Name: Foto-inducido el entrecruzamiento de las proteínas sin modificar (picup) aplicada a los péptidos amiloidogénicas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-12T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Aprende el método PICUP para analizar la distribución de oligómeros en péptidos amiloidogénicos usando luz intensa. Esta técnica permite estudiar las propiedades estructurales de proteínas implicadas en enfermedades neurodegenerativas.

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Este trabajo fue apoyado por becas y AG027818 AG030709 de NIH / NIA, 2005/2E de Larry L. Hillblom Foundation, IIRG-07-58334 de la Asociación de Alzheimer, y 07-65798 de California Departamento de Salud Pública.

1. Péptido de preparación <ol><li> Pesar ~ 100-200 mg de péptido liofilizado usando una microbalanza y la transferencia en la etiqueta, revestido con silicio, tubos de microcentrífuga de baja adsorbente. Aquí, nosotros usamos las secuencias humanas de Aβ40, Aß42, calcitonina y GRF. </li><li> Aquí, nosotros usamos los péptidos pre-tratados con 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) para obtener homogénea, global sin preparativos. Este paso es necesario porque preformados agregados inducir la agregación de las proteínas de rápida amiloidogénica, que se traducen en una mala reproducibilidad entre los experimentos 5. Otros métodos como la filtración y la SEC también se puede utilizar para obtener agregados sin los preparativos para picup 6. </li><li> Para el tratamiento de los péptidos con HFIP, pre-enfriar el contenedor de hielo dentro de HFIP en una campana de extracción usando la protección adecuada (HFIP es volátil y tóxico). De enfriamiento de un envase de 250 ml por lo general requiere 10-15 min. Añadir HFIP de pre-enfriado tubos que contienen péptidos liofilizados para obtener una concentración de péptido nominal de 0,5 mM. </li><li> Sonicar las soluciones de péptidos en un sonicador de baño de María durante 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Vortex suavemente e incubar los tubos durante 30 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Enfriar los tubos en hielo (durante 1 minuto), y dividir las soluciones en 10-50-l alícuotas de 0,6 ml etiquetados bajo adsorbente tubos. </li><li> Quitar HFIP por evaporación bajo una corriente ligera de nitrógeno, o dejar los tubos abiertos en la campana de humos durante la noche. Para la evaporación durante la noche, se colocan los tubos abiertos en un estante y los cubren con una hoja grande de Kimwipes para evitar el polvo y la contaminación de partículas. </li><li> Desecar el HFIP restantes en el vacío en un liofilizador, o un concentrador centrífugo durante 30 minutos, o en un desecador conectado a una toma de aspiración de 2 h. El producto final será una película de péptidos en la parte inferior de los tubos de microcentrífuga. Si bien exsiccated, los tubos se pueden almacenar hermético durante períodos prolongados (meses) a -20 o -80 ° C. </li></ol> 2. Solubilización de los péptidos HFIP tratados y foto entrecruzamiento <ol><li> Antes de solubilización de los péptidos HFIP tratados por reacciones de reticulación, es necesario preparar el cross-linking y reactivos de enfriamiento. </li><li> Pesar persulfato de amonio (APS, el Sr. 228,2 g / mol) y preparar una solución 20 mM de fosfato sódico 10 mM, pH 7,4. Mezclar con un agitar hasta que la solución es clara. </li><li> Prepare una solución mM de Tris (2,2-bipiridilo) dichlororuthenium (II) hexahidratado (RuBpy, el Sr. 748,63 g / mol) en fosfato sódico 10 mM, pH 7,4. Mezclar con un vórtice y verificar su completa disolución. Proteger el tubo de la luz con papel de aluminio. </li><li> Para el análisis de SDS-PAGE siguientes enlaces cruzados, un reactivo de enfriamiento conveniente es de 5% β-mercaptoetanol en 2 × SDS-PAGE muestra de amortiguación. Por otra parte, un M ditiotreitol (DTT, el Sr. 154,5 g / mol) en agua desionizada o un tampón adecuado se puede utilizar. </li><li> HFIP tratados con películas péptido se disolvió en NaOH diluido y luego tampón fosfato de sodio se agrega para obtener ~ 30 mM concentración de péptido. Añadir 60 mM NaOH seguido de agua destilada en el tubo que contiene la película péptido de tal manera que NaOH y el agua constituyen el 10 y el 45% del volumen final, respectivamente. Raspe la película de péptidos de las paredes en el interior del tubo de microcentrífuga con la punta, mezclar con la pipeta hacia arriba y abajo, y someter a ultrasonidos durante 5 minutos en un baño de ultrasonidos en baño María. </li><li> Añadir un 45% fosfato sódico 20 mM, pH 7,4, mezclar con la pipeta, y se centrifuga a 16.000 g durante 10 minutos. Dejar de lado alícuotas de descruzar vinculados péptidos se mezcla con el reactivo de enfriamiento en los controles negativos. </li><li> Ajuste el obturador de la cámara de retardo de 1 s. En tiempos de irradiación más alta, amplia reacciones de los radicales puede causar la degradación de proteínas. Cargar el obturador de la cámara. Tiempo de irradiación posible que tenga que ser optimizada al utilizar el método con una nueva proteína. </li><li> Una reacción típica picup se lleva a cabo en un volumen de reacción de 20 microlitros. Transferencia de 18 l de la solución de péptidos en una pared delgada, transparente, de 0,2 ml tubo de PCR. </li><li> Para la solución de péptido, agregue 1 RuBpy l seguido de un APS l y mezclar los reactivos con pipeta (la concentración final de RuBpy y APS en la mezcla de reacción de 0.05 y 1 mM, respectivamente). </li><li> Rápidamente coloque el tubo de reacción dentro de un frasco de vidrio de 1,8 ml. Coloque el vial en el interior del fuelle conectado por delante de la cámara. Coloque el protector del objetivo y pulse el disparador para que la muestra se irradia durante 1 s en el interior del fuelle. </li><li> Después de la irradiación de la muestra, rápidamente retire el vial del fuelle y el tubo de PCR de la ampolla. Rápidamente detener la reacción mediante la adición de una TDT l ó 10 l de amortiguación reduciendo página de muestra. Repita la reacción de cada alícuota de péptidos. </li><li> Las mezclas de reacción ya se puede congelar a -20 ° C para el almacenamiento de no más de 7 días o se mantienen en hielo antes de su análisis por SDS-PAGE y tinción con plata. </li></ol> 3. SDS-PAGE y tinción astilla-de los productos péptido reticulado <ol><li> Rutina de SDS-PAGE y tinción con plata-se realiza para visualizar reticulado péptidos. </li><li> Carga de 5 l de la mezcla de reacción por carril para obtener ~ 130 pmol de péptido por carril. </li><li> Incluyen cantidades similares de descruzar vinculados péptidos para la comparación. También incluye una escalera de proteínas estándar de aproximación visual de un peso molecular de las bandas de péptidos. </li><li> Ejecute el gel usando un aparato de electroforesis en gel estándar. Usamos la XCell SureLock Mini-célula del sistema de Invitrogen y realizar la tinción de plata de acuerdo a la publicación Invitrogen IM-1002, Novex Pre-Cast electroforesis en gel. </li></ol> Parte 4: Los resultados representativos (Figura 1) <img src="/files/ftp_upload/old/1071_2009_1_19_13/Result no demarcation.png" alt="Figura 1" /> Figura 1: plata manchada geles de poliacrilamida que muestra descruzar vinculados (-) y foto-reticulado (+) GRF, la calcitonina, Aβ40 y Aß42 SDS-PAGE y tinción de plata-análisis de picup generado Aβ40 oligómeros muestran intensidades de las bandas de aproximadamente similares de monómero a través de tetrámero, seguido por una fuerte disminución en la abundancia de oligómeros superiores 7. Descruzar vinculados Aβ40 migra con un consistente con la de monómero 7 señor. Aß42 muestra una distribución de oligómeros de tamaño distinto. Aß42 oligómeros comprenden grupos de 2-3 8. El primer grupo, a través de monómero trímero, muestra disminución de la intensidad con el fin de oligómeros en aumento. En el segundo grupo, una distribución de Gauss-como se observa entre tetrámero y heptamer, con un máximo de pentámero y hexámero. El tercer grupo, que no se muestra aquí, contiene oligómeros de Mr ~ 30.000-60.000 Da 8. Estos oligómeros superiores señor general, cuando se utilice SEC-LMW Aß42 aislados, pero no péptido preparado por filtración o tratamiento HFIP 6. Descruzar vinculados a Aß42 produce principalmente dos bandas, una banda de monómero y un amplio trimer / tetrámero banda, que es un artefacto inducido por SDS 5,9. La calcitonina se obtiene una distribución de tamaño de oligómero que difiere fuertemente de una disminución monótona exponencial de la región a través de monómero tetrámero, lo que sugiere la pre-existencia de dímeros, trímeros, tetrámeros y 7. El control de polipéptidos, GRF, produce una distribución de oligómeros monótona desde dímeros a través de hexamer de tal manera que las cantidades relativas de oligómeros aparente disminuye exponencialmente con el incremento de la masa molecular. En otros experimentos, los oligómeros superiores también pueden ser visualizados 7. El número exacto y la intensidad relativa de las bandas de oligómero pueden variar entre los experimentos en función de la concentración de proteínas reales, la cantidad de proteína cargada en el gel, y el tiempo empleado en la etapa de desarrollo en el protocolo de tinción de plata.

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<li>Li, H. T., Lin, X. J., Xie, Y. Y., Hu, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+events+of+%CE%B1-synuclein+oligomerization+revealed+by+photo-induced+cross-linking%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Pept.+Lett%22%5BJournal%5D)">The early events of α-synuclein oligomerization revealed by photo-induced cross-linking.</a> Protein Pept. Lett. 13, 385-390 (2006).</li>
<li>Vollers, S. S., Teplow, D. B., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Peptide+oligomerization+state+using+rapid+photochemical+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Determination of Peptide oligomerization state using rapid photochemical crosslinking.</a> Methods Mol. Biol. 299, 11-18 (2005).</li>
</ol>

Picup fue desarrollado originalmente para estudiar complejos estables de proteínas 2. El método fue aplicado más tarde para el estudio cuantitativo de las asambleas metaestable proteína amiloide, incluyendo Aß 10, priones y las enfermedades asociadas a PrP Sc 11, y α-sinucleína 12. Los factores más importantes que deben considerarse al diseñar un experimento picup son la estequiometría reactivo, tiempo de irradiación, y el procedimiento de preparación de la muestra. Las dos primeras cuestiones pue...

<table><tbody><tr><td>Lámpara incandescente Dolan-Jenner de 200 W</td><td>Otro</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td>Modelo 170-D</td><td>El calor generado por la lámpara d&amp;#8211;no afecta las muestras durante períodos cortos de incubación.</td></tr><tr><td>cuerpo de cámara réflex de 35 mm</td><td>Herramienta</td><td>Pentax</td><td>modelo SP500</td><td>En nuestras condiciones, se acopla un fuelle al cuerpo de la cámara para proporcionar una cámara conveniente para la irradiación de la muestra colocada a 10 cm de distancia de la fuente de luz.</td></tr><tr><td>Tubos PCR transparentes de paredes delgadas</td><td>Otro</td><td>Eppendorf</td><td>951010006 suministrado por Fisher L22-003-24</td><td></td></tr><tr><td>Viales de vidrio (1,8 mL)</td><td>Otro</td><td>Kimble Chase</td><td>60940A 2, suministrado por Fisher 03-340-60</td><td></td></tr><tr><td>GRF</td><td>Reactivo</td><td>Bachem</td><td>H-3695</td><td></td></tr><tr><td>HFIP</td><td>Reactivo</td><td>TCI America</td><td>H0424</td><td>Utilice en una campana extractora.</td></tr><tr><td>A&amp;#946;40 y A&amp;#946;42</td><td>Reactivo</td><td>Laboratorio de Biopolímeros de la UCLA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcitonina</td><td>Reactivo</td><td>American Peptide</td><td>22-1-10</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2,2-bipiridil)dicrocoruto(II) hexahidrato</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>224758-1G</td><td>Agite en vórtex hasta que la solución esté clara. Cubra el tubo de RuBpy con papel de aluminio para proteger el reactivo de la luz ambiental. El RuBpy se prepara fresco cada vez y debe usarse dentro de las 48 h.</td></tr><tr><td>Peroxidisulfato de amonio</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-7460</td><td>Agite en vórtex hasta que la solución esté clara. El APS se prepara fresco cada vez y debe usarse dentro de las 48 h. </td></tr><tr><td>&amp;#946;-mercapto&amp;#8211;etanol</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7154-25 ML</td><td>Puede utilizarse cuando se realiza el análisis mediante SDS-PAGE.</td></tr><tr><td>Novex Tricine SDS Sample Buffer (2x)</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>LC1676</td><td></td></tr><tr><td>XCell &lt;i&gt;SureLock&lt;/i&gt; Mini-célula</td><td>Herramienta</td><td>Invitrogen</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Geles Novex Tricine (10-20 %)</td><td>Otro</td><td>Invitrogen</td><td>EC6625B0X</td><td></td></tr><tr><td>Novex Tricine SDS Running Buffer (10x)</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>LC1675</td><td></td></tr><tr><td>Kit de tinción Silver Express</td><td></td><td>Invitrogen</td><td>LC6100</td><td></td></tr></tbody></table>

foto-inducido el entrecruzamiento de las proteínas sin modificar (picup) aplicada a los péptidos amiloidogénicas

Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides

El ensamblaje de las proteínas amiloidogénica en oligómeros tóxicos es un acontecimiento fundamental en la patogénesis de las enfermedades de mal plegamiento de proteínas, como el Alzheimer, el Parkinson y las enfermedades de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica hereditaria, y la diabetes tipo 2. Debido a la naturaleza metaestable de estos conjuntos de proteínas, es difícil evaluar su distribución de tamaño de oligómero cuantitativamente mediante los métodos clásicos, como la electroforesis, cromatografía de dispersión de la luz, fluorescencia, o dinámica. Oligómeros de proteínas amiloidogénica existen como mezclas metaestable, en el que los oligómeros se disocian en monómeros y asociarse en grandes asambleas de forma simultánea. Picup estabiliza la población oligómero por covalentes entrecruzamiento y cuando se combina con los métodos de fraccionamiento, como la electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio poliacrilamida (SDS-PAGE) o el tamaño de cromatografía de exclusión (SEC), ofrece picup instantáneas de la distribución de oligómeros de tamaño que existía antes de cruzar -linking. Por lo tanto, picup permite la visualización y el análisis cuantitativo de las poblaciones de proteínas metaestable y puede ser usado para monitorear el montaje y descifrar las relaciones entre las modificaciones de la secuencia y oligomerización<sup&gt; 1</sup&gt;. Mecánica, picup implica la foto-oxidación de Ru<sup&gt; 2 +</sup&gt; En un tris (bipiridilo) Ru (II) (RuBpy) a Ru<sup&gt; 3 +</sup&gt; Por irradiación con luz visible con la presencia de un aceptor de electrones. Ru<sup&gt; 3 +</sup&gt; Es un fuerte oxidante de un electrón capaz de abstraer un electrón de una molécula de proteína vecinos, generando una proteína radical<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Los radicales son inestables y altamente reactivas y por lo tanto las especies desaparecen rápidamente a través de una variedad de reacciones intra e intermoleculares. Un radical puede utilizar la energía de un electrón no apareado para reaccionar con otro monómero proteína que forma un dímero radical, que posteriormente se pierde un átomo de hidrógeno y forma un estable, covalentemente ligado al dímero. El dímero puede reaccionar más a través de un mecanismo similar con monómeros o dímeros para formar oligómeros de orden superior. Ventajas de la relación picup a otros foto-químicos o métodos de entrecruzamiento<sup&gt; 3,4</sup&gt; Son cortas (≤ 1 s) la exposición de controles no destructivos de luz visible, sin necesidad de<i&gt; Pre facto</i&gt; Modificación de la secuencia nativa, y de longitud cero covalentes de entrecruzamiento. Además, picup permite el entrecruzamiento de las proteínas dentro de pH y temperatura, incluyendo los parámetros fisiológicos. Este sentido, demuestran la aplicación de picup de entrecruzamiento de tres proteínas amiloidogénica los 40 - y 42-residuo de proteína amiloide β-variantes (Aβ40 y Aß42), y la calcitonina, y una proteína de control, la hormona del crecimiento factor liberador (GRF).

Foto-inducido de entrecruzamiento de las proteínas sin modificar (picup) permite la caracterización de la distribución del tamaño de oligómero de mezclas de proteínas metaestable. Se demuestra la aplicación de picup a tres péptidos representante amiloidogénica los 40 - y 42-residuo forma de amiloide β-proteína, y la calcitonina, y un péptido de control de la hormona del crecimiento factor de liberación.

Foto-inducido el entrecruzamiento de las proteínas sin modificar (picup) aplicada a los péptidos amiloidogénicas

El ensamblaje de proteínas amiloidogénicas en oligómeros tóxicos es un evento fundamental en la patogénesis de las enfermedades por plegamiento incorrecto de proteínas, incluyendo el Alzheimer, ...

Se cree que los oligómeros solubles de proteínas amiloidogénicas, mediante sus propiedades citotóxicas, son la base de la fisiopatología de las enfermedades neurodegenerativas. Estos oligómeros se forman y disocian continuamente cuando están en solución, un hecho que complica los estudios estructurales, cruciales para el desarrollo de moléculas inhibidoras que permitan evitar este problema.Se utiliza el entrecruzamiento inducido por luz de proteínas no modificadas o pickup. Este método implica la exposición de péptidos amiloidogénicos desagregados y solubilizados a reactivos de entrecruzamiento y un pulso de un segundo de luz intensa para unir covalentemente los dímeros y los allers. Luego, la distribución del tamaño de los allers puede analizarse mediante técnicas bioquímicas estándar.Hola, soy Far Rahimi del Laboratorio Batan en el Departamento de Neurología de la Universidad de California en Los Ángeles. Soy Al Mai del Laboratorio Bean. Hoy les mostraremos un procedimiento para la reticulación inducida por luz de proteínas no modificadas.Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para generar oligómeros estabilizados de la proteína beta amiloide y estudiar las modificaciones estructurales en la distribución de oligómeros. Este procedimiento fue publicado inicialmente por Fancy y Coate para estudiar complejos proteicos estables. Posteriormente, el método fue aplicado por Battan y otros para el estudio cuantitativo de ensamblajes de proteínas amiloides metaestables, incluyendo priones beta y alfa-sinucleína.Así que comencemos. Para iniciar el protocolo, se agrega HEXA fluoruro ISOPROPANOL o HFIP, que se ha enfriado previamente en hielo, a un tubo recubierto de silicona y de baja absorción que contiene de uno a 200 microgramos de péptido liofilizado, de modo que la concentración final sea aproximadamente 0.5.El HFIP milimolar evita que los péptidos amiloidogénicos se agreguen y mejorará la consistencia de los resultados. Ahora someta el tubo del péptido a sonicación durante cinco minutos, a temperatura ambiente.Una vez finalizada la sonicación, agite suavemente los tubos mediante vórtex y déjelos incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, enfríe los péptidos en hielo durante un minuto. Los péptidos enfriados ya pueden dividirse en alícuotas de 10 a 50 microlitros en tubos de 0,6 mil con baja absorción.A continuación, coloque los tubos en la campana con las tapas retiradas. Para permitir que el HFIP se evapore durante la noche, envuelva el soporte de tubos y las toallas Kim para evitar que el polvo se deposite en los tubos. Una vez que se haya evaporado la mayor parte del HFIP, cualquier residuo debe eliminarse colocando los tubos en un desecador bajo vacío durante dos horas.El producto final es una capa delgada de película de péptido dentro de los tubos. Estos tubos pueden almacenarse durante meses a menos 20 o menos 80 grados Celsius. Para iniciar los pasos de solubilización y reticulación fotoquímica, primero se disuelve la película de péptido en una solución de hidróxido de sodio diluido.Después de agregar el hidróxido de sodio, se añade agua desionizada y luego tampón fosfato; la solución final debe contener 45 % de tampón fosfato, 45 % de agua y 10 % de solución de hidróxido de sodio. Si queda una película residual de proteína en la pared del tubo, raspe para incorporarla a la solución. Utilizando la punta de una pipeta, aspire y expulse los péptidos en suspensión varias veces y luego someta la mezcla a sonicación en un baño ultrasónico Sonica durante uno o dos minutos.Después de la sonicación, agregue la solución de fosfato y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Luego, centrifugue el tubo a 16.000 G durante 10 minutos. Mientras la centrífuga está girando, prepare la cámara para los pasos de reticulación fotográfica.El retraso del obturador de la cámara debe ajustarse a un segundo y el obturador debe cargarse. Una vez que las tubos hayan terminado de centrifugarse, prepare alícuotas de 18 microlitros de la solución de péptidos en tubos PCR transparentes de 0,2 ml. Estas alícuotas se utilizarán para la fotoenlace cruzado.Asegúrese de reservar algo de la solución de péptido para utilizarla como control negativo justo antes del entrecruzamiento. Añada un microlitro de sulfato de amonio y un microlitro de rutenio. Ahora coloque rápidamente el tubo dentro de un vial de vidrio de 1,8 M y coloque el vial dentro del fuelle conectado al frente del cuerpo de la cámara.Cierre la cámara con el protector de lente y presione el obturador. Ahora la muestra se irradia durante un segundo. En tiempos de irradiación más largos, las reacciones radicales extensivas provocan la degradación de proteínas.Una vez irradiado, recupere rápidamente el tubo PCR de 0,2 mil y agregue 10 microlitros de tampón de muestra para electroforesis preparado previamente que contenga beta-mercaptoetanol. Los péptidos entrecruzados pueden almacenarse hasta siete días a menos 20 grados Celsius. Antes de la electroforesis SDS-PAGE, la fraccionación y la tinción con plata.Para examinar los péptidos entrecruzados, se puede utilizar rutinariamente la electroforesis en gel SDS y la tinción con plata para estimar los volúmenes que debe cargar; cinco microlitros de la mezcla de reacción deben producir aproximadamente 130 picomoles de péptido. Se recomienda usar el sistema Xcel Sherlock mini cell de in Vitrogen para la electroforesis en gel y realizar la tinción con plata. Según la publicación de in Vitrogen, IM 1 0 0 2, guía de electroforesis en geles precargados NOx, analice su gel SDS tras la tinción con plata; el control del polipéptido no entrecruzado, GRF, se desplaza principalmente como un monómero.El GRF reticulado produce una distribución continua de todos los tamaños de agregados que va desde el dímero hasta el hexámero, de tal manera que la intensidad aparente relativa de las bandas de oligómeros disminuye exponencialmente con el aumento de la masa molecular. La calcitonina sin reticulación se desplaza principalmente como monómero y en parte como dímero. La calcitonina reticulada produce una distribución de tamaños de agregados que diverge fuertemente de una disminución exponencial monótona en la región.Mónomero hasta tetrámero, lo que sugiere la preexistencia de dímeros, trímeros y tetrámeros sin entrecruzar. Una beta 40 se desplaza únicamente como un monómero; se detectó una Beta 40. Todas las ligaduras muestran intensidades de banda aproximadamente similares desde el monómero hasta el tetrámero, seguidas por una disminución en la abundancia de ligaduras más altas.Un producto cruzado. La beta 42 produce predominantemente dos bandas, una banda de monómero y una banda de trímero. La banda de tetrámero es un artefacto producido por la electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS tras entrecruzamiento.El A Beta 42 muestra una distribución de tamaños de olímeros claramente definida que comprende dos grupos. El primer grupo, del monómero al trímero, presenta una intensidad decreciente con el aumento del orden de olímeros. En el segundo grupo, se observa una distribución similar a un pico entre el tetrámero y el heptámero, con un máximo en pentámero y hexámero.Acabamos de mostrarle cómo entrecruzar la proteína utilizando pika mediante este procedimiento. Es importante recordar que cuando utilizamos una proteína amiloydógena, debemos asegurarnos de que las preparaciones estén libres de agregados para obtener resultados reproducibles. Las condiciones mostradas aquí y estos experimentos pueden modificarse experimentalmente según los iones de interés. Eso es todo.Gracias por ver el video y buena suerte al utilizar el experimento de recolección.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Los aptámeros son ribo-/deoxyribo-oligonucleotides corto seleccionado...

Selección de los aptámeros de amiloide β-proteínas, el agente causante de la enfermedad de Alzheimer

Las proteínas pueden adoptar una estructura nativa o plegarse erróneamente en amiloide insoluble. Las condiciones que favorecen la vía de plegamiento incorrecto conducen a la formación de diferentes tipos de fibrillas amiloides. Los métodos aquí descritos permiten la rápida conversión de proteínas nativas en amiloide in vitro.

Rápida generación de amiloide a partir de proteínas nativas in vitro

Mientras se estudia de forma relativamente fácil el transporte de proteínas de superficie celular, visualizando el tráfico de proteínas intracelulares es mucho más difícil. Aquí, utilizamos construcciones que incorporen buenas prácticas agrarias fotoactivable y demostrar un método para seguir con precisión la proteína precursora de amiloide del aparato de Golgi compartimentos río abajo y siga su aclaramiento.

Imágenes del tráfico intracelular de APP con GFP fotoactivable

El amiloide-β (Aß): se inyecta modelo animal permite la administración de una cantidad y especies de fragmentos Aß definido y reduce las diferencias individuales dentro de cada grupo de estudio. Este protocolo describe la inyección intracerebroventricular (ICV) de Aß sin instrumentos de estereotaxia, permitiendo la producción de anomalías en el comportamiento de Alzheimer como en ratones normales.

La inyección intracerebroventricular de péptidos beta-amiloide en ratones normales para inducir de forma aguda déficits cognitivos como la enfermedad de Alzheimer,

Aquí nos presenta un protocolo de purificación por HPLC a medida que los rendimientos de alta pureza beta amiloide 42 (? 42) y beta amiloides 40 (AP40), apto para la formación de oligómeros. El amiloide beta es un péptido altamente propensos agregación, hidrófoba implicada en la enfermedad de Alzheimer. La naturaleza del péptido amiloidogénico hace su purificación un desafío.

Un protocolo de purificación HPLC Tailored que los rendimientos de alta pureza beta amiloide 42 y 40 péptidos beta amiloide, capaz de Formación de oligómeros

Deposición amiloidea es una seña de identidad de distintas enfermedades y afecta a muchos órganos diferentes. Este trabajo describe la aplicación de la fluorescencia oligothiophene conjugado luminiscente tinción en combinación con técnicas de microscopía de fluorescencia. Este método de coloración representa una poderosa herramienta para la detección y exploración de agregados proteicos en ajustes clínicos y científicos.

Imagen tejidos amiloides manchado con Oligothiophenes conjugado luminiscente por hiperespectral Confocal la microscopia y la proyección de imagen de toda la vida de la fluorescencia

Un análisis simplista de la fluorescencia se presenta para evaluar la eficiencia de amino-acil-tRNA-sintetasa/tRNA pares no-canónico-aminoácidos (ncAAs) incorporar las proteínas expresadas en células de mamíferos. Se describe la aplicación de ncAAs estudiar receptores acoplado proteína G (GPCRs), incluida la asignación de foto-reticulación de enlace sitios bioorthogonal GPCR etiquetado en células vivas.

Optimizar la incorporación genética de química sondas en GPCRs para foto-reticulación asignación y la química de Bioorthogonal en células de mamífero vivo

Este protocolo describe cómo preparar oligómeros de Aß de un péptido sintético en vitro y evaluar cantidades relativas de oligómero Aβ mediante un punto de análisis el borrar.

A11-positivo β-amiloide oligómero preparación y evaluación mediante Dot blot análisis

Un protocolo para la síntesis de un 1, 2-dithiolane modificada de péptidos y la caracterización de las estructuras supramoleculares resultantes del peptide uno mismo-Asamblea.

Síntesis y caracterización de 1, 2-Dithiolane modifican uno mismo-montaje de péptidos

Este artículo describe cómo se podría aplicar la microscopía de dos fotones sensible a la polarización para caracterizar la organización local dentro de las superestructuras de amiloide sin marcado-esferulitas. También describe cómo preparar y medir la muestra, ensamblar la configuración requerida y analizar los datos para obtener información sobre la organización local de las fibrillas amiloides.

Microscopía de dos fotones sensible a la polarización para una caracterización estructural amiloide sin marcadores

Aquí, presentamos un método sistemático que describe el autoensamblaje cuasi-reversible de los agregados de oro de 20 nm recubiertos de beta amiloide 1-40 (Aβ 1-40). La red cuasi-reversible dependiente del tamaño nanométrico entre péptidos se correlacionó con aminoácidos específicos o secciones del monómero Aβ 1-40.

Caracterización del autoensamblaje reversible dependiente del pH de coloides de oro recubiertos de beta amiloide 1-40

Aprende el método PICUP para analizar la distribución de oligómeros en péptidos amiloidogénicos usando luz intensa. Esta técnica permite estudiar las propiedades estructurales de proteínas implicadas en enfermedades neurodegenerativas.

Foto-inducido el entrecruzamiento de las proteínas sin modificar (picup) aplicada a los péptidos amiloidogénicas

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