Drosophila larval NMJ Disección
4 de febrero de 2009
Este protocolo muestra cómo diseccionar Drosophila Larvas en la preparación de inmunohistoquímica y / o imágenes de la unión neuromuscular.
Este procedimiento comienza con la colocación de una larva de tercer estadio en la placa de disección. Los alfileres se colocan en los extremos posterior y anterior de las larvas. Se utilizan tijeras para abrir las larvas y fórceps para extraer los órganos internos.
Finalmente, se colocan cuatro alfileres más en cada esquina de la pared del cuerpo de la larva para mantenerla tensa durante la fijación. Hola, soy Jonathan Brent del laboratorio de Brian McCabe en el Departamento de Fisiología y Biofísica del Colegio de Médicos y Cirujanos de la Universidad de Columbia. Hoy te mostraremos el procedimiento para la disección de larvas de Drosophila y MJ.
Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar el desarrollo sináptico de la unión neuromuscular. Así que comencemos. En las larvas de Drosophila, hay 30 músculos por segmento de hemi cuya disposición dentro de la pared periférica del cuerpo se conoce.
Un total de 35 neuronas motoras inervan estos músculos en un patrón muy estereotipado. Para acceder a la unión neuromuscular o NMJ, es necesario diseccionar cuidadosamente cada larva con una disección adecuada. La NMJ se puede utilizar para obtener imágenes, inmunohistoquímica o electrofisiología.
Comience el procedimiento colocando una gota de tampón HL 3.1 en una placa de disección. El tampón se fabrica con anticipación y se enfría con hielo. Escoja con cuidado una larva de estrella del tercer extremo errante del costado del frasco con pinzas SS grandes.
El movimiento indica que las larvas no han entrado en la pupación: Coloque las larvas con el lado dorsal hacia arriba en la gota de amortiguación en la placa de disección. El tampón frío anestesiará a las larvas y las mantendrá quietas con fórceps. Coloque un alfiler de mnuchin entre las esféricas posteriores, luego coloque un segundo alfiler cerca de los ganchos de la boca oscura para que las larvas se estiren y estén listas para abrirse.
Con unas tijeras de resorte, haga una pequeña incisión horizontal hacia el extremo posterior de las larvas. Inserta una hoja de las tijeras en la cigüeya y haz un corte longitudinal hacia el extremo anterior de la larva. Luego, haga incisiones horizontales en el extremo anterior de las larvas a la izquierda y a la derecha del alfiler.
Para extraer órganos como el intestino, agregue varias gotas de tampón HL 3.1 al animal, el intestino y otros órganos flotarán en la solución y se pueden separar del cuerpo con fórceps. Además, extirpar el sistema traqueal con los demás órganos. Ahora exponga los músculos internos del cuerpo sujetando hacia atrás las solapas hechas por las incisiones.
Asegúrese de estirar las paredes del cuerpo para abrirlas horizontal y verticalmente. Al sujetar las solapas. Retire los restos de órgano y lávelos una vez.
Al agregar tampón HL 3.1 fresco, la larva ahora está lista para ser fijada con formaldehído recién hecho diluido al 3.5% en un XPBS, sumerja completamente las larvas y el fijador y espere 25 minutos. Una vez finalizado el período de fijación, lavar las larvas dos veces con el tampón HL 3.1 durante tres minutos. Retire con cuidado los alfileres, transfiera las larvas a tubos de 1.5 mil que contengan un XPBS si es necesario.
Las larvas pueden almacenarse hasta dos días a cuatro grados centígrados. Para obtener resultados óptimos, use las larvas disecadas inmediatamente. Hay varios componentes clave para una larva de Drosophila correctamente diseccionada.
Primero, tenga cuidado de no dañar los músculos, especialmente seis, siete y cuatro. En segundo lugar, el animal debe estar debidamente estirado. De lo contrario, es posible que la unión neuromuscular no sea accesible o distinguible.
Aquí se puede ver una larva debidamente disecada. El NMJ es claramente visible y el sistema ya está listo para los experimentos. Acabamos de mostrarte cómo diseccionar larvas de esófago para estudiar la unión neuromuscular.
Al realizar este procedimiento, es importante llevar los músculos intactos. Si los músculos están dañados, no habrá uniones neuromusculares para estudiar. Así que eso es todo.
Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.
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Resumen
Este protocolo muestra cómo diseccionar larvas de Drosophila para su preparación en inmunohistoquímica y/o imágenes de la unión neuromuscular. El procedimiento implica la colocación cuidadosa de alfileres y el uso de tijeras y pinzas para preparar las larvas para análisis posteriores.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología del desarrollo
- Inmunohistoquímica
Antecedentes
- Las larvas de Drosophila se utilizan comúnmente en estudios neurobiológicos.
- La unión neuromuscular es un área crítica para estudiar la transmisión sináptica.
- Las técnicas adecuadas de disección son esenciales para obtener un análisis y una visualización exitosos.
- Este protocolo proporciona un método estandarizado para la disección de larvas.
Objetivo del estudio
- Preparar larvas de Drosophila para análisis inmunohistoquímico.
- Facilitar la obtención de imágenes de la unión neuromuscular.
- Establecer técnicas de disección estandarizadas para lograr reproductibilidad en la investigación.
Métodos Utilizados
- Colocación de alfileres para estabilizar las larvas durante la disección.
- Uso de tijeras para abrir las larvas.
- Eliminación de órganos internos con pinzas.
- Fijación de la pared corporal con fines de imagen.
Resultados principales
- Una disección exitosa permite la visualización clara de la unión neuromuscular.
- Los métodos estandarizados mejoran la consistencia entre experimentos.
- Facilita estudios posteriores sobre la función y el desarrollo sinápticos.
- Proporciona una base para futuras investigaciones en neurobiología de Drosophila.
Conclusiones
- La disección de larvas de Drosophila es un paso fundamental para la investigación neurobiológica.
- Las técnicas adecuadas mejoran la calidad del análisis inmunohistoquímico.
- Este protocolo constituye un recurso valioso para los investigadores en el campo.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La junta neuromuscular (NMJ) de la larva de Drosophila sirve como un modelo genéticamente accesible para estudiar el desarrollo y la plasticidad sináptica, ofreciendo alta accesibilidad y resolución a nivel celular. Este protocolo de disección permite la preparación reproducible de la NMJ para aplicaciones posteriores, como imágenes, inmunohistoquímica y electrofisiología, apoyando la validación de objetivos y la reducción de riesgos mecanicistas en las fases iniciales del descubrimiento. Al proporcionar un método estandarizado para aislar y visualizar estructuras sinápticas, la técnica mejora la confianza predictiva en la evaluación de objetivos neurobiológicos y la clarificación de vías.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas relacionadas con la función sináptica y las vías del neurodesarrollo.
- Valor operativo: Apoya la reducción del riesgo biológico mediante la visualización de alta fidelidad de los patrones de inervación entre motoneuronas y músculo.
- Valor predictivo: Facilita la evaluación de intervenciones genéticas o farmacológicas sobre la morfología y función de la unión neuromuscular (NMJ).
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Preparación del ensayo: Prepara sistemas biológicos estandarizados para la selección de compuestos con acceso consistente a las uniones neuromusculares.
- Resultados cuantitativos: Permite la medición del número y tamaño de los botones sinápticos y de la localización proteica como lecturas fenotípicas.
- Escalabilidad: Permite el procesamiento paralelo de larvas para campañas de cribado de throughput medio.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para enfermedades: Modela mecanismos sinápticos conservados aplicables a la validación de dianas en trastornos neurodegenerativos y neuromusculares.
- Continuidad traslacional: Conecta hallazgos genéticos en Drosophila con la biología sináptica de mamíferos mediante vías conservadas.
- Reducción de riesgos mecanicistas: Permite la evaluación temprana del acoplamiento a la diana y la modulación de vías en un sistema vivo e intacto.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El flujo de trabajo de disección se integra en las primeras etapas del descubrimiento al permitir la comprobación de hipótesis, avanza hacia la identificación de compuestos activos mediante fenotipos sinápticos cuantificables y apoya la validación preclínica mediante cribado fenotípico relevante para la enfermedad.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la aclaración de vías sinápticas y la validación funcional de objetivos mediante la visualización directa de la unión neuromuscular.
- Tamizaje: Proporciona preparaciones listas para ensayos con lecturas estructurales y fluorescentes reproducibles para la evaluación de compuestos.
- Analítica: Genera datos morfológicos e inmunohistoquímicos cuantitativos para el análisis comparativo entre condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta los mecanismos sinápticos de Drosophila con modelos preclínicos a través de vías moleculares conservadas.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la evaluación de neurodianas en múltiples campañas de descubrimiento.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de dianas al reducir la ambigüedad mecanicista en los estudios sinápticos.
- Valor operativo: Asegura la estandarización, reproducibilidad y escalabilidad del preparado de la unión neuromuscular (NMJ) entre diferentes laboratorios.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance/no avance al permitir la detección temprana de toxicidad sináptica o de la interacción con la diana.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de neurodianas basada en resultados funcionales sinápticos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de Drosophila, microcirugía y microscopía de fluorescencia.
- Depende de placas para disección, alfileres para insectos, tijeras de resorte, pinzas y tampón HL 3.1.
- Necesita la estandarización de la tensión aplicada al fijar con alfileres y de las condiciones del tampón entre diferentes usuarios.
- Las consideraciones para la adaptación incluyen las distintas etapas larvarias y los fondos genéticos que afectan la integridad muscular.
- Las limitaciones prácticas incluyen la necesidad de destreza manual y el posible daño muscular si la disección no es precisa.
