Name: Microcontacto de impresión de las proteínas de Biología Celular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-05T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Aprende microimpresión de contacto para biología celular usando fibronectina y vidrio. Esta técnica permite crear patrones de proteínas que recrean entornos extracelulares complejos para estudiar adhesión celular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Preparación de soluciones y materiales Estos pasos deben llevarse a cabo de varios días de antelación. <ol><li> Cubreobjetos de vidrio. Cubreobjetos fueron limpiados por inmersión durante 10 minutos en una solución de detergente Linbro 7X: agua, mezclado en una relación 1: 3 relación y se calienta con agitación hasta que se aclare. Cubreobjetos se lavaron exhaustivamente con agua destilada, y luego se hornea a 450 ° C durante 6 horas. Cargando cubreobjetos en bastidores tinción de cerámica (ver reactivos) simplifica este proceso. </li><li> Proteína solución para la estampación. Reconstituir la fibronectina siguiendo las instrucciones de los fabricantes una solución madre de 1 mg / ml de concentración. </li></ol> 2. Fundido sellos del maestro topológica Estos pasos pueden llevarse a cabo de varios días de antelación. Sellos tienda de patrones en un plato cubierto, como una placa de cultivo de tejidos. <ol><li> Quite el polvo del maestro por medio de una corriente de aire comprimido, aire filtrado o gas inerte. </li><li> Coloque el maestro, con dibujos laterales arriba, en el fondo de un plato de plástico apenas más grande que el maestro. 60 - o 100 mm de placas de cultivo de tejidos son muy adecuadas para este propósito. </li><li> En un tubo de poliestireno de centrífuga de 50 ml, se combinan los componentes Sylgard en una proporción de agente de curado: base de elastómero de 1: 10 en peso. Mezcle bien con un dispositivo de plástico, como una pipeta desechable. Preparar al menos 0,2 ml de elastómero por centímetro cuadrado de área de plato. </li><li> Centrifugar el tubo de 50 ml a 300 g durante 5 min para eliminar las burbujas de aire. </li><li> Vierta el elastómero sobre el maestro, y luego colocarlo en un secador, al vacío, durante 30 minutos. </li><li> Curar el elastómero en un horno a 65 ° C durante al menos 2 horas. Curado a temperaturas más altas y durante más tiempo los resultados en tiempos más rígido elastómero. Deje que se enfríe a temperatura ambiente. </li><li> Separar la hoja de sellos del maestro. </li></ol> 3. Microcontacto de impresión de la fibronectina sobre vidrio <ol><li> Corte un único sello. Sellos de medición de 4 mm x 4 mm a 1 cm x 1 cm en la zona y 1 a 2 mm de espesor son más fáciles de empezar. Ponga el lado patrón de arriba en un portaobjetos de cristal o de plástico. </li><li> Coloque el sello en un limpiador de plasma, y ​​el proceso, al vacío, durante 30 segundos. Un limpiador de plasma Harrick Científico (ver equipos), establece en su valor más alto de salida hará que la superficie hidrofílica PDMS. Ya veces provocar el agrietamiento del elastómero. </li><li> Diluir la solución de fibronectina con agua desionizada a una concentración de estampación de 50 ug / ml. </li><li> Coloque una pequeña gota (10 - 50 l) de solución de estampado en el sello. Se extenderá por todo la superficie hidrófila. Agregar suficiente solución única que cubre la caída de la marca, pero no se ejecuta en los bordes. Vamos a absorber las proteínas para acabar por 5 minutos. </li><li> El uso de un Kimwipe ® u otro tejido de papel limpia, la mecha de la mayor parte de la solución de proteína de la marca, sin tocar la región con patrón. </li><li> Seque el resto de la solución de la marca bajo un chorro de agua limpia, el gas seco e inerte como el nitrógeno. </li><li> Con unas pinzas, retire el sello de la lámina de vidrio, invertir, y el lugar en contacto con el cubreobjetos limpio (la superficie a rellenar con patrón). Colocar un peso encima para promover un buen contacto. El peso específico que proporciona el mejor patrón depende del tamaño de la estampilla y el patrón, empieza con un peso de 5 g, y ajuste entre piezas estampadas. Deje el sello en contacto con la superficie de un minuto. </li><li> Con cuidado, desmontar la pila, y el sello independiente de cubreobjetos. </li><li> Enjuague vigorosamente el cubreobjetos con dibujos en PBS, seguido de agua destilada, para eliminar la proteína que no se adsorbe a la superficie. Cubreobjetos seca en corriente de nitrógeno. </li></ol> Resultados representante Impresión por microcontacto es un proceso de gran alcance para las moléculas de los patrones en las superficies. Este proceso tiene la capacidad de crear funciones con dimensiones que van desde decenas de micrómetros a cientos de nanómetros, en la figura. 1A, los logotipos de la izquierda son cada 200 m de altura, mientras que las manchas verdes se ilustra en la figura. 1B son: 1 m de diámetro y espaciados a intervalos de 4 m, medidos de centro a centro. Fig. 1B también ilustra una propiedad de gran alcance de impresión por microcontacto, es decir, que es y el proceso aditivo. Múltiples rondas de impresión por microcontacto se puede aplicar a una sola superficie para crear sistemas multicomponentes 3. <img src="/files/ftp_upload/old/1065_2008_11_24_3/Figure_a.jpg" alt="Figura A" /><img src="/files/ftp_upload/old/1065_2008_11_24_4/FIGURE_B.jpg" alt="Figura B" />

<ol><li>Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+control+of+cell+life+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Geometric control of cell life and death.</a> Science. 276, 1425-1425 (1997).</li>
<li>Kumar, A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+Gold+Having+Micrometer+to+Centimeter+Dimensions+can+be+Formed+Through+a+Combination+of+Stamping+with+an+Elastomeric+Stamp+and+an+Alkanethiol+%22Ink%22+Followed+by+Chemical+Etching%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Features of Gold Having Micrometer to Centimeter Dimensions can be Formed Through a Combination of Stamping with an Elastomeric Stamp and an Alkanethiol "Ink" Followed by Chemical Etching.</a> Applied Physics Letters. 63, 4-4 (1993).</li>
<li>St. John, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+Glial+Cell+Attachment+to+Microcontact-printed+Surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Preferential Glial Cell Attachment to Microcontact-printed Surfaces.</a> Journal of Neuroscience Methods. 75, 171-171 (1997).</li>
<li>Kam, L., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+to+protein-micropatterned-supported+lipid+bilayer+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion to protein-micropatterned-supported lipid bilayer membranes.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 55, 487-487 (2001).</li>
<li>Kung, L. A., Kam, L., Hovis, J. S., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+Hybrid+Surfaces+of+Proteins+and+Supported+Lipid+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Patterning Hybrid Surfaces of Proteins and Supported Lipid Bilayers.</a> Langmuir. 16, 6773-6773 (2000).</li>
<li>Shen, K., Thomas, V. K., Dustin, M. L., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+of+costimulatory+ligands+enhances+CD4%2B+T+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 7791-7791 (2008).</li>
<li>Shi, P., Shen, K., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+presentation+of+L1+and+N-cadherin+in+multicomponent%2C+microscale+patterns+differentially+direct+neuron+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Local presentation of L1 and N-cadherin in multicomponent, microscale patterns differentially direct neuron function in vitro.</a> Developmental Neurobiology. 67, 1765-1765 (2007).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El proceso de impresión por microcontacto es conceptualmente simple y muy robusto, que se ha aplicado a los patrones de una amplia gama de moléculas en una variedad de sustratos. Sin embargo, este proceso sigue siendo algo de un arte. La geometría específica del modelo que se creó, la proteína a ser modelado, el peso aplicado, y el recubrimiento / sellado todas las condiciones de afectar la calidad de estampado. Por ejemplo, poco peso, aplicada a grandes rasgos, a menudo resulta en diferencias en el patrón como se puede ver en el logo super...

<table><tbody><tr><td>Limpieza de plasma</td><td></td><td>Harrick Scientific Products, Inc.</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>Desecador</td><td></td><td>Nalge Nunc international</td><td>5315-0150</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>10010-072</td><td></td></tr><tr><td>Kit de etiquetado de proteínas</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>A30006</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Portapocillos para tinción</td><td>Reactivo</td><td>Thomas Scientific</td><td>8542E40</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-12</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Reactivo</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 Sil Elast Kit</td><td></td></tr><tr><td>Rejilla de difracción</td><td>Reactivo</td><td>Edmund Scientific</td><td>3040267</td><td></td></tr></tbody></table>

microcontacto de impresión de las proteínas de biología celular

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

La capacidad de las proteínas y otras biomoléculas patrón sobre sustratos es importante para captar la complejidad espacial del medio ambiente extracelular. Desarrollo de la imprenta microcontacto por el grupo de Whitesides (<a href="http://gmwgroup.harvard.edu/"&gt; Http://gmwgroup.harvard.edu/</a&gt;) A mediados de la década de 1990 revolucionó este campo, haciendo de la microelectrónica / técnicas de microfabricación acceso a los laboratorios se centraron en las ciencias de la vida. Las implementaciones iniciales de este método de polidimetilsiloxano (PDMS) sellos para crear patrones de productos químicos en las superficies de materiales funcionalizados<sup&gt; 1</sup&gt;. Desde entonces, una serie de enfoques innovadores han sido desarrollados para las moléculas de otro patrón, incluyendo las proteínas<sup&gt; 2</sup&gt;. Este vídeo muestra el proceso básico de creación de sellos de PDMS y las utiliza para las proteínas patrón, ya que estas medidas son difíciles de expresar con precisión en las palabras. Nos centramos en los patrones de la matriz proteica extracelular fibronectina en cubreobjetos de vidrio como un ejemplo específico de los patrones. Un componente importante del proceso de impresión por microcontacto es un maestro topológica, de la que los sellos son emitidos, las regiones de subir y bajar del maestro se reflejan en la marca y definir el modelo final. Por lo general, un maestro consiste en una oblea de silicio recubierto con fotorresistencia y modelada por fotolitografía como se hace aquí. La creación de los maestros que contienen un patrón específico requiere equipo especializado, y se aborda mejor en consulta con un centro de fabricación o instalación. Sin embargo, casi cualquier sustrato con la topología se puede utilizar como un maestro, como redes de difracción de plástico (ver Reactivos para un ejemplo), y como maestros casual proporcionar fácilmente disponible, los patrones de simple. Este protocolo se inicia en el punto de tener un maestro en la mano.

Impresión por microcontacto se utiliza ampliamente a las proteínas de patrones y otras moléculas en las superficies de material. Se demuestra los pasos básicos de este proceso, los patrones de estampación de la fibronectina sobre el cristal.

Microcontacto de impresión de las proteínas de Biología Celular

La capacidad de crear patrones de proteínas y otras biomoléculas sobre sustratos es fundamental para capturar la complejidad espacial del entorno extracelular. ...

La impresión por microcontacto se utiliza para configurar proteínas y otras moléculas sobre superficies de materiales con el fin de recrear la complejidad de los entornos extracelulares. Para iniciar la impresión por microcontacto, se crea un molde topológico y luego se emplea litografía blanda para moldear un sello a partir del molde utilizando Sylgard. El sello puede recubrirse con proteína y luego utilizarse para transferir proteínas a una nueva superficie sobre la cual las células pueden adherirse.Hola, mi nombre es Chen. Soy del laboratorio del Dr. Lance Camp de ingeniería biomédica de la Universidad de Columbia. Hola, soy GT del Departamento de Ingeniería Mecánica.Hola, soy Lance Kem del Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad de Columbia. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar cómo responden las células a arreglos complejos de proteínas en su entorno extracelular. Este método fue desarrollado a mediados de la década de 1990 por el laboratorio de George Whitesides y se ha convertido en una herramienta ampliamente utilizada y valiosa.Existen muchas variaciones de esta técnica, pero hoy G y Co U demostrarán el proceso básico de impresi

microcontact-printing-of-proteins-for-cell-biology

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video muestra los experimentos con el posterior análisis de las interacciones proteína-proteína mediante el uso de micro-modelado de superficies. El enfoque ofrece la posibilidad de detectar las interacciones de proteínas en las células vivas y combina una alta capacidad de rendimiento con la posibilidad de extraer información cuantitativa.

En vivo-La detección de interacciones proteína-proteína en la Micro-patrón superficies

Monocapas auto-ensambladas (SAMs) formado por largas cadenas de alcanos tioles en oro proporcionan sustratos bien definidos para la formación de los patrones de proteínas y el confinamiento de la célula. Impresión por microcontacto de hexadecanethiol con un polidimetilsiloxano (PDMS) sello seguido por el relleno con un glicol terminada alcano tiol monómero produce un patrón en el que las proteínas y las células de absorber sólo a la región hexadecanethiol sellado.

La creación de dos dimensiones con dibujos sustratos para el confinamiento de proteínas y células

Una descripción de los métodos utilizados para convertir una impresora HP Deskjet 500 en un bioprinter. La impresora es capaz de procesar las células vivas, lo que provoca poros transitorios en la membrana. Estos poros se pueden utilizar para incorporar pequeñas moléculas, incluyendo fluorescente G-actina, en las células impresos.

Crear transitoria poros de la membrana de células utilizando una impresora de inyección de tinta estándar

Un método para el montaje de gradientes adhesivas y soluble en una cámara de microscopía para estudios en vivo de células de migración se describe. El entorno de ingeniería combina superficies antiincrustantes y pistas adhesivas con gradientes de solución y por lo tanto permite determinar la importancia relativa de las señales de orientación.

Creación de degradados adhesivas y soluble para la migración celular con imágenes de microscopía de fluorescencia

Esta tecnología de impresión microfluídica 3D imprime matrices de células en superficies sumergidas.  Describimos cómo las matrices de células se entregan microfluídicamente en celdas de flujo 3D sobre superficies sumergidas.  Al imprimir en superficies sumergidas, se produjeron microarrays celulares que permiten el cribado de fármacos y la evaluación de la citotoxicidad en una multitud de áreas.

La impresión Sumergido de células sobre una superficie modificada utilizando un flujo continuo Microspotter

Los sustratos de cultivo celular funcionalizados con patrones a microescala de ligandos biológicos tienen una inmensa utilidad en el campo de la ingeniería de tejidos. Aquí, demostramos la fabricación versátil y automatizada de sustratos de cultivo de tejidos con múltiples cepillos de poli(etilenglicol) micromodelados que presentan químicas ortogonales que permiten la inmovilización espacialmente precisa y específica del sitio de ligandos biológicos.

La fabricación de sustratos de cultivo complejas utilizando robótica microcontacto impresión (R-μCP) y secuencial sustitución nucleófila

Este informe describe una técnica simple y fácil de realizar, utilizando vacío a baja presión, para llenar canales microfluídicos con células y sustratos para la investigación biológica.

Un método versátil de Patterning proteínas y células

Aquí, presentamos un protocolo de pantalla proteína extracelular microarrays para la identificación de las interacciones receptor-ligando novela en alto rendimiento. También se describe un método para mejorar la detección de interacciones proteína-proteína transitorias mediante el uso de complejos de proteína-microbead.

Tecnología de microarrays de proteínas extracelulares para detección de alto rendimiento de las interacciones ligando-Receptor de baja afinidad

Nuestro objetivo general es entender cómo las células detectan señales extracelulares que conducen al crecimiento axonal dirigido. Aquí, describimos la metodología de la Adsorción Molecular Inducida por la Luz de Proteínas, utilizada para producir micropatrones definidos de componentes de matriz extracelular con el fin de estudiar eventos específicos que rigen el crecimiento de axón y la búsqueda de rutas.

Adsorción molecular inducida por la luz de proteínas utilizando el sistema PRIMO para micro-patrones para estudiar las respuestas celulares a las proteínas de matriz extracelular

Describimos mejoras en un método estándar para medir las fuerzas de tracción celular, basado en la impresión de microcontacto con un solo paso de patrón sustractivo de matrices de puntos de proteínas de matriz extracelular en hidrogeles blandos. Este método permite una fabricación más simple y consistente de patrones de islas, esencial para controlar la forma del grupo celular.

Generación de patrones para microscopía de tracción de micropatrones

Tradicionalmente, el cultivo celular se realiza sobre sustratos planos que imitan mal el entorno natural de las células in vivo. Aquí describimos un método para producir sustratos de cultivo celular con geometrías curvas fisiológicamente relevantes y proteínas extracelulares micromodeladas, lo que permite investigaciones sistemáticas sobre la detección celular de estas señales extracelulares.

Generación de microambientes celulares multicue mediante fotopatronaje UV de sustratos de cultivo celular tridimensional

Aprende microimpresión de contacto para biología celular usando fibronectina y vidrio. Esta técnica permite crear patrones de proteínas que recrean entornos extracelulares complejos para estudiar adhesión celular.

Microcontacto de impresión de las proteínas de Biología Celular

Explorar más videos