecules.

You’ve just watched JoVE’s introduction to solid phase synthesis. You should now understand the underlying principles of solid phase synthesis, the procedure for solid phase peptide synthesis, and a few examples of how solid phase synthesis is used in organic chemistry. Thanks for watching!

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