Name: Mutagénesis dirigida casera de plásmidos enteros (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-11T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Aprende mutagénesis dirigida de plásmidos enteros usando PFU polimerasa y enzima DpnI. Este método sencillo y económico permite introducir sustituciones de bases en plásmidos de E. coli con alta eficiencia.

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Principio del método: El sitio de mutagénesis dirigida de los plásmidos todo se explica en este video es un método de mutagénesis que le permite modificar un gen diana clonado por sustitución, supresión o inserción de unas cuantas bases directamente en un plásmido. Funciona mediante la amplificación de todo el plásmido, en una reacción de termociclado no basados ​​en la PCR. Durante la reacción de primers mutagénicos, portadores de la mutación deseada en forma de desajustes en el plásmido original, se integran en el plásmido de nueva síntesis. Después de la eliminación de la plásmido original de la reacción del plásmido mutado se transforma en E. coli. Los siguientes pasos son sólo para propósitos de revisión, porque la eficiencia de la mutación de este método no es 100%. Todo el procedimiento dura tres días, pero la parte principal se puede hacer en un día. 1.0 Primer día: 1.1 reacción termociclado: Plásmido original: Este sitio de mutagénesis dirigida protocolo funciona mejor con plásmidos de hasta 10kb. Los plásmidos son más grandes un poco difícil de mutar con este método y puede tomar un poco de paciencia y ajuste de las condiciones de ciclos térmicos y / o las células competentes. Además, el plásmido que se trabaja con debe estar aislado de una presa + cepa de bacterias. Para la reacción de termociclado tendrá 10 a 60 ngs del plásmido desea mutar. Cebadores: Antes de que pueda configurar su reacción termociclado usted tiene que tener su primers en la mano. Usted necesita cerca de 150 ng de cada cebador mutagénico. Esta bien, si se toma 1,5 l de una 1:10 pm 100 acciones diluidas. Hay algunas pautas sencillas que usted debe considerar al diseñar su primers mutagénicos: <ul><li> Los cebadores deben ser complementarias entre sí </li><li> Los primers debe estar entre 25 y 45 nucleótidos de longitud </li><li> Las mutaciones en la forma de los desajustes que el plásmido original debe estar contenido en los dos primers </li><li> Los desajustes se deben centrar en el primer y flanqueado por al menos 8 nucleótidos en cada lado </li><li> Los primers deben tener un contenido de GC de al menos 40% </li><li> Los primers debe terminar cinco prime y prime 3 con uno o más Gs o C </li><li> Los primers no necesitan ser fosforilados, ni tampoco tienen que ser purificados o FPLC PAGE, simplemente desalinizada debe ser. </li><li> Para el cálculo de Tm no necesita ninguna fórmula, pero Tm en el certificado de envío debe ser superior a 60 ° C. </li><li> Para fines de selección es práctico para insertar o eliminar un sitio de restricción con la mutación. Debido a la degeneración del código genético hay muchas posibilidades para insertar un sitio de restricción con la mutación deseada. El sitio web de la Nueva Inglaterra Biolabs ofrece una herramienta para encontrar ese sitio de restricción apropiadas. Simplemente introduzca su primer secuencia de codificación de la secuencia de aminoácidos que desee, utilizando el código de la ambigüedad de ADN. La herramienta de búsqueda de la enzima le dirá que los sitios de restricción se pueden introducir en paralelo a la mutación deseada. Si usted no puede encontrar ningún sitio de restricción posible o práctico de esta manera, usted puede insertar cualquier nuevo sitio de restricción sin importar el código genético en el sitio de la mutación. A partir de entonces puede utilizar este plásmido como molde para una serie de mutaciones en el que se elimina la restricción de este sitio de la inserción de los primers mutagénicos nuevo. Este enfoque puede ser muy conveniente si usted está planeando hacer una serie de mutaciones en el mismo sitio del plásmido. </li></ul> ADN-polimerasa: Para este método se necesita un ADN-polimerasa termoestable que exhibe 3&#39;-5 &#39;exonucleasa y crea extremos romos. Siempre usamos Pfu recombinante de la polimerasa de Fermentas. Si tienes problemas con los pasos de amplificación puede probar con una polimerasa de alta calidad, pero para la mayoría de los Pfu estándar será suficiente. Completar la reacción de la polimerasa con buffer de dNTPs, y el agua. 1.2 Condiciones de termociclado El termociclador debe establecerse de la siguiente manera. La fase de desnaturalización inicial y recurrente está establecido en 30 segundos a 95 ° C. La temperatura de hibridación de los primers no deben ser calculados con fórmulas complicadas. Por lo general, ajustar la temperatura de recocido a 55 ° C y el tiempo de recocido a un minuto. Para los primers de 25 a 30 nucleótidos que va a utilizar en su mayoría, esto funciona para nosotros el 95% del tiempo. De todos modos, si esto no funciona, simplemente tratar de variar la temperatura de hibridación entre el 50 - y 60 ° C. La temperatura depende de la elongación de la polimerasa que utiliza. En esta demostración se utiliza el PFU-polimerasa de Fermentas, que llama a una temperatura de elongación de 72 ° C. El tiempo de elongación varía según el tamaño del plásmido. Siempre calculamos 1 minuto por cada kb, y añadir un minuto adicional para quetiempo. Por ejemplo, un plásmido 9kb nos volveríamos a elegir 10 minutos como tiempo de elongación. 18 ciclos son suficientes para crear suficiente plásmido mutado para el uso posterior. Mantener el número de ciclos de baja, también le ahorra tiempo. <img src="/files/ftp_upload/1135/figure1.png" alt="Figura 1" width="600" height="287" /> 1.3 Gelcheck después de la reacción termociclado La amplificación de éxito debe ser revisado por la realización de una electroforesis. Inmediatamente después de la bicicleta ha terminado, carga de 5 l de la reacción en un 1% en gel de agarosa TAE. Si la ampliación se ha realizado correctamente, debería ver una banda distinta. Sin embargo, si la nueva síntesis de ADN no es claramente visible en el gel, se puede tratar de precipitar la reacción de todo y lo utilizan para la transformación en el siguiente paso. Para nosotros, esto rara vez ha trabajado, pero vale la pena darle una oportunidad. Lo mejor que puedes hacer si la reacción no funciona es para ajustar la temperatura de recocido. 1.4 DpnI la digestión: Antes de la transformación del plásmido original que sirvió de plantilla debe ser removido de la reacción para evitar que gran experiencia. Esto se realiza mediante digestión de restricción con DpnI. Esta endonucleasa de restricción corta sólo metiladas plásmido. Su reconocimiento y su sitio de restricción es la secuencia GATC, mientras que A tiene que ser desnaturalizado. Durante la digestión con DpnI sólo el plásmido originales sin mutación que fue aislado de una presa + tensión se corta, el plásmido mutado nueva síntesis que no está metilado no se ve afectada por DpnI. Sólo tienes que añadir 2.1 l de DpnI a la reacción e incubar por lo menos una hora a 37 °. Cuando se utiliza el ayuno DpnI digerir el tiempo de incubación puede ser reducida a unos 15 minutos. La calidad de su DpnI y el tiempo de incubación de esta restricción de la digestión en gran medida determina la fortaleza de su fondo con el plásmido sin mutación será. 1.5 Transformación: Después de la digestión del plásmido DpnI está listo para su transformación en las autoridades competentes E. células de E. coli. Sólo tienes que añadir 5 l de la reacción de digestión DpnI en las células competentes y llevar a cabo la transformación como se recomienda en su laboratorio. En nuestro caso usamos el procedimiento de golpe de calor mediante la incubación de la mezcla de bacterias plásmido en hielo durante 30 minutos y después de choque térmico es de 42 ° C durante 90 segundos. Después de la adición de 200 l SOC-solución, las bacterias se incuban, sacudiendo vigorosamente, a 37 ° C durante 1 h. Después de 1 hora la bacteria se colocan en la selección de los medios de agar. 2.0 El segundo día 2.1 Detección de clones parte 1: Selección de los clones Debido a que la eficiencia de la mutación no es 100% que necesita para la detección de su mutantes. Hacemos esto por restricción de la digestión en el que se comprueba la presencia o ausencia del sitio de restricción que se agregan o eliminan mediante la integración de imprimación. Para ello se suelen recoger ocho colonias y hacerlas crecer durante la noche para la preparación de plásmido al día siguiente. 3.0 El tercer día 3.1 Detección de clones parte 2: restricción de la digestión con la enzima marcador En el tercer día se realiza una preparación Mini y restricción de la digestión posterior con el marcador de la enzima. En el gel que se puede ver que uno de sus clones portadores de la mutación deseada y cuáles no. El método de detección sistemática mediante restricción de la digestión funciona muy bien. Sin embargo, usted debe confirmar la mutación del éxito de la secuenciación.

<ol><li>Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J., Wright, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QuikChange+site-directed+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Strategies%22%5BJournal%5D)">QuikChange site-directed mutagenesis.</a> Strategies. 9, 3-4 (1996).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Mutagénesis dirigida es un método de mutagénesis, que proporciona una forma rápida de mutar un gen transportado por un plásmido. La reacción general se puede hacer en un solo día. Con este método, sólo necesitará un par de cebadores de cortesía llevar a las mutaciones deseadas y una revisión de la polimerasa como PFU-polimerasa. El plásmido de nueva síntesis se puede separar de los padres plásmido por digestión de la reacción con la enzima de restricción DpnI. Esta enzima digiere sólo el ADN metilado. Por lo tanto, sólo...

<table><tbody><tr><td>Polimerasa Pfu (recombinante o nativa)</td><td>Fermentas</td><td>EP0571 o EP0501</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla de dNTP 10 mM</td><td>Fermentas</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>DpnI o digestión rápida con DpnI</td><td>Fermentas</td><td>ER1701</td><td></td></tr><tr><td>cebadores</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>desalados</td></tr></tbody></table>

mutagénesis dirigida casera de plásmidos enteros

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Mutagénesis dirigida de los plásmidos es toda una forma sencilla de crear variaciones ligeramente diferentes de un plásmido original. Con este método el objetivo de genes clonados pueden ser alterados por la sustitución, supresión o inserción de unas cuantas bases directamente en un plásmido. Funciona simplemente amplificando el conjunto del plásmido, en una reacción de termociclado no basados ​​en la PCR. Durante la reacción de primers mutagénicos, portadores de la mutación deseada, se integran en el plásmido de nueva síntesis. En este video tutorial se demuestra de una manera fácil y rentable para introducir sustituciones de bases en un plásmido. El protocolo trabaja con reactivos de referencia y es independiente de los kits comerciales, que a menudo son muy caros. La aplicación de este protocolo se puede reducir el costo total de una reacción a una octava parte de lo que cuesta utilizar algunos de los kits comerciales. En este vídeo también comentarios sobre los pasos críticos durante el proceso y dará instrucciones detalladas sobre cómo diseñar los primers mutagénicos.

Mutagénesis dirigida de los plásmidos es toda una forma sencilla de crear variaciones ligeramente diferentes de un plásmido original. Aquí se demuestra de una manera fácil y rentable para introducir sustituciones de bases en un plásmido usando reactivos estándar.

Mutagénesis dirigida casera de plásmidos enteros

La mutagénesis dirigida de plásmidos completos es una forma sencilla de crear variaciones ligeramente diferentes de un plásmido original. Mediante este método, el plásmido clonado...

Hola. Mi nombre es Mark Blo. Soy estudiante de posgrado en biología en la Universidad de Mines en Alemania. Hoy, mi amigo Kajo y yo queremos mostrarte cómo realizar una neurogénesis dirigida casera.El método fue desarrollado originalmente por Ethal y fue adaptado por muchos otros. Por lo tanto, cuando busque en internet hoy en día, encontrará numerosos protocolos diferentes que varían en algunos aspectos más o menos significativos. Hoy en día, nos gustaría mostrarle una forma sencilla y rentable que funciona bien para nosotros.Así que comencemos. Para este experimento, necesitas una ADN polimerasa termoestable y correctora. Siempre usamos la polimerasa PFU de Fermenters.Logically.También necesita el tampón de polimerasa, mezcla de dNTP, y agua. Además, necesita la enzima de restricción DPN I, células competentes de E. coli, una placa con agar, caldo de cultivo bacteriano y una serie de palillos. La parte más esencial y crítica de este método es el diseño de los cebadores mutagénicos.Existen algunas pautas sencillas que debe considerar al diseñar su par de cebadores. Los cebadores deben ser complementarios entre sí y tener entre 25 y 45 nucleótidos de longitud. Las mutaciones se ins

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Investigación

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Biología

Aquí se demuestra un protocolo sencillo para crear una biblioteca de mutantes al azar de una secuencia objetivo determinado. Se muestra cómo este método, que se realiza en vivo en Escherichia coli, se pueden acoplar con la selección funcional para desarrollar nuevas actividades enzimáticas.

Mutagénesis y funcional protocolos de selección de la evolución dirigida de proteínas en E. coli</em

Fuente: Tomás, J. M., et al. Generación de mutantes nulos para dilucidar el papel de las glicosiltransferasas bacterianas en la motilidad bacteriana. J. Vis. Exp. (2022).Este video demuestra la amplificación dependiente del iniciador de un plásmido suicida en E. coli. El plásmido, que porta un gen de resistencia a los antibióticos, se replica solo en presencia de una proteína iniciadora codificada por el huésped. Después de la electroporación e incubación en medio de recuperación, la mezcla se...

Amplificación de un plásmido suicida en un huésped bacteriano

Fuente: Lea-Smith, D. J., et al. Generación de mutantes marcados y sin marcadores en especies de cianobacterias modelo. J. Vis. Exp. (2016)El video demuestra un método para generar mutantes marcados con antibióticos en cianobacterias. El protocolo comienza con el cultivo de cianobacterias, seguido de pasos de centrifugación y lavado que preservan la superficie pili. Luego se introduce un plásmido portador de un gen de resistencia a los antibióticos flanqueado por secuencias homólogas. Durante...

Generación de mutantes marcados con antibióticos en cianobacterias mediante recombinación homóloga

Se presenta un protocolo para la evaluación funcional de amplias bibliotecas de saturación de un solo sitio de mutagénesis de proteínas utilizando secuenciación de alto rendimiento. Es importante destacar que este enfoque utiliza pares de cebadores para multiplexar ortogonales construcción de la biblioteca y secuenciación. Se proporcionan resultados representativos utilizando TEM-1 β-lactamasa seleccionado en una dosis clínicamente relevante de ampicilina.

Un protocolo para la evaluación funcional de la Proteína Total-mutagénesis de saturación Bibliotecas La utilización de secuenciación de alto rendimiento

Expansión del código genético sirve como una poderosa herramienta para el estudio de una amplia gama de procesos biológicos, incluyendo acetilación de proteínas. Aquí demostramos un protocolo fácil aprovechar esta técnica para generar homogéneo acetilado proteínas en sitios específicos en células de Escherichia coli .

Un protocolo fácil de generar proteínas Site-Specifically acetiladas en Escherichia Coli

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Gene-dirigido mutagénesis al azar para seleccionar a mutantes de proteasoma desestabilizadoras de la heterocromatina en la levadura de fisión

Mutagénesis sitio-dirigida es una técnica utilizada para introducir mutaciones específicas en el ácido desoxirribonucleico (ADN). Este protocolo describe cómo realizar mutagénesis sitio-dirigida con un 2-paso y enfoque, que es aplicable a cualquier fragmento de ADN de interés basado en la reacción en cadena de polimerasa de 3 pasos (PCR).

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Las endonucleasas de restricción con nueva especificidad de secuencia se pueden desarrollar a partir de enzimas que reconocen una secuencia parcialmente degenerada. Aquí proporcionamos un protocolo detallado que utilizamos con éxito para alterar la especificidad de la secuencia de la enzima NlaIV. Los ingredientes clave del protocolo son la compartimentación in vitro de la reacción de transcripción/traducción y la selección de variantes con nuevas especificidades de secuencia.

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Mutagénesis dirigida casera de plásmidos enteros

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