De dos fotones axotomía y de lapso de tiempo de imagen confocal en embriones de pez cebra en vivo

Para cortar axones utilizando imágenes intravital de dos fotones, coloque embriones de pez cebra anestesiados dentro de una gota de aros mientras esta se endurece en una cámara especializada compuesta por una funda de TEFL y una cubierta de vidrio. Coloque una lámpara de vidrio encima de la cámara, que luego se invierte antes de la exotomía. Tome una imagen previa del axón que desea cortar con un aumento de 40x, y luego aumente a 70x en la región que desea exomizar.

Y con el láser apagado, aumente la potencia del láser. Encienda brevemente el láser. En la imagen posterior del axón, observará restos axonales dispersos si la exotomía tiene éxito.

Hola, soy Georgia O'Brien. Hola, soy Sandra Rigo. Y yo soy Shauna Martin.

Y pertenecemos al laboratorio de Alvarez TI en el Departamento de Biología Celular y del Desarrollo Molecular de la Universidad de California en Los Ángeles. Hoy les mostraremos un procedimiento para la exodoncia de dos fotones y la obtención de imágenes confocales con lapso de tiempo en embriones vivos de pez cebra. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la degeneración y regeneración de axones somatosensoriales periféricos.

Así que comencemos. Para empezar, prepararemos una solución al 1 % de agarosa de baja fusión para inclusión. Disolvemos la agarosa en agua doblemente destilada calentando en un microondas antes de repartirla en tubos pequeños y almacenarla en un bloque calefactor a 42 grados Celsius.

Primero, los embriones pueden colocarse en una solución de Ringer con PTU al 5 % a las 22-24 horas posteriores a la fertilización para inhibir la formación de pigmento, que es intensamente autofluorescente y oscurecerá los axones en el microscopio de dos fotones. A continuación, seleccionamos los embriones para la obtención de imágenes y eliminamos su corion tirando suavemente de ellos con pinzas. Una vez seleccionados los embriones, se anestesian añadiendo aproximadamente 0,02 % de trica al Ringer con PTU.

Antes de continuar, asegúrese de que los animales no respondan al tacto. Prepare la cámara de imagenología a largo plazo aplicando grasa al vacío a un lado de un anillo de vidrio o teflón y fíjelo sobre un cubreobjetos de vidrio. Tenga cuidado de no transferir mucho del ringer PTU.

Transfiera un embrión a la solución de agro a 42 grados con una pipeta de vidrio. Luego, transfiera el embrión con una gota de agros a un cubreobjetos preparado. Una vez transferido, coloque el embrión en la posición deseada mientras los agros se endurecen.

Tenga en cuenta que la cámara de imagen se volteará al finalizar, de modo que la lámina de cobre quedará como superficie superior. Si dispone de una platina motorizada y puede obtener imágenes de múltiples ubicaciones simultáneamente, repita estos pasos para cada embrión. Permita que las rosas de agaro se solidifiquen completamente.

Luego, llene el anillo con ringer PTU tri canino al 0,02 %. Finalmente, aplique grasa al vacío al otro lado de los anillos. A continuación, cúbralos con un vidrio de luz.

Dar la vuelta a las cámaras de sellado. Ahora estamos listos para realizar la imagenología de disección de dos ejemplares de cuatro toneladas. Para prepararse para la imagenología, coloque los embriones montados sobre un portaobjetos en el soporte bajo el microscopio.

Enfóquese en un embrión utilizando un objetivo acuático de 40 x 0,8 de apertura numérica. Luego encienda el láser. Ajuste el láser a una longitud de onda de 910 nanómetros y una potencia de 30 milivatios.

Abra el software de imagen. Utilizamos el software Scan Image desarrollado en Corals para Boar's Laboratory. Con esta potencia, se puede explorar el campo en busca de un axón candidato que será seccionado.

Una vez localizado, tome una imagen del axón objetivo. Marque las primeras y últimas posiciones en Z, adquiera la imagen y realice una proyección máxima de las series en Z. A continuación, acerque 70 x al ramo del axón que desea examinar detalladamente.

Aumente la potencia a 180 milivatios y configure el número de cortes Z en uno. Inicie un solo escaneo con un láser presionando "grab". Esto debería ser suficiente para seccionar el axón, aunque es necesario optimizar este procedimiento según su microscopio y objetivo experimental.

Finalmente, aleje la imagen. Reduzca la potencia a 30 milivatios y tome una imagen de nuestro axón recién seccionado. Si en su laboratorio no dispone de un microscopio de dos fotones construido a medida, también se puede utilizar el microscopio confocal de dos fotones Zes cinco 10 para seccionar axones.

Comenzamos colocando el embrión montado sobre la platina y enfocándolo mediante un objetivo acuático de 25 x. A continuación, encienda los láseres de dos fotones y de argón en una configuración multirrastro para que sea posible cambiar de uno a otro. Aunque ambos láseres se utilizan para detectar GFP, la emisión de dos fotones se visualiza en rojo y la emisión del láser de argón en verde.

Para diferenciarlos, utilice el láser de Argonne para identificar un axón que resista bajo las condiciones Z. Marque la primera y la última sección óptica. Tome una imagen confocal y cree una proyección máxima de Zack.

Apague el láser de argón y encienda el escaneo del láser de dos fotones con una intensidad de aproximadamente 9 % de transmisión. Para asegurarse de que el axón siga estando enfocado, haga clic en el botón de detener para que la herramienta de recorte esté disponible. Utilice el recorte para acercar la zona de interés.

Normalmente se aumenta el zoom hasta aproximadamente 70 x. Elija la región del axón que se lesionará y enfoque esta región. El zoom se puede verificar en la pestaña de modo.

A continuación, en la pestaña de canales, cambie la intensidad de los dos fotones de aproximadamente 9 %transmisión a 15-30 %transmisión. Para activar la nueva configuración, haga clic en el botón XY rápido y luego haga clic rápidamente en detener. Para evitar daños excesivos, el axón debe verse como restos dispersos si el procedimiento tuvo éxito.

Finalmente, para asegurarse de que el axón efectivamente fue dañado, cambie nuevamente al láser de argón de 488 nanómetros. Tome otra imagen confocal y cree una proyección máxima de los Zacks. Ahora que le hemos mostrado dos formas de seccionar axones utilizando microscopía láser de dos fotones, analizaremos imágenes confocales de lapso de tiempo de la regeneración utilizando el zes LSM cinco 10.

Para preparar la imagen de lapso de tiempo, asegúrese de encender la platina calefactora al menos 30 minutos antes de configurar su película de lapso de tiempo. Coloque los embriones montados sobre un portaobjetos en el soporte del microscopio. Enfóquese en un embrión con el objetivo de aire deseado.

Utilizamos un objetivo de apertura numérica 20 x 0,5, abrimos el software de imagen Zeiss LSM five 10 y luego encendemos los láseres adecuados y configuramos la configuración deseada. Abra la ventana de escaneo y la ventana de múltiples tiempos. Si dispone del software de múltiples tiempos, defina la posición y configuración de su primer embrión en la ventana de múltiples tiempos.

Active el escaneo rápido en la ventana de escaneo, luego mueva la platina a la posición XY deseada. Marque la primera y la última posición Z en la ventana de escaneo. Presione detener y luego también medio en la ventana de escaneo, espere a que finalice el escaneo de la rebanada Z media.

Luego presione marcar posición en la ventana de la platina. Si solo está obteniendo imágenes de un embrión, haga clic en la pestaña de ubicación única en la ventana de múltiples tiempos. Haga clic en reemplazar X, y, Z. A continuación, haga clic en guardar configuración.

Acepte cuando se le solicite sobrescribir la configuración anterior. Ahora puede configurar los parámetros para la adquisición de imágenes en la ventana multi lo. Si dispone de una platina mecanizada, puede configurar múltiples ubicaciones para imaginar múltiples embriones.

En este caso, debe seleccionar la pestaña de múltiples ubicaciones antes de definir las coordenadas X, Y, Z y la configuración para su primera ubicación. Además, asegúrese de que el menú desplegable justo debajo de la pestaña de múltiples ubicaciones esté en la ubicación uno y de que el menú desplegable en la sección de configuración indique multi lo uno. Antes de hacer clic en guardar configuración, defina la posición y configuración de los embriones restantes en la ventana multi-tiempo.

Localice el siguiente escaneo rápido de embrión, luego mueva la platina a la posición XY deseada y marque la primera y última posición Z en la ventana de escaneo. Presione detener. Luego, también en la ventana de escaneo, espere a que finalice el escaneo de la sección media en Z.

Luego presione marcar posición. En la ventana de la platina, haga clic en reemplazar X, Y, Z. Verifique que el menú desplegable justo debajo de la pestaña de ubicaciones múltiples esté en la ubicación dos y que el menú desplegable en la sección de configuración indique multi lóbulo dos. A continuación, haga clic en guardar configuración. Acepte. Cuando se le solicite sobrescribir la configuración anterior, repita este proceso para los embriones restantes.

Configure los parámetros para la adquisición de imágenes en la ventana multi lo. Seleccione la opción GR GL en la lista de secciones de bloque. Luego ingrese el número deseado de repeticiones de grupo.

Este es el número de veces que el microscopio confocal adquirirá una imagen en cada ubicación. Introduzca el intervalo de peso deseado en la sección de parámetros. Este es el tiempo transcurrido desde el inicio de una repetición de adquisición de imágenes hasta el inicio de la siguiente.

Seleccione Zack XY en la sección de configuración. Ingrese su nombre de archivo base en la sección inferior. Haga clic en seleccionar base de datos de imágenes y elija su base de datos.

Haga clic en el botón de opciones y luego seleccione su carpeta MDB para guardar también los archivos temporales. Marque la opción de mantener la imagen final abierta. Guarde la imagen final, en la parte central de Zack, y seleccione el intervalo de peso.

Haga clic en aceptar para cerrar la ventana de opciones, luego haga clic en hora de inicio. Deje la ventana de múltiples tiempos abierta durante toda la duración de la adquisición de imágenes. Ahora es el momento de analizar sus datos.

Cuando finalice la imagen de lapso de tiempo, el software multitemporal compilará todos sus archivos temporales en un archivo resumen para cada ubicación. Si desea detener la película antes de que finalice, asegúrese de presionar finalizar en lugar de detener, para que se cree un archivo resumen.

Los archivos temporales y los archivos de resumen deben guardarse automáticamente en la carpeta MDB designada. A continuación se muestra un ejemplo representativo de una película confocal de lapso de tiempo tras una exotomía a las 54 horas posteriores a la fertilización. El primer cuadro muestra una vista dorsal del axón antes de la exotomía, con una flecha amarilla que señala el sitio de la exotomía en el siguiente momento temporal.

La película de lapsos comienza dentro de la primera hora tras la exotomía y dura 12 horas. Se recopiló una serie confocal cada 20 minutos. Esta película confocal de lapsos se grabó utilizando los mismos parámetros a las 78 horas post fertilización.

El primer cuadro muestra una vista lateral del axón antes de la exsodomía con una flecha amarilla que señala el sitio de exsodomía. Acabamos de mostrarle cómo generar daño tisular preciso y visualizar embriones de pez cebra vivos mediante sedomía de dos fotones y microscopía confocal con lapse de tiempo. Al realizar este procedimiento, es importante optimizar la cantidad de potencia utilizada para la exsodomía con láser de dos fotones para evitar causar daño excesivo.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con su experimento.