Name: Drosophila larval NMJ Disección (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Aprende la disección de larvas de Drosophila para estudiar la unión neuromuscular mediante inmunohistoquímica e imagenología. Este protocolo estandarizado permite visualizar sinapsis con técnicas reproducibles.

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Antes de empezar <ol><li> Todas las culturas deben ser cultivadas a 25 ° C. </li><li> HL3.1 buffer disección puede ser preparado de antemano. Tomar una alícuota de 50 ml de HL3.1 y mantener en hielo. </li><li> Prepare 15 ml de formaldehído fresco 3,5% en HL3.1. Mantenga en hielo. </li></ol> Disección de larvas <ol><li> Ponga una gota de frío HL3.1 en la placa de disección. Esto evitará que el animal se seque y aturdir al animal por lo que es más fácil trabajar con. </li><li> Usando las pinzas largas, seleccione una larva de tercer estadio errantes y colocarlo en la caída de HL3.1. </li><li> En primer lugar, el uso de fórceps corto para captar un alfiler minutien. Coloque el pasador entre los espiráculos posteriores. Los animales por lo general tratan de arrastrarme de la clavija se extiende hacia fuera y lo que es más fácil para que usted ponga un alfiler de lleno en la cabeza de la larva cerca de los ganchos de la boca. Tramo al animal a lo largo. Esto le ayudará a maximizar la cantidad de la pared expuesta del cuerpo se puede lograr durante el corte. Nota: Si usted decide echar la cabeza, el animal puede envolver su cuerpo alrededor de la clavija o el látigo de su cuerpo hacia atrás y adelante por lo que es difícil de precisar. Por lo general, se puede contrarrestar esta quitando el HL3.1 y colocar una gota fría impresionante fresco del animal una vez más. El científico ambidiestro también acaba de agarrar al animal y mantenerlo en su lugar. </li><li> Con la tijera de primavera hacer una incisión horizontal justo anterior a la posterior pin en la parte dorsal de la larva. Coloque una hoja de la tijera en la incisión y realizar un corte vertical a lo largo de la línea media dorsal hacia el extremo rostral de la larva. En la tribuna de los animales hacen incisiones horizontales a la izquierda ya la derecha del pasador. Nota: el resultado final debe ser similar a uno que en la parte dorsal de la larva en el eje rostrocaudal. </li><li> Extraer los órganos. Comience por poner varias gotas adicionales de HL3.1 en la larva. Esto permitirá a los órganos de flotar fuera del cuerpo, lo que le permite eliminar con mayor facilidad. En primer lugar, eliminar el sistema traqueal. En segundo lugar, utilizar las pinzas para agarrar el resto de los órganos y eliminarlos. </li><li> Durante el paso 3 se hizo una aleta izquierda y la aleta derecha en la pared del cuerpo. Pin los flaps en un fin de asegurarse de que las agujas del reloj para estirar la pared del cuerpo, tanto horizontales como verticales. </li></ol> Fijación Fijar cada animal en el 3,5% de formaldehído en HL3.1 durante 25 minutos. Lave al animal dos veces en HL3.1 durante 5 minutos. Almacenamiento Retire los pernos y la transferencia de las larvas a un tubo de 1.5 ml contiene 1X PBS. Si va a utilizar la imagen de la UNM fundido etiquetas fluorescentes, se debe la imagen de los animales en dos días. Puede almacenar las larvas disecadas de hasta una semana a 4 ° C. Los resultados representativos Hay varios componentes clave para una adecuada disección larvas de Drosophila. En primer lugar, hay que tener cuidado de no dañar los músculos, especialmente los músculos de 4, 6 y 7. Estos son los músculos más popular para el estudio y si se dañan descartar la preparación de filetes y diseccionar a otro animal. En segundo lugar, hay que asegurarse de que el animal está al máximo se extendía de manera que cada músculo y la UNM se pueden distinguir.

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster.</a> J. Physiol. 262, 189-214 (1976).</li>
<li>Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+morphology+of+glutamatergic+synapses+on+identified+muscle+cells+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 9, 710-725 (1989).</li>
<li>Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).</li>
<li>Vactor, D. V., Sink, H., Fambrough, D., Tsoo, R., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+that+control+neuromuscular+specificity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genes that control neuromuscular specificity in Drosophila.</a> Cell. , 73-1137 (1993).</li>
<li>Feng, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+minimal+hemolymph-like+solution%2C+HL3.1%2C+for+physiological+recordings+at+the+neuromuscular+junctions+of+normal+and+mutant+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurogenet%22%5BJournal%5D)">A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae.</a> J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).</li>
</ol>

La técnica de disección se demuestra en este vídeo se puede utilizar para preparar a las larvas de Drosophila para una variedad de técnicas experimentales. Si las etiquetas fluorescentes de proteínas están presentes, las larvas pueden ser montados y la imagen de inmediato. De lo contrario, la inmunotinción se puede realizar con el fin de marca específica compartimentos sináptica. Además, la electrofisiología se puede realizar fácilmente en las larvas disecados para evaluar el funcionamiento de la neurotransmisi...

HL3 disección Buffer: (en mm) 70 NaCl, 5 KCl, CaCl2 0,2, MgCl2 20, 10 NaHCO3, 5 trehalosa, sacarosa 115, y HEPES 5, pH 7,3.<br /<br /&gt; Sylgard disección de la placa: Mezclar suavemente (para evitar burbujas) de 10:1 en un vaso de precipitados. Vierta la mezcla en placa de Petri (de cualquier tamaño). Permitir Sylgard curar toda la noche en 37 ° C incubadora.

drosophila larval nmj disección

Drosophila Larval NMJ Dissection

La<em&gt; Drosophila</em&gt; Unión neuromuscular (UNM) es un sistema modelo establecido utilizado para el estudio del desarrollo sináptico y su plasticidad. El uso generalizado de la<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor del sistema se debe a su gran accesibilidad. Se puede analizar con una sola célula de resolución. Hay 30 músculos por hemisegment cuya disposición dentro de la pared del cuerpo periférico se conocen. Un total de 35 neuronas motoras se adhieren a estos músculos en un patrón que tiene una alta fidelidad. Utilizando la biología molecular y la genética, se puede crear animales transgénicos o mutantes. Entonces, se puede estudiar las consecuencias del desarrollo sobre la morfología y función de la UNM. Para acceder a la UNM para el estudio, es necesario analizar cuidadosamente cada larva. En este artículo se muestra cómo analizar adecuadamente<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas para el estudio de la UNM mediante la eliminación de todos los órganos internos, dejando intacta la pared del cuerpo. Esta técnica es adecuada para preparar a las larvas de la imagen, la inmunohistoquímica, o electrofisiología.

Este protocolo muestra cómo diseccionar<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas en la preparación de inmunohistoquímica y / o imágenes de la unión neuromuscular.

Drosophila larval NMJ Disección

La unión neuromuscular (UNM) de Drosophila es un sistema modelo establecido que se utiliza para el estudio del desarrollo y la plasticidad sináptica. El uso generalizado...

Este procedimiento comienza colocando una larva de tercer estadio sobre la placa de disección. Se colocan alfileres en los extremos posterior y anterior de la larva. Se utiliza tijera para abrir la larva y pinzas para extraer los órganos internos.Finalmente, se colocan cuatro alfileres más en cada esquina de la pared corporal de la larva para mantenerla tensa durante la fijación. Hola, soy Jonathan Brent del Laboratorio de Brian McCabe en el Departamento de Fisiología y biofísica única en la Facultad de Médicos y Cirujanos de la Universidad de Columbia. Hoy les mostraremos el procedimiento para la disección de larva de Drosophila y de MJ.Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar el desarrollo sináptico de la unión neuromuscular. Así que comencemos. En las larvas de drosófila, hay 30 músculos por hemiesegmento cuya disposición dentro de la pared corporal periférica es conocida.Un total de 35 neuronas motoras inerva estos músculos en un patrón altamente estereotipado. Para acceder a la unión neuromuscular o NMJ, es necesario diseccionar cuidadosamente cada larva con una disección adecuada. La NMJ puede utilizarse para imágenes de inmunohistoquímica o de electrofisiología.Comience el procedimiento colocando una gota de tampón HL 3.1 sobre una placa de disección. El tampón se prepara por adelantado y se enfría en hielo. Seleccione cuidadosamente una larva de tercer estadio en fase de deambulación del costado del frasco utilizando pinzas de acero inoxidable grandes.El movimiento indica que las larvas no han entrado en pupación. Coloque las larvas con el lado dorsal hacia arriba en la gota de tampón sobre la placa de disección. El tampón frío anestesiará a las larvas y manténgalas inmóviles usando fórceps. Coloque un alfiler mnuchin entre las esferas posteriores, luego coloque un segundo alfiler cerca de los ganchos bucales oscuros para que la larva quede estirada y lista para abrirse.Con tijeras de resorte, realice una pequeña incisión horizontal hacia el extremo posterior de las larvas. Introduzca una hoja de las tijeras en el sci y realice un corte longitudinal hacia el extremo anterior de la larva. A continuación, haga incisiones horizontales en el extremo anterior de las larvas a la izquierda y a la derecha del alfiler.Para extraer órganos como el intestino, agregue varias gotas de tampón HL 3.1 al animal; el intestino y otros órganos flotarán en la solución y podrán retirarse del cuerpo con pinzas. Asimismo, retire el sistema traqueal junto con los demás órganos. Ahora exponga los músculos internos del cuerpo sujetando hacia atrás los colgajos creados mediante las incisiones.Asegúrese de estirar las paredes del cuerpo abiertas horizontal y verticalmente al sujetar las aletas. Retire cualquier resto de órganos y lave una vez.Al agregar tampón HL 3.1 fresco, la larva ya está lista para ser fijada con formaldehído recién preparado diluido al 3,5 % en un XPBS, sumergiendo completamente las larvas y el fijador, y esperando 25 minutos. Cuando el periodo de fijación haya terminado, lave las larvas dos veces con tampón HL 3.1 durante tres minutos. Retire cuidadosamente los alfileres y transfiera las larvas a tubos de 1,5 mL que contengan un XPBS si es necesario.Las larvas se pueden almacenar hasta dos días a cuatro grados Celsius. Para obtener resultados óptimos, utilice las larvas diseccionadas inmediatamente. Hay varios componentes clave en una larva de *Drosophila* diseccionada adecuadamente.Primero, tenga cuidado de no dañar los músculos, especialmente los seis, siete y cuatro. Segundo, el animal debe estar adecuadamente extendido. De lo contrario, la unión neuromuscular podría no ser accesible o distinguible.Aquí puede observarse una larva diseccionada adecuadamente. La junta neuromuscular es claramente visible y el sistema ya está listo para realizar experimentos. Acabamos de mostrarle cómo diseccionar larvas esofágicas para estudiar la junta neuromuscular.Al realizar este procedimiento, es importante mantener los músculos intactos. Si los músculos se dañan, no habrá uniones neuromusculares para estudiar. Eso es todo.Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Investigación

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Biología

En este artículo se muestra cómo disecar el sistema nervioso central del tercer estadio las larvas de Drosophila.

La disección del sistema nervioso central de larvas de Drosophila melanogaster

Este protocolo muestra cómo realizar técnicas de inmunohistoquímica sobre disecados larvas de Drosophila.

Drosophila larval NMJ inmunohistoquímica

Drosophila melanogaster larvas de disponer de un sistema modelo ideal para investigar los mecanismos de transporte axonal en larvas de los nervios segmentarios. El uso de este procedimiento, 3 de larvas portadoras de mutaciones diferentes pueden ser comparados a las larvas de tipo salvaje.

La visualización de larvas Nervios segmentarios en 3 Rd Instar Drosophila Preparación de larvas

Este protocolo describe un método fiable para la anestesia y la imagen intacta...

Imágenes in vivo de larvas de Drosophila intactos a nivel sub-celular Resolución

La disección y la imagen de zonas activas en el Drosophila La unión neuromuscular

En el parche situ clamp grabaciones se utilizan para la caracterización electrofisiológica de las neuronas en los circuitos intactos. En el modelo genético de Drosophila sujeción parche es difícil porque el SNC es pequeño y rodeado por una vaina robusta. En este artículo se describe el procedimiento para retirar las neuronas vaina y limpia para posteriores grabaciones de patch clamp.

Preparación de<em&gt; Drosophila</em&gt; Las neuronas centrales para<em&gt; In situ</em&gt; Parche de sujeción

En este video, las fibras nerviosas de las larvas de Drosophila se sumergen en un tinte FM, que se une a los lípidos de la membrana celular. El microelectrodo de succión y los pulsos eléctricos estimulan el proceso de endocitosis, incorporando el colorante FM en las vesículas endocíticas recién formadas. Este método, que visualiza las etapas presinápticas de la neurotransmisión, es útil para estudiar la función sináptica y la liberación de neurotransmisores.

Carga y descarga de colorantes FM mediada por microelectrodos en células nerviosas de larvas de Drosophila

La morfología, el tamaño y la ubicación de los orgánulos intracelulares se conservan evolutivamente y parecen afectar directamente a su función. Comprender los mecanismos moleculares que subyacen a estos procesos se ha convertido en un objetivo importante de la biología moderna. Aquí mostramos cómo estos estudios pueden ser facilitados por la aplicación de técnicas cuantitativas.

¿Por qué importa la cuantificación: Caracterización de fenotipos en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval unión neuromuscular

Aquí describimos un método simple y ampliamente accesible para lesionar nervios segmentarios en larvas de Drosophila para visualizar y cuantificar la neurodegeneración de neuronas motoras en la unión neuromuscular (NMJ) de larvas de tercer estadio.

Una Metodología Neuronal Simple de Lesiones Mecánicas para Estudiar<em&gt; Drosophila</em&gt; Degeneración de Neuronas Motoras

Describimos una técnica de disección que preserva la arquitectura de la unión neuromuscular y permite un estudio inmunocitoquímico detallado de las neuronas motoras en la pierna adulta de Drosophila .

Disección e inmunohistoquímica de la pierna adulta de Drosophila para detectar cambios en la unión neuromuscular de una neurona motora identificada

Aquí, presentamos un protocolo detallado para visualizar las redes de microtúbulos en las uniones neuromusculares y las células musculares. Combinado con las potentes herramientas genéticas de Drosophila melanogaster, este protocolo facilita enormemente el cribado genético y el análisis de la dinámica de los microtúbulos para determinar el papel de las proteínas reguladoras de la red de microtúbulos en el sistema nervioso.

Uso de la unión neuromuscular de las larvas de Drosophila y células musculares para visualizar la red de microtúbulos

Aprende la disección de larvas de Drosophila para estudiar la unión neuromuscular mediante inmunohistoquímica e imagenología. Este protocolo estandarizado permite visualizar sinapsis con técnicas reproducibles.

Drosophila larval NMJ Disección

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