Name: Detección y aislamiento de células viables Ratón T IL-17 Secretoras (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-18T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Aprenda a detectar y aislar células T CD4+ de ratón que secretan IL-17 mediante ensayo de secreción de citocinas y citometría de flujo. Este protocolo permite el análisis de respuestas inmunes y enfermedades autoinmunes.

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Preparación de los reactivos <ol><li> Hacer un tampón que contiene PBS con BSA (0,5%), y 2 mM EDTA. Debido a que las burbujas de aire pueden bloquear columnas MACS separación, el buffer debe ser desgasificado y almacenado a 2-8 ° C antes de su uso. </li><li> Usamos medio RPMI 1640 que contenía 5% de suero de ratón. El medio de cultivo no debe contener BSA o FCS, ya que estos compuestos alteran la especificidad de la estimulación de las células. </li><li> La IL-17 de ratón Ensayo secreción - Enriquecimiento de células y kit de detección de Miltenyi Biotec-. El kit contiene los siguientes componentes: la IL-17 Reactivo de captura, la IL-17 de detección de anticuerpos (Biotina), el anti-biotina-PE, y el MicroBeads Anti-PE. </li></ol> Estimular los esplenocitos <ol><li> Este protocolo se realiza en presencia de un control positivo y negativo, como esplenocitos estimulados y de contraste de las células T. Este protocolo se lleva a cabo mediante una técnica estéril. </li><li> Prepare una suspensión de células individuales de esplenocitos de ratón que fueron aislados usando el disociador gentleMACS ™. La concentración de células debe ser determinado a través de recuento de células. Que sedimenten las células a 200 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Después de la centrifugación, se aspira el sobrenadante de la bolita con una pipeta. No se decanta el tubo para evitar la pérdida de la pastilla. </li><li> Ahora, volver a suspender las células en el medio de cultivo y luego agregar a un pozo. Añadir medio suficiente para una concentración de diez millones de células por ml y cinco millones de células por centímetro cuadrado. </li><li> Para estimular una respuesta inmunológica en las células resuspendidas, añadimos ionomicina (1 mg / ml) y PMA (10 ng / mL) a la muestra y mezclar la solución pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. A continuación, los pozos están etiquetados en consecuencia. </li><li> Ahora, vamos a incubar las células durante 3 horas a 37 ° C sin que se mezclen para iniciar el período de estimulación. Proceder a la IL-17 análisis de 3 horas desde el inicio de la estimulación, por lo que planificar en consecuencia. </li><li> Para detener la secreción de las células se colocan sobre hielo y recoger las células estimuladas con cuidado pipeteando arriba y abajo con tampón frío. Las células se transfieren desde el pozo a un tubo y se lavan por segunda vez. </li><li> Para asegurarse de que todas las células se recogen, es una buena idea revisar su plato con un microscopio. Si las células siguen unidos, usted puede recoger las células que quedan por aclarar el plato con un tampón frío. Cualquier grupo de células en suspensión de células se pueden eliminar utilizando los filtros de pre-separación. </li></ol> Etiquetado de las células con el reactivo de captura <ol><li> Es de suma importancia señalar, que esta prueba funciona de manera óptima si menos del 2% de células IL-17-secretoras están presentes. </li><li> Si la concentración de las células secretoras de IL-17 se espera que sea superior al 2% ajustar el volumen en consecuencia. <img src="/files/ftp_upload/old/1037_2008_12_8_6/figure8.png" alt="la figura 8" width="500" height="162" /></li><li> Un riesgo potencial de este procedimiento es la contaminación cruzada de los reactivos de captura, lo que puede ocurrir durante el etiquetado cuando el anticuerpo bi-específicos se une a una célula T no secretor y las trampas de la IL-17 secretada por un linfocito vecinos, generando así los falsos positivos. </li><li> Con el fin de evitar este problema, es fundamental que las células se enfríe antes de que el etiquetado y el trabajo con tampón frío para disminuir la difusión de la IL-17 y evitar esta contaminación cruzada. Además de mantener las células en frío, que deben mantenerse a una concentración definida. </li><li> Para comenzar el procedimiento de etiquetado, utilizamos diez millones de células en un tubo de 15 ml con cierre. Si es mayor el número de células tienen que ser utilizados, simplemente escala de todos los volúmenes en consecuencia. Una vez que la concentración óptima de la célula se ha obtenido, se lavan las células mediante la adición de 10 ml de solución tampón frío. </li><li> Centrifugar las células a 300 g durante 10 minutos en una centrífuga refrigerada (2-8 ° C). </li><li> Tras la centrifugación, aspirar el sobrenadante por completo con una pipeta. No se decanta el sobrenadante, ya que dará lugar a la pérdida de células y de los volúmenes imprecisos. Repita el paso de lavado, que consiste en agregar 10 ml de tampón frío, centrifugación y aspiración. </li><li> Ahora que tenemos una bolita de la pureza deseada, resuspender las células en 80 L de medio de cultivo frío. Para etiquetar ellos, ahora vamos a añadir 20 l de reactivo de captura del ratón IL-17. </li><li> Se incuban las células durante 5 minutos en hielo. </li><li> Después del período de incubación de 5 minutos en hielo, retire el tubo y diluir las células en 10 ml de 37 º C a medio caliente. A continuación, fijar el tubo en el rotador del tubo MACSmix e incubar el tubo a 37 ° C durante 45 minutos en movimiento continuo. El aumento de la temperatura a 37 ° C se reiniciará la secreción de citoquinas. </li></ol> Etiquetado de las células con anticuerpos de detección de IL-17 (biotina) y anti-biotina-PE <ol><li> Después del período de la secreción de 45 minutos a 37 ° C, se coloca el tubo en hielo inmediatamente. Esto evitará que la secreción de citoquinas. A partir de aquí es muy importante para mantener las células en hielo.Trabajar con un tampón frío se evitará la contaminación cruzada de los reactivos de captura. </li><li> Llenar el tubo con tampón frío y centrifugar a 300xg a 2-8 º C durante 10 min. Aspirar el sobrenadante por completo. Repita el paso de lavado una vez más. </li><li> El pellet de células se resuspende en 80 l de tampón frío y el tubo se coloca en el hielo. </li><li> Para evitar la unión inespecífica del anticuerpo, se recomienda la adición de reactivos FcR 10μl de bloqueo e incubar en hielo durante 5 min. Luego se añaden 20 L de ratón de detección de anticuerpos IL-17 (biotina), que se conjuga con biotina y se incuba durante 10 minutos en hielo. </li><li> Una vez más, lavar las células como lo hemos hecho antes mediante la adición de 10 ml de tampón frío y centrifugar a 300xg a 2-8 º C durante 10 min. </li><li> Ahora aspirar el sobrenadante y resuspender el botón celular en 80 l de tampón frío. </li><li> Añadir 20 l de nuestra secundaria de anticuerpos, anti-biotina-PE. </li><li> Mezclar las células y la solución de anticuerpo secundario, y de nuevo se incuba el tubo durante 10 minutos en hielo. </li><li> Una vez que esta segunda incubación se completa, se lavan las células con 10 ml de tampón frío y centrifugar. </li><li> El pellet de ahora puede ser resuspendido en 500 L de tampón frío. </li><li> Si las células tienen que ser separados para el análisis de aguas abajo, pueden ser marcadas magnéticamente con Anti-PE-MicroBeads y separados de forma manual o automática utilizando columnas MACS y separadores de MACS. </li><li> Hemos completado el etiquetado de los esplenocitos y están listos para su análisis. </li></ol> FACS análisis <ol><li> Para nuestro análisis, vamos a comparar los esplenocitos estimulados y no estimulados por citometría de flujo. </li><li> Antes del análisis de citometría de flujo, las células se tiñeron con yoduro de propidio a 0,5 mg / ml a la puerta de las células muertas. El MACSQuant Analyzer ™ se ha cargado con 200.000 células por cada muestra y que ahora se va a mirar los gráficos de dispersión de la reactividad de los anticuerpos en relación a las muestras. Dos consideraciones importantes para el análisis de células raras - como la IL-17 células positivas - por citometría de flujo son los siguientes: <ul><li> establecimiento de una puerta en los linfocitos de la dispersión frontal versus gráfico de dispersión lateral </li><li> gating y las células muertas (teñidas con yoduro de propidio) y las células B (que puede causar la tinción de fondo inespecífica) para mejorar aún más la sensibilidad de detección </li></ul></li><li> Hemos utilizado CD4-APC anticuerpos para detectar las células T y los anticuerpos CD45R/B220-PerCP para detectar las células B. Vemos las propiedades de dispersión frontal y lateral de las muestras y aplicar una puerta en la población de linfocitos. </li><li> Una segunda puerta se aplicó para ver las células teñidas muertos y células teñidas B (eje Y). Estas células son excluidos del análisis de células T. </li><li> En este ejemplo, que es esencialmente nuestro control negativo, podemos ver que hay células IL-17 CD4 secretan muy pocos positivos en las muestras de T estimuladas - aproximadamente 0,003% (Figura 4). En cuanto a la población de células T estimuladas, podemos ver un gran número de células CD4 positivas las células T que secretan IL-17 - de 0.367% (Figura 5) antes de la separación y el 60,76% después de la separación magnética con tecnología MACS (Figura 5). </li></ol>

Todos los protocolos y hojas de datos están disponibles en www.miltenyibiotec.com. Advertencias Los reactivos contienen azida de sodio. En condiciones ácidas azida de sodio en ácido hidrazoico, que es extremadamente tóxico. Los compuestos de azida deben diluirse con agua antes de desecharlos. Se recomiendan estas precauciones para evitar depósitos en las tuberías, en las que pueden explotar.

Las células TH17 desempeñan un papel integral en la inmunidad adaptativa y la respuesta inflamatoria y son un componente clave en la conducción de la inflamación autoinmune. Este video documenta el uso del ratón Miltenyi de IL-17 Ensayo de secreción - Enriquecimiento de células y kit de detección (PE). Cuando se realiza este procedimiento, es importante tener una estimación de la frecuencia de células IL-17-secreción en su preparación de células de partida. La concentración de células apropiadas durante el período de etiquetado y la secreción de citoquinas evita la contaminación cruzada por otras células en la suspensión y asegura resultados fiables.

<table><tbody><tr><td>Kit de enriquecimiento y detección de secreción de IL-17 en ratón (PE)</td><td>Reactivo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-213</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Medio</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-440</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD4-APC</td><td>Reactivo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-611</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD8a-FITC</td><td>Reactivo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-605</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Solución de yoduro de propidio</td><td>Reactivo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Reactivo bloqueador de FcR, ratón</td><td>Reactivo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Kit de eliminación de células muertas</td><td>Reactivo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>Rotador de tubos MACSmix</td><td>Instrumento</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Dosificador gentleMACS&amp;#8482;</td><td>Instrumento</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Kit inicial autoMACS Pro</td><td>Instrumento</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Columnas MACS</td><td>Herramienta</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Separador MACS</td><td>Herramienta</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

detección y aislamiento de células viables ratón t il-17 secretoras

Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

La secreción de citocinas MACS tecnología de ensayo permite la detección de citocinas en el nivel de células individuales y el aislamiento sensible de la secreción de citoquinas viable de células. Con el fin de la etiqueta IL-17-secretora de las células, una suspensión de células individuales de esplenocitos de ratón se prepara y se estimuló a 37 ° C con PMA / ionomicina para inducir la secreción de citoquinas. Para detener la secreción de las células se colocan en hielo y se exponen a la IL-17 reactivo captura un anticuerpo bi-específicos que se une a CD45 en la superficie celular de leucocitos y de IL-17, ya que es secretada y capturado cerca de la superficie celular. La secreción se vuelve a iniciadas por el aumento de la temperatura a 37 ° C y IL-17 es atrapado por el reactivo de captura. La secreción de entonces se detuvo de nuevo, mediante la colocación de las células en hielo. Para detectar la IL-17 atrapadas, las células se incubaron con un IL-17-específicas segundo anticuerpo conjugado con biotina y un anticuerpo anti-biotina-PE. Las células pueden ahora ser analizado directamente por citometría de flujo o preparados para el aislamiento y enriquecimiento de su posterior marcado con anti-PE MicroBeads conjugados.

Este procedimiento describe la detección y aislamiento de los leucocitos de ratón TH17 que secretan activamente IL-17 a la estimulación.

Detección y aislamiento de células viables Ratón T IL-17 Secretoras

La tecnología del Ensayo de Secreción de Citocinas MACS permite la detección de citocinas secretadas a nivel de célula individual y el aislamiento sensible de células viables...

La tecnología de ensayo de secreción de citocinas max permite la detección de citocinas secretadas a nivel de célula individual y el aislamiento sensible de células viables que secretan citocinas, con el fin de etiquetar células que secretan IL-17. Se prepara una suspensión individual de leucocitos de ratón y se estimulan a 37 grados Celsius con PMA e ionomicina para inducir la secreción de citocinas y luego detenerla. A continuación, las células se colocan sobre hielo, donde se exponen al reactivo captor de IL-17.Una vez que se reinicia la secreción al aumentar la temperatura a 37 grados Celsius, la IL-17 queda atrapada por el reactivo capturador. Un anticuerpo biespecífico que se une al CD45 en la superficie celular de los leucocitos y a la IL-17 conforme esta es secretada y capturada cerca de la superficie celular, detiene nuevamente la secreción al colocar las células en hielo. Para detectar las células con IL-17 atrapada, se incuban con un segundo anticuerpo específico para IL-17 conjugado a biotina y con un anticuerpo anti-biotina PE. Ahora las células pueden analizarse directamente mediante citometría de flujo o prepararse para aislamiento y enriquecimiento mediante etiquetado posterior con microesferas conjugadas a anti-PE. Hola, me llamo Ellie Rankin, una de las científicas de Mill Tenney Biotech.Hoy voy a mostrarle un procedimiento para aislar y detectar leucocitos TH 17, los cuales, tras la estimulación, secretan IL 17. La IL 17 desempeña un papel importante en la inmunidad adaptativa y en la respuesta inflamatoria, y también es relevante para impulsar la inflamación autoinmune. Permítame mostrarle cómo se realiza el ensayo. Para el protocolo de hoy, primero necesitamos preparar un tampón que contenga PBS con BSA y EDTA dos milimolar, ya que las burbujas de aire pueden obstruir las columnas de separación magnética; por ello, el tampón debe desgasificarse y almacenarse entre dos y ocho grados Celsius antes de su uso.En segundo lugar, utilizamos medio RPMI 1640 que contiene 5% de suero de ratón. El medio de cultivo no debe contener BSA ni suero bovino fetal (FCS), ya que estos compuestos alterarán la especificidad de la estimulación celular. Por último, necesitará el kit de enriquecimiento y detección de células para el ensayo de secreción de IL-17 de ratón de MIL 10 E Biotech.El kit contiene los siguientes componentes: el reactivo captador de IL-17, el anticuerpo de detección de IL-17, biotina, la anti-biotina PE y las microperlas anti-PE. Lógicamente, es probable que realice este protocolo con un control negativo y uno positivo, como linfocitos no estimulados y una tinción de contraste para linfocitos T. Para nuestra demostración, nos centraremos únicamente en las células estimuladas.Este protocolo se llevará a cabo utilizando técnica estéril. Nuestro protocolo comienza con una suspensión de células individuales de espermatozoides de ratón aisladas mediante el disociador gentle max. La concentración de células debe determinarse previamente mediante el recuento celular.Centrifugar las células a 200 G durante 10 minutos a temperatura ambiente. Tras la centrifugación, aspiramos el sobrenadante del precipitado utilizando una pipeta. No verter el tubo para evitar la pérdida del precipitado. Ahora las células deben resuspenderse en nuestro medio de cultivo y luego añadir suficiente medio para obtener una concentración de 10 millones de células por mililitro y 5 millones de células por centímetro cuadrado.Para estimular una respuesta inmune en nuestras células resuspendidas, agregamos ionomicina y PMA a la muestra y mezclamos la solución pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Luego, las pocilas se etiquetan según corresponda. Ahora incubaremos durante tres horas a 37 grados Celsius sin mezclar para iniciar el período de estimulación.Proceda al análisis de IL-17 tres horas después del inicio de la estimulación. Así que planifique en consecuencia. Aquí observamos células del bazo de ratón estimuladas.Tenga en cuenta la morfología distinta y la agrupación celular de las células estimuladas. Por claridad, seguiremos únicamente las células estimuladas. A partir de este momento, para detener la secreción, recolectamos las células estimuladas pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.Después de agregar el tampón frío, las células se transfieren del pocillo a un tubo y se lavan por segunda vez. Para asegurarse de que se recojan todas las células, es recomendable examinar su placa bajo un microscopio. Si aún quedan células adheridas, puede recolectar las células restantes enjuagando la placa.Con tampón frío, cualquier agregado celular en la suspensión celular se puede eliminar utilizando los filtros de pre-participación. Un problema potencial de este procedimiento es la contaminación cruzada del reactivo de captura, que puede ocurrir durante la etiquetación. Cuando el anticuerpo biespecífico se une a una célula T no secretora y atrapa la IL-17 secretada por un linfocito vecino, se generan falsos positivos; para evitar este problema, es fundamental enfriar las células antes de la etiquetación y trabajar con tampón frío para limitar la secreción y ralentizar la difusión de la IL-17 y así prevenir esta contaminación cruzada.Es fundamental tener en cuenta que la contaminación cruzada también puede ocurrir si hay más del 2% de células secretoras de IL-17. Si se espera que la concentración de células secretoras de IL-17 sea mayor al 2%, ajuste los volúmenes en consecuencia. Por lo tanto, además de mantener las células frías, estas deben mantenerse a una concentración definida.Para comenzar el procedimiento de marcado, utilizamos 10 millones de células en un tubo cerrable de 15 mililitros. Si es necesario usar un número mayor de células, simplemente aumente todos los volúmenes proporcionalmente. Una vez que se haya obtenido la concentración óptima de células, lave las células añadiendo 10 mililitros de tampón frío.Ahora centrifugue las células a 300 G durante 10 minutos en una centrífuga refrigerada. Tras la centrifugación, aspire completamente el sobrenadante utilizando una pipeta. No vierta el sobrenadante, ya que esto provocará pérdida celular y volúmenes imprecisos. Repita el paso de lavado, que consiste en agregar 10 mililitros de tampón frío, centrifugación y aspiración.Ahora que tenemos un pellet de la pureza deseada, re suspenda las células en cualquier cantidad de microlitros de medio de cultivo frío para etiquetarlas. A continuación, agregaremos 20 microlitros de reactivo captador de IL-17 de ratón. Incube las células durante cinco minutos en hielo.Después del período de incubación de cinco minutos en hielo, retire el tubo y diluya las células en 10 mililitros de medio tibio a 37 grados Celsius. Luego sujete el tubo en el rotador de tubos max mix e incube el tubo a 37 grados Celsius durante 45 minutos.Bajo movimiento continuo, aumentar la temperatura a 37 grados Celsius reiniciará la secreción de citoquinas tras el período de secreción de 45 minutos a 37 grados Celsius. Coloque inmediatamente el tubo en hielo. Esto detendrá la secreción de citoquinas.A partir de este momento, es fundamental mantener las células en hielo. Trabajar con tampón frío evitará la contaminación cruzada del reactivo de captura. Llene el tubo con tampón frío y centrifugue a 300 Gs a dos a ocho grados Celsius durante 10 minutos.Aspire completamente el sobrenadante. Repita el paso de lavado una vez más. El沉淀ado celular se resuspende en 80 microlitros de tampón frío y el tubo se coloca en hielo.Para evitar la unión no específica del anticuerpo, recomendamos la adición de 10 microlitros de reactivo bloqueante FCR e incubar en hielo durante cinco minutos. Luego, agregamos 20 microlitros de anticuerpo de detección de IL-17 de ratón conjugado a biotina e incubar durante 10 minutos en hielo. Una vez más, lavamos las células como lo hemos hecho anteriormente, agregando 10 mililitros de tampón frío y centrifugando a 300 Gs a dos a ocho grados Celsius durante 10 minutos.Ahora aspire y resuspenda el botón celular en 80 microlitros de tampón frío y agregue 20 microlitros de nuestro anticuerpo secundario. Anti-biotina PE. Mezcle las células con la solución de anticuerpo secundario e incube nuevamente el tubo durante 10 minutos en hielo.Una vez finalizada la segunda incubación, lave las células con 10 mililitros de tampón frío y centrifugue. El precipitado ahora puede resuspenderse en 500 microlitros de tampón frío. Si es necesario separar las células para análisis posteriores, pueden marcarse magnéticamente con microesferas anti-PE y separarse manualmente o de forma automatizada utilizando columnas Max y separadores Max.Ahora hemos completado la marcación de nuestras células SPLU y estamos listos para el análisis. Compararemos las células SP estimuladas y no estimuladas mediante citometría de flujo antes de realizar el ensayo. Las células Facts se tiñen con yoduro de propidio a 0,5 microgramos por mililitro para excluir las células muertas.Se cargó el citómetro de flujo con 200.000 células para cada muestra y ahora vamos a observar los gráficos de dispersión de la reactividad relativa de los anticuerpos en las muestras. Dos consideraciones importantes para el análisis de células raras, como las células positivas para IL-17 mediante citometría de flujo, son establecer una compuerta sobre los linfocitos en el gráfico de dispersión hacia adelante versus dispersión lateral y excluir las células muertas teñidas con yoduro de propidio y las células B, que podrían causar tinción de fondo inespecífica. Con el fin de aumentar aún más la sensibilidad de detección.Aquí utilizamos el anticuerpo CD cuatro A PC para detectar linfocitos T en el anticuerpo CD 45 RB dos 20 por CP. Para detectar las células B, observamos las propiedades de dispersión directa y lateral de las muestras y aplicamos un gateo sobre la población de linfocitos. Se aplicó un segundo gateo para observar las células muertas marcadas y las células B marcadas en el eje Y.Estas células se excluyen del análisis de linfocitos T. En este ejemplo, que es esencialmente nuestro control negativo, podemos observar que hay muy pocas células T CD4 positivas que secretan IL-17 en muestras no estimuladas, aproximadamente el 0,003%. Al observar la población de linfocitos T estimulados, podemos ver un número considerable de células T CD4 positivas que secretan IL-17, alrededor del 0,367% antes de la separación y el 60,76% después de la separación magnética con tecnología MACS. Acabamos de mostrarle mediante documentación en video cómo utilizar el ensayo de secreción de IL-17 en ratón de Miltenyi Biotec para el enriquecimiento celular y el kit de detección con PE.La parte más importante de este procedimiento es tener una idea de la frecuencia de células secretoras de IL-17 que se tienen en la población inicial. La concentración adecuada de células garantizará que la marcación y el período de secreción de citocinas tengan menos contaminación cruzada, asegurando así resultados confiables. Eso es todo.Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.

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Investigación

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Biology

Biología

Este video ilustra un método para aislar células T asesinas naturales invariantes, también conocidas como células iNKT. El procedimiento comienza con la inyección de un glicolípido sintético en un ratón para estimular la activación y proliferación de las células iNKT en el bazo. Posteriormente, se preparan suspensiones unicelulares a partir del bazo y se incuban con complejos de reconocimiento de células iNKT marcados con fluoróforos, seguidos de una separación basada en perlas magnéticas, para...

Aislamiento de linfocitos T asesinos naturales invariantes de un modelo de ratón

Con funciones efectoras diferenciadas de otros subconjuntos de células T, las células Th17 se han implicado en el centro de la autoinmunidad inflamatoria. Este protocolo de diferenciación in vitro de Th17 en proporciona un medio para determinar si ingenuas linfocitos T CD4 + pueden diferenciarse en células Th17, y para examinar aún más su papel en la autoinmunidad y la respuesta del huésped.

Aislamiento y diferenciación de Th17 Naïve linfocitos T CD4

El análisis in vitro de la recombinación de interruptores de clase en ratones es un desafío debido a las moléculas citofílicas de IgE unidas a los receptores Fc en la superficie de las células B.  Describimos un método para la detección de IgE utilizando la escisión mediada por tripsina de IgE unida a la superficie antes de la fijación y permeabilización para la tinción con fluorescencia citoplasmática.

Detección de True IgE que expresan las células del linaje B de ratón

+ &gt; 'jove_content'Naïve se polarizan en varios subconjuntos dependiendo del entorno en el momento de la activación.  La diferenciación de los linfocitos T CD4+ naïve a varios subconjuntos efectores se puede lograr in vitro mediante la adición de estímulos del receptor de linfocitos T y señales específicas de citocinas.

Ratón Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Aislamiento de células T y<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciación en subconjuntos de células T

Existen distintos subconjuntos de células dendríticas como poblaciones raras en los órganos linfoides y, por lo tanto, son difíciles de aislar en número y pureza suficientes para los experimentos inmunológicos. Aquí describimos un método de alta eficiencia y alto rendimiento para el aislamiento de todos los principales subconjuntos actualmente conocidos de células dendríticas esplénicas de ratón.

Un método de rendimiento eficiente y de alta para el aislamiento de ratón subconjuntos de células dendríticas

Aquí, describimos un protocolo para analizar el fenotipo de células T reguladoras (Treg) aisladas de ratones infectados por el virus de la coriomeningitis linfocítica crónica e ingenua. Además, proporcionamos un proceso para evaluar la actividad supresora de las células Treg.

El análisis fenotípico y funcional de las células reguladoras T activadas Aislado de la coriomeningitis linfocítica crónica por el virus ratones infectados

Describimos aquí un modelo de ratón reportero transgénico para visualizar las células productoras de IL-22 dentro de diferentes tejidos de ratón. Este método se puede utilizar para rastrear la ubicación de otras citocinas o proteínas secretaria en el ratón.

La visualización de IL-22 que expresan linfocitos utilizando ratones Reporter

Las células linfoides innatas del grupo 2 (ILC2), implicadas en la inflamación tipo 2, participan principalmente en la respuesta a la infección por helmintos, enfermedades alérgicas, homeostasis metabólica y reparación de tejidos. En este estudio, se demuestra un procedimiento para aislar ILC2s de la mucosa nasal murina y detectar la expresión de CD226.

Aislamiento de células linfoides innatas del grupo 2 de la mucosa nasal del ratón para detectar la expresión de CD226

Este protocolo describe la diferenciación de linfocitos T CD4+ naïve en linfocitos Th17 patógenos in vitro. Específicamente, cuando se combina con un enfoque basado en citometría de flujo multiparamétrica, se puede obtener una pureza del 90% de las células Th17 patógenas a partir de células T CD4+ naïve utilizando este método de diferenciación.

Diferenciación in vitro de linfocitos T CD4+ naive en linfocitos Th17 patógenos en ratón

El estudio actual muestra protocolos para evaluar el compromiso del destino temprano de las células TFH específicas del virus y manipular la expresión génica en estas células.

Acceso a la diferenciación temprana de células T CD4+ auxiliares foliculares específicas del virus en ratones infectados con LCMV agudo

Proporcionamos un protocolo detallado para aislar e identificar poblaciones de células T específicas de antígenos raros en pulmones de ratón a través del enriquecimiento de células T basado en perlas magnéticas y tetrámeros del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) de péptidos.

Identificación de células T raras específicas de antígeno de pulmones de ratón con tetrámeros del complejo de histocompatibilidad peptídico:principal

Aprenda a detectar y aislar células T CD4+ de ratón que secretan IL-17 mediante ensayo de secreción de citocinas y citometría de flujo. Este protocolo permite el análisis de respuestas inmunes y enfermedades autoinmunes.

Detección y aislamiento de células viables Ratón T IL-17 Secretoras

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