Name: Estudio in bioensayo para la medición específica de tejido de mediadores inflamatorios y nociceptivos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Aprende a usar microdialisis para recolectar fluido intersticial en piel inflamada experimentalmente. Este método permite analizar mediadores nociceptivos e inflamatorios en estudios de dolor humano.

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La inducción de la inflamación experimental: <ol><li> Una quemadura de primer grado se induce en la piel no curtida de un muslo con ayuda de un calibrado, la fuente de los rayos ultravioleta B (Saalmann Multitester SBB LT 499, Saalmann GmbH, Hereford, Alemania). La quemadura solar es inducida por 24 horas antes de iniciar un experimento de microdiálisis mediante la aplicación de tres veces la cantidad de luz UVB necesaria para causar enrojecimiento completa de la piel expuesta, o tres veces la dosis mínima de eritema (MED). El MED se determina en cada tema antes de iniciar el estudio. La entrega precisa de la energía está asegurada con un medidor de UV (RM 12, el Dr. Grobel UV-Electronic GmbH, Ettlingen, Alemania). </li></ol> Catéter de colocación y recogida de muestras: <ol><li> Prepare un área de ensayo con guantes estériles, un porta-agujas estériles, jeringas de 1 cc punta luer con un calibre 23 (G) de aguja, la jeringa de 1 cc con una aguja 30G, lidocaína al 1%, algodones con alcohol, gasas estériles de 2x2, los catéteres de microdiálisis conectado a un fin a una aguja de 4 cm de 23G (diálisis dérmica, Erlangen, Alemania), y tubos de 1,5 ml Microcent colección (E &amp; K Científico, Santa Clara, CA.) con una solución de 4μl inhibidor de la proteasa por muestra 100μl en hielo seco. solución de inhibidor de la proteasa se hace según las instrucciones del fabricante, utilizando comprimidos de cóctel de inhibidores de la proteasa (Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Alemania). </li><li> Prepare una solución al 1% de albúmina humana en solución de Ringer lactato y dibujarlo en la punta de la jeringa de 1cc luer, asegurándose de que no haya burbujas de aire que queda en la jeringa. </li><li> Cargue la jeringa con el 1% de albúmina humana enriquecida con solución de Ringer lactato en la cuna (microdiálisis multi-jeringa rack, Harvard Apparatus, Natick del Sur, MA) montado en una bomba de precisión de la infusión de alto (la bomba 22, Harvard Apparatus, South Natick, MA ). Asegúrese de que la barra de la bomba de infusión de conducción de la jeringa se encuentra en pleno contacto con el émbolo de la jeringa. Establecer la velocidad de la bomba después de confirmar que el diámetro de la jeringa ha sido exactamente entró en la bomba. Comúnmente utilizado las tasas de infusión oscila entre 2 a 4μl/min. </li><li> Definir el área que el plan para recoger la muestra de. Cuando el muestreo de un área creada artificialmente inflamada, como la quemadura de sol se ha descrito anteriormente, el plan de inserción del catéter en el borde de la quemadura. </li><li> Limpiar un área pequeña en los bordes opuestos de la lesión, o en el sitio tiene la intención de tomar la muestra de, con el alcohol. Estas áreas ya limpias se pretende la inserción y puntos de salida del catéter. Inyectar suficiente lidocaína intra-cutánea (evidenciado por la palidez de la piel de inyección) en estos sitios para crear una ampolla muy pequeña (máximo de 2 mm). La inyección de dicha cantidad limitada de intra-cutánea de lidocaína en la entrada y salida del catéter de microdiálisis no debe alterar los resultados de los bioensayos, pero hace que la inserción del catéter significativamente menos doloroso para los sujetos de estudio. </li><li> Utilizando las técnicas de asepsia, inserte los catéteres de microdiálisis con la ayuda de la aguja de 23G unida a lo largo de la zona de la piel explorado. La profundidad de inserción se encuentra en la interfaz entre el cutis y el tejido subcutáneo. Inserción a una profundidad adecuada se puede verificar de forma óptica. A medida que la aguja y el catéter conectado se mueven hacia delante de la aguja debe causar un poco más arriba-pliegue de la piel, así como algunos blanqueo de la piel. No debe ocurrir sangrado. Si se produce una hemorragia, esto indica que la aguja se encuentra más profunda de lo previsto y la profundidad de inserción tiene que ser ajustada. Una vez que la aguja ha sido empujado a través del punto de salida de la piel, lavar los catéteres con albúmina al 1% enriquecido solución de Ringer lactato hasta que vea las gotas a lo largo de la longitud del catéter. Esto se hace introduciendo cuidadosamente el extremo de la aguja de una jeringa (aguja 23G) en el extremo distal del catéter de microdiálisis, e inyectando lentamente la solución. </li><li> Después de lavar el catéter tire suavemente de la aguja para alimentar a la sonda conectada a través de la piel. Un manejo cuidadoso es necesario porque los catéteres de diámetro pequeño y frágil en consecuencia. Tirar el catéter hasta que esté completamente pasa a través de la piel, es decir, la base del tubo de plástico más grandes incorporación del extremo distal del catéter toca la piel en el punto de entrada. Como se mencionó anteriormente, poco o ningún sangrado al final del procedimiento confirma la colocación del catéter óptimo. </li><li> Conecte el extremo distal del catéter hasta la punta de la aguja 23G de la jeringa en reposo en el bastidor de la bomba de infusión. Es necesario tener cuidado para evitar la punción de la aguja a través de la pared de la sonda, lo que causa las posibilidades de fuga. </li><li> Corte la aguja del extremo proximal del catéter. </li><li> El uso de ¼ de pulgada de cinta de color rosa, conecte el tubo de 1,5 ml preparados colección Microcent en la piel cerca del sitio de salida del catéter. Coloque la punta del catéter en el tubo de recogida que permita la recogida de microdialysate. En marcha la bomba de perfusión en r predeterminadocomieron y de forma intermitente comprobar que el volumen de entrega y recogida coinciden. En el caso de los volúmenes no coinciden, la fuga del sitio de entrada la piel debe ser excluido (a veces se puede resolver tirando de la parte del catéter que se inserta en el tubo de plástico con más fuerza en el sitio de entrada de la piel). Por otra parte, un catéter puede necesitar ser reemplazada si los volúmenes de entrega y recogida no coinciden. </li><li> Una vez efectuada la toma, las muestras se colocaron en hielo seco hasta su almacenamiento a -80 º C. </li></ol>

<ol><li>Angst, M. S., Clark, J. D., Carvalho, B., Tingle, M., Schmelz, M., Yeomans, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+profile+in+human+skin+in+response+to+experimental+inflammation%2C+noxious+stimulation+and+administration+of+a+COX-inhibitor%3A+A+microdialysis+study%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Cytokine profile in human skin in response to experimental inflammation, noxious stimulation and administration of a COX-inhibitor: A microdialysis study.</a> Pain. 139, 15-27 (2008).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El uso combinado de técnicas de microdiálisis y la tecnología de inmunoanálisis multiplex es un valor en tiempo real, en vivo bioensayo humanos proporcionando información sobre los eventos bioquímicos en el tejido de interés. En combinación con las pruebas de comportamiento, tales como pruebas de dolor, el método permite el estudio de las complejas interacciones bioquímicas de la mediación del dolor y la inflamación. El método es prometedor para 1) la identificación de biomarcadores específicos de tejido mediar el dolor y la inflamación, 2)...

<table><tbody><tr><td>Catéter de microdiálisis</td><td>Herramienta</td><td>Dialisis dérmica</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Bomba 22</td><td>Herramienta</td><td>Harvard Apparatus</td><td>552219</td><td></td></tr><tr><td>Saalmann Multitester SBB LT 400</td><td>Herramienta</td><td>Saalmann GmbH</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Radiómetro RM-12 IP-65</td><td>Herramienta</td><td>Dr. Grobel UV Elektronik GmbH</td><td>82120000/81112100</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor completo de proteasas</td><td>Reactivo</td><td>Roche Group</td><td>11836145001</td><td></td></tr><tr><td>Tubo microcéntrifugo</td><td>Herramienta</td><td>E&amp;amp;K Scientific</td><td>380150-X</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina al 5 %</td><td>Reactivo</td><td>ZLB Behring</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Ringer lactato</td><td>Reactivo</td><td>Hospira Inc.</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Xylocaine-MPF</td><td>Otro</td><td>AstraZeneca</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 1 mL</td><td>Herramienta</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr></tbody></table>

estudio in bioensayo para la medición específica de tejido de mediadores inflamatorios y nociceptivos

Human In-Vivo Bioassay for the Tissue-Specific Measurement of Nociceptive and Inflammatory Mediators

Este bioensayo humana in vivo puede ser utilizado para estudiar voluntarios y pacientes. Las muestras se recogen de los sitios de los tejidos pertinentes, tales como la piel a través de catéteres de microdiálisis asépticamente insertado (diálisis dérmica, Erlangen, Alemania). Muestra en este ejemplo es la colección de líquido intersticial de la piel inflamada forma experimental en voluntarios humanos. La recogida de muestras se puede combinar con otras pruebas experimentales. Por ejemplo, la evaluación simultánea de productos bioquímicos liberados localmente y la sensibilidad subjetiva a los estímulos dolorosos en la piel inflamada experimental proporciona la crítica bioquímicos-conductual enlace para identificar biomarcadores de inflamación y dolor. Ensayo presentado en el organismo humano vivo permite visión mecanicista de los procesos específicos de tejido subyacente del dolor y / o la inflamación. El método también es adecuado para examinar la efectividad de las intervenciones existentes o nuevas - tales como los nuevos medicamentos - objetivo el tratamiento de dolor y / o inflamatorios. En este artículo se proporcionará una descripción detallada sobre el uso de técnicas de microdiálisis para recoger el líquido intersticial de la lesión de la piel inflamada forma experimental los sujetos de estudio humanos. Muestras de fluido intersticial son procesados ​​con la ayuda de los inmunoensayos multiplex serie de cuentas que permite ensayar hasta 100 analitos en muestras tan pequeñas como en el volumen de 50 microlitros.

Una técnica se presenta para la colección en vivo de las muestras de líquido intersticial del tejido de los sitios pertinentes (la piel aquí, experimentalmente inflamación) para la medición de sustancias bioquímicas mediar el dolor y la inflamación.

Estudio in bioensayo para la medición específica de tejido de mediadores inflamatorios y nociceptivos

Este bioensayo humano in vivo puede utilizarse para estudiar voluntarios y pacientes humanos. Las muestras se recogen de sitios tisulares pertinentes, como la piel, mediante...

Este video comienza 24 horas después de la inducción de una quemadura solar experimental en el muslo de un paciente, utilizando una fuente de luz UV calibrada. Tras la aplicación de anestesia local, se inserta un catéter de microdiálisis entre los cortes y el tejido subcutáneo, y luego se extrae a través de la piel. Se conecta una jeringa de perfusión al extremo proximal del catéter, y la activación de la bomba de perfusión inducirá el flujo y la recopilación del lisado microdiálico.Las muestras recogidas pueden almacenarse a menos 80 grados Celsius hasta que se esté listo para realizar el análisis de mediadores nociceptivos e inflamatorios. Hola, soy Martin Angst del Departamento de Anestesiología de la Universidad de Stanford. Y hola, soy Martha Tingle, enfermera investigadora sénior y directora del Laboratorio de Dolor Humano, fundado por el Dr. Angst en 1995 aquí en la Universidad de Stanford.Hoy les mostraremos un procedimiento para la colocación de catéteres de microdiálisis en piel inflamada experimental de participantes humanos del estudio, con el fin de recolectar líquido intersticial. Utilizamos esta técnica en nuestro laboratorio para estudiar la liberación específica de tejido de sustancias bioquímicas fundamentales para la mediación del dolor y la inflamación. Así que comencemos.Un modelo de inflamación cutánea experimental es la quemadura solar artificial. Se induce una quemadura solar de primer grado con la ayuda de una fuente calibrada de ultravioleta B. La administración precisa de energía se asegura con un medidor de UV.La quemadura solar se induce típicamente aplicando de dos a tres veces la cantidad de luz UVB necesaria para causar enrojecimiento. Antes de recolectar las muestras, prepare un área de trabajo con guantes estériles, un portaabrazadera estéril y jeringas de punta luer de un cc con agujas de calibre 23 y calibre 30. También necesitará catéteres de microdiálisis conectados en un extremo a una aguja de calibre 23 de cuatro centímetros. Las muestras se recolectarán en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contengan cuatro microlitros de solución inhibidora de proteasas por cada muestra de 100 microlitros. La solución inhibidora de proteasas se prepara según las instrucciones del fabricante utilizando tabletas de cóctel inhibidor de proteasas. Prepare una solución de albúmina humana al 1 % en solución de Ringer con lactato y sáquela en la jeringa de punta luer de un cc, asegurándose de que no queden burbujas de aire en la jeringa. Coloque la jeringa con la solución de Ringer con lactato enriquecida con albúmina humana al 1 % en el soporte montado en una bomba de infusión de alta precisión. Se pueden cargar varias jeringas para obtener simultáneamente muestras de líquido intersticial de diversos sitios.Asegúrese de que la barra de la bomba de infusión que acciona la jeringa esté en contacto completo con el émbolo de la jeringa. Establezca la velocidad de la bomba tras confirmar que el diámetro de la jeringa se ha introducido con precisión en la bomba. Las velocidades de infusión comúnmente utilizadas oscilan entre dos y cuatro microlitros por minuto.Ahora está listo para colocar el catéter antes de la colocación del catéter. El área de la que se recogen las muestras debe definirse al tomar muestras de una zona inflamada artificialmente, como una quemadura solar inducida experimentalmente. Planifique la inserción del catéter en el borde de la quemadura solar.Limpie un área pequeña en los bordes opuestos de la lesión o del sitio C del que tiene la intención de recolectar la muestra, utilizando torundas con alcohol; estas áreas limpias serán los puntos previstos de inserción y salida del catéter. Utilizando una jeringa de un cc con aguja de calibre 30, inyecte lidocaína al 1 %, evidenciada por el levantamiento de la piel durante la inyección; inyecte solo la cantidad suficiente de lidocaína en estos sitios para crear una bleb muy pequeña, con un tamaño máximo de dos milímetros. Inyectar una pequeña cantidad de lidocaína en los puntos de entrada y salida del catéter de microdiálisis hace que la inserción del catéter sea menos dolorosa para los sujetos, pero no debería afectar los resultados del bioensayo, utilizando técnicas asépticas.Inserte los catéteres de microdiálisis con la ayuda de la aguja de calibre 23 adjunta a lo largo de la extensión del área de piel explorada. La profundidad de inserción debe estar en la interfase entre la piel y el tejido subcutáneo. La penetración adecuada puede verificarse visualmente mientras se avanza la aguja junto con el catéter acoplado.La aguja debe provocar un ligero pliegue hacia arriba de la piel, así como un ligero enrojecimiento. No debe producirse sangrado; si ocurre, significa que la aguja se encuentra más profunda de lo previsto y es necesario ajustar la profundidad de inserción.Una vez que la aguja haya atravesado el punto de salida de la piel, tire suavemente de la aguja para introducir el catéter conectado a través de la piel. Es fundamental manejar con cuidado porque los catéteres tienen un diámetro pequeño y son muy frágiles. Tire del catéter hasta que esté completamente introducido a través de la piel, es decir, hasta la base del tubo plástico más grande.El extremo distal del catéter insertado debe tocar la piel en el punto de entrada. Nuevamente, debe ocurrir poca o ninguna hemorragia, lo que indica que el catéter se ha colocado correctamente. Para comenzar la recolección de la muestra, primero lave los catéteres con solución de ringer lactato enriquecida con albúmina al 1 %.Esto se realiza insertando cuidadosamente una jeringa con una aguja de calibre 23 en el extremo distal del catéter de microdiálisis e inyectando lentamente la solución. Lave el catéter hasta observar gotas a lo largo de su longitud, así como en su extremo distal. Tras lavar el catéter, conecte el extremo distal del catéter a la punta de la aguja de calibre 23 de la jeringa que está colocada en el soporte de la bomba de infusión.Evite perforar con la aguja la pared del catéter, ya que podría provocar fugas utilizando cinta rosa de un cuarto de pulgada. Coloque el tubo colector microcéntrifugo de 1,5 mililitros preparado sobre la piel, cerca del lado de salida del catéter. Introduzca la punta del catéter en el tubo colector para permitir la recolección del lisado micro.Inicie la bomba de perfusión a la velocidad predeterminada y revise periódicamente que el volumen administrado y el volumen recogido coincidan en caso de que los volúmenes no coincidan. Verifique si hay fugas en el punto de entrada en la piel. A veces, las fugas en el sitio pueden resolverse tirando con más fuerza del tramo del catéter que está insertado mediante el tubo de plástico hacia el punto de entrada en la piel.Alternativamente, puede ser necesario reemplazar un catéter si los volúmenes entregados y recogidos no coinciden una vez completado el muestreo. Las muestras se colocan sobre hielo seco hasta su almacenamiento a menos 80 grados Celsius.Acabamos de mostrarle cómo recolectar líquido intersticial de piel inflamada experimental mediante catéteres de microdiálisis. Ahora estamos listos para analizar las muestras obtenidas mediante ensayos inmunológicos para detectar marcadores bioquímicos del dolor y la inflamación. Al realizar este procedimiento, es importante manipular los catéteres con mucha precaución, avanzarlos lentamente manteniendo la tensión fuera del tubo, y puede ser útil lubricar los catéteres antes de la inserción con un poco de la solución estéril que ha preparado para la fase de infusión del estudio.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Una técnica para recoger y medir los mediadores bioquímicos de la herida quirúrgica en momentos específicos.

La recogida y medición de mediadores inflamatorios y nociceptivos en las heridas quirúrgicas

Algoritmos de evaluación de los umbrales de dolor mecánico y el calor en la piel inflamada forma experimental los sujetos de estudio humanos se muestran. Los dos paradigmas dolor prueba independiente examine el procesamiento nociceptivo por las dos principales poblaciones periféricas de fibras nerviosas de la transmisión del dolor, es decir, no mielinizadas fibras C y pequeñas mielinizadas fibras A-delta.

Determinar el calor y el umbral de dolor mecánico en la piel inflamada de los sujetos humanos

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Cuantificación de mediadores inflamatorios en células derivadas de tejidos humanos infectados

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