Name: Homarus americanus Stomatogastric La disección del sistema nervioso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 26 min 22 s
Description: Aprende la disección fina del sistema nervioso estomatogástrico de Homarus americanus para estudios de neurobiología. Este protocolo permite aislar ganglios y nervios para investigar la función neuronal en circuitos rítmicos.

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Nos gustaría agradecer a nuestro asesor, el Dr. Eva Marder. Esta investigación fue financiada por el Instituto Nacional de Salud subvenciones NS17813 a Eva Marder y NS059255 a AE T.

Antes de comenzar con este protocolo el estómago de la langosta debe ser retirado de los animales y como se describe en el artículo del compañero Jove (Bierman y Tobin, 2009). La mayoría de los pasos que se indican a continuación se realiza bajo un microscopio de disección. Parte I con aislamiento de los ganglios de la comisura <ol><li> Orientar el plato para que el extremo anterior (por el labio) es lejos de usted y el extremo posterior (por el píloro) es hacia usted. </li><li> Asegúrese de que el estómago se fija de modo que quede lo más plana posible en el plato. <ol><li> Pin por el esófago a ambos lados del labio. </li><li> Si es necesario, reorganice los otros pines colocados durante la disección bruto. </li></ol></li><li> Retire la hipodermis. <ol><li> Coge la hipodermis, cerca de la gm2/gm3 músculos, se desprenden de estos músculos y tire suavemente en la dirección anterior. </li><li> Separar la hipodermis de la grasa subyacente cortando las conexiones. Uso cada vez mayor atención alrededor de la arteria central, que encierra una parte clave del sistema nervioso stomatogastric. Salir de la hipodermis intacto dentro de un radio de 0,5 cm del ganglio stomatogastric, que se encuentra entre los músculos GM1b. </li><li> Cortar hipodermis separados. </li></ol></li><li> Separar el cerebro del tejido subyacente. <ol><li> Identificar a los dos grandes nervios comisurales que el proyecto bilateral de la parte anterior del cerebro de los ganglios de la comisura de la parte anterior del estómago. </li><li> Dejar intactos estos nervios, levante suavemente el cerebro con una pinza y se corta a separar el cerebro del resto de los tejidos. Tenga cuidado al hacer esto, como el nervio stomatogastric se encuentra debajo del cerebro y se debe mantener intacta. </li></ol></li><li> Aparte de los ganglios de la comisura de los alrededores de los tejidos. <ol><li> Siga uno de los nervios comisurales a uno de los ganglios de la comisura. </li><li> Identificar los iones y su hijo - estos nervios deben permanecer intactos. El ganglio comisural tendrá muchos nervios que irradian. Cortar la mayoría de ellos (excepto el ion e hijo), pero deja un nervio adicional adjunta para mantener el ganglio comisural en su lugar mientras usted termina la disección. </li><li> Repita con el ganglio comisural otros. </li></ol></li><li> Limpie el ion y el hijo de lateral a medial. Deja intacto el nervio vestibular para anclar el sistema nervioso en el estómago. El ganglio del esófago se sienta fueron los iones s se cruzan. Usted puede limpiar debajo de ella tomando el nervio inferior del ventrículo y tirando hacia arriba para cortar por debajo. </li></ol> Parte II-El aislamiento del ganglio Stomatogastric (STG) y los nervios restantes. <ol start="7"><li> Separar el STG de alrededor del tejido. <ol><li> El STG se encuentra dentro de una arteria que discurre entre los músculos GM1b y hasta el gm2a, b músculos. Busque el extremo del corte de la arteria cerca de la gm2a, b músculos. </li><li> Tire del extremo del corte de la arteria y la parte anterior, para exponer la DVN. Continuar tirando hacia arriba hasta llegar al nivel de la hipodermis restantes. Una vez separados, la arteria se puede recortar el nivel en el que toca la hipodermis restantes. </li><li> Cortar el colgajo del músculo que se encuentra en la tribuna de la langosta. </li><li> Levante la hipodermis encima de la arteria, al observar que la arteria que hace un túnel dentro de la grasa por encima de la STG. Ponga una hoja de las tijeras dentro de la arteria y corte el músculo por encima de ella. Compruebe que puede ver el dvn como se corta para estar seguro de que esté seguro, por encima de la STG. Continuar el corte anterior, a raíz de la arteria. Como se corta por encima de la STG, usted será capaz de ver la stn que emana la parte anterior de la STG y abajo de buceo en el músculo. Continuar el corte anterior de separar totalmente el músculo por encima del STG. </li><li> Borrar cualquier tejido fuera de la STN. </li></ol></li><li> Separar el s agn del tejido circundante. (Incluso si usted no va a grabar de la AGN, se necesita una parte del nervio intacto de precisar el ganglio de registros intracelulares.) <ol><li> Para ver mejor el s agn, retire el resto de la hipodermis y una capa fina de los músculos subyacentes. </li><li> Sólo por detrás de la STG, identificar a un túnel oscuro en el tejido adiposo y el músculo en cada lado de la DVN. </li><li> Palo una hoja de tijera en el interior del túnel y cortar el tejido sobre el nervio. Continuar el corte lateral, siguiendo el nervio, para aislarlo. (Un par de milímetros es suficiente para que fijando el ganglio, pero exponer al menos 5 mm de la AGN si va a grabar de ella.) </li><li> Separe la AGN de los músculos que inerva mediante la reducción de las conexiones. </li><li> Repetir en el otro lado para aislar el agn otros. </li><li> Una vez que ambos s AGN han sido disecados, cortar todos los músculos y el tejido que conecta el STG con el estómago. </li></ol></li><li> Aislar el s. mvn Son un par bilateral de los nervios pequeños se ramifican los LVN y atraviesa lateralmente por debajo de la grasa. <ol><li> O bien utilizar tijeras o pinzas de dos a cortar la grasa en un lado de la DVN, cerca de donde se bifurca en el s. dos LVN Aquí están lejos de la s mvn y no correrá el riesgo de cortarlos. </li><li> Levante la capa de grasa, e identificar la parte de abajo mvn pequeños. Estos nervios corren por dentro de lateral justo por detrás del nivel de los músculos GM1b. </li><li> Eliminar la capa de grasa por encima de la mvn, dejando el nervio intacto, por ahora lo que no se enrede. Que reducirá su extremo lateral de sobre el estómago, al final de la disección. </li><li> Repita el proceso en el otro lado para aislar el mvn otros. </li></ol></li><li> Aislar el s LVN y los nervios posteriores. <ol><li> A partir de la rama donde lvn s lateralmente fuera de la DVN, siga una LVN cortando la grasa por encima de ella. Dependiendo de la preparación, a veces toda la capa de grasa sobre el nervio se puede quitar. </li><li> Siguen revelando el LVN hasta el punto donde las ramas de PSN. </li></ol></li><li> Aislar el PYN. <ol><li> Localice el PYN, es un nervio que viajan atrás en el píloro. </li><li> Quitar la membrana delgada que cubre la región. </li><li> Aislar el PYN cortando una pequeña sección del píloro, que se adjunta a la PYN. </li><li> Levante con cuidado la sección pilórica y cortar el tejido en ambos lados de la PYN hasta llegar a la rama que se conecta al PDN. </li></ol></li><li> Aislar el PDN. <ol><li> Localice el PDN, que es un nervio que viajan atrás en el músculo dilatador del píloro. </li><li> Cortar una pequeña sección del músculo dilatador del píloro, que se adjunta al NPD. </li><li> Levante con cuidado la sección del músculo dilatador del píloro, cortar el tejido en ambos lados de la PDN, hasta llegar a la rama que se une a la PYN. </li></ol></li><li> Aislar el LVN ventral, que conecta el PYN y PDN, el LVN. <ol><li> En el punto de poder triangular donde el PDN PYN y conectar con el LVN ventral, aislar cualquier pequeña sección del nervio que sale de la LVN ventral, como el vpln. Este será utilizado como un identificador para tirar de la LVN ventral. </li><li> Levante el mango y cortar el tejido en ambos lados de la LVN ventral, trabajando en la dirección anterior hasta llegar al punto donde las ramas de PSN. </li></ol></li><li> Repita los pasos 10 a 13 para aislar los nervios LVN y posterior en el otro lado. </li><li> Separe el sistema nervioso stomatogastric del estómago. <ol><li> Para separar totalmente el LVN del estómago, tire de la psn y cortar todos los tejidos y nervios conectados a los LVN y LVN ventral, a excepción de la PDN y PYN. Repita este proceso en el otro lado. </li><li> Corte el extremo lateral de cada mvn. Levante el extremo lateral y cortar los archivos adjuntos extraños entre el nervio y el tejido del estómago subyacente. </li><li> En el extremo anterior, cortar los archivos adjuntos extraños a los ganglios de la comisura, y el corte del nervio vestibular de cada lado. </li><li> Visualmente escanear el sistema stomatogastric sistema nervioso para identificar y luego cortar los archivos adjuntos adicionales a los tejidos del estómago. </li><li> Agarrar el extremo anterior de ambos nervios comisurales, por encima de los ganglios de la comisura, y la cáscara del sistema nervioso stomatogastric fuera el estómago y moverlo a un lado del plato. Al hacer esto, cortar los archivos adjuntos restantes para liberar el sistema nervioso. </li></ol></li><li> Preparar el plato Sylgard pequeños. <ol><li> Aplicar un poco de tejido del estómago a fondo en la superficie de la Sylgard en el plato pequeño. Esto va a disminuir la hidrofobicidad de la Sylgard, por lo que la solución salina se distribuyen uniformemente a través de la antena. </li><li> Enjuagar y llenar el recipiente con solución salina refrigerada Sylgard. </li></ol></li><li> Transferir el sistema nervioso para el plato Sylgard preparado por el acaparamiento de los extremos anteriores de los nervios comisurales, el levantamiento del sistema nervioso del plato grande, y por la que en el plato pequeño. </li><li> Pin de la STNS en el plato pequeño con una combinación de los pines minuten y delgado pines corte de alambre de tungsteno. <ol><li> Asegúrese de que la preparación es la parte dorsal por la comprobación de que el nervio inferior del ventrículo está en dirección opuesta a la Sylgard. </li><li> Quitar el cerebro y el pin de los nervios comisurales. </li><li> Tire suavemente del sistema nervioso apretados y planos, tirando cada una de las s psn posterior y lateral, y la fijación hacia abajo. </li><li> Quitar el músculo dilatador del píloro del PDN, s, y el pin s. PDN </li><li> Quite elsegmento pilórica del PYN s, y el pin s. PYN </li><li> Precisar los nervios que quedan aislados, como los nervios labial, el s mvn y s. agn </li></ol></li><li> Desheath el STG. <ol><li> Asegúrese de que el STG es plana contra la Sylgard y mantiene tensa por el lateral s agn, la anterior y la stn dvn posterior. </li><li> Organizar la iluminación para permitir la visualización de los axones en el DVN. </li><li> Utilizando una aguja pequeña aguja de tungsteno o bien, hacer un pequeño agujero poco profundo en la vaina que rodea el DVN, justo por detrás del STG. </li><li> Saque la aguja a través de la DVN, dorsal a los axones, la creación de un desgarro horizontal en la vaina del nervio. </li><li> Agarrar la solapa de la vaina del nervio posterior a la STG y tire hacia delante para retirar la cubierta de la cara dorsal de la STG. </li></ol></li></ol><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Abreviaturas: </td></tr><tr><td> STNS </td><td> Sistema nervioso Stomatogastric </td></tr><tr><td> STG </td><td> Ganglio Stomatogastric </td></tr><tr><td> COG </td><td> Ganglio comisural </td></tr><tr><td> stn </td><td> nervio stomatogastric </td></tr><tr><td> mvn </td><td> nervio medial ventricular </td></tr><tr><td> ion </td><td> los nervios del esófago inferior </td></tr><tr><td> hijo </td><td> los nervios del esófago superior, </td></tr><tr><td> agn </td><td> nervio gástrico anterior </td></tr><tr><td> dvn </td><td> nervio dorsal del ventrículo </td></tr><tr><td> LVN </td><td> nervio lateral del ventrículo </td></tr><tr><td> psn </td><td> los nervios del estómago posterior </td></tr><tr><td> vpln </td><td> ventral del nervio lateral posterior </td></tr><tr><td> PYN </td><td> nervio pilórica </td></tr><tr><td> PDN </td><td> nervio dilatador pilórica </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Marder, E., Bucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+pattern+generators+and+the+control+of+rhythmic+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Central pattern generators and the control of rhythmic movements.</a> Curr. Biol. 11, R986-R996 (2001).</li>
<li>Nusbaum, M. P., Beenhakker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-systems+approach+to+motor+pattern+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A small-systems approach to motor pattern generation.</a> Nature. 417, 343-350 (2002).</li>
<li>Clemens, S., Massabuau, J. C., Legeay, A., Meyrand, P., Simmers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+modulation+of+interacting+central+pattern+generators+in+lobster+stomatogastric+ganglion%3A+influence+of+feeding+and+partial+pressure+of+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo modulation of interacting central pattern generators in lobster stomatogastric ganglion: influence of feeding and partial pressure of oxygen.</a> J. Neurosci. 18, 2788-2799 (1998).</li>
<li>Bierman, H. S., Tobin, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gross+dissection+of+the+stomach+of+the+lobster%2C+Homarus+americanus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Gross dissection of the stomach of the lobster, Homarus americanus.</a> J Vis Exp. 27, (2009).</li>
<li>Maynard, D. M., Dando, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+stomatogastric+neuromuscular+system+in+Callinectes+sapidus%2C+Homarus+americanus+and+Panulirus+argus+%28Decapoda+crustacean%29%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">The structure of the stomatogastric neuromuscular system in Callinectes sapidus, Homarus americanus and Panulirus argus (Decapoda crustacean).</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 268, 161-220 (1974).</li>
<li>Herrick, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+history+of+the+American+lobster%5BTitle%5D)+AND+%22Bull.+U.S.+Bur.+Fish%22%5BJournal%5D)">Natural history of the American lobster.</a> Bull. U.S. Bur. Fish. 29, 219-252 (1909).</li>
<li>Marder, E., Bucher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+circuit+dynamics+using+the+stomatogastric+nervous+system+of+lobsters+and+crabs%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Understanding circuit dynamics using the stomatogastric nervous system of lobsters and crabs.</a> Annu. Rev. Physiol. 69, 291-316 (2007).</li>
<li>Bucher, D., Taylor, A. L., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+pattern+generating+neurons+simultaneously+express+fast+and+slow+rhythmic+activities+in+the+stomatogastric+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Central pattern generating neurons simultaneously express fast and slow rhythmic activities in the stomatogastric ganglion.</a> J. Neurophysiol. 95, 3617-3632 (2006).</li>
<li>Mizrahi, A., Dickinson, P. S., Kloppenburg, P., Fénelon, V., Baro, D. J., Harris-Warrick, R. M., Meyrand, P., Simmers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+maintenance+of+channel+distribution+in+a+central+pattern+generator+neuron+by+neuromodulatory+inputs+revealed+by+decentralization+in+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Long-term maintenance of channel distribution in a central pattern generator neuron by neuromodulatory inputs revealed by decentralization in organ culture.</a> J. Neurosci. 21, 7331-7339 (2001).</li>
<li>Schulz, D. J., Goaillard, J. M., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variable+channel+expression+in+identified+single+and+electrically+coupled+neurons+in+different+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Variable channel expression in identified single and electrically coupled neurons in different animals.</a> Nat. Neurosci. 9, 356-362 (2006).</li>
<li>Schulz, D. J., Goaillard, J. M., Marder, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+expression+profiling+of+identified+neurons+reveals+cell-specific+constraints+on+highly+variable+levels+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Quantitative expression profiling of identified neurons reveals cell-specific constraints on highly variable levels of gene expression.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 13187-13191 (2007).</li>
</ol>

La anatomía de la langosta y el estómago STNS ha sido bien descrita previamente 5,6, y las variaciones de este procedimiento la disección se han utilizado en numerosos estudios. Se recomienda familiarizarse con la anatomía del estómago 5-7 y STNS 5,8 antes de la disección de inicio. Esa familiaridad hace que disminuya el riesgo de daños accidentales sufridos por los nervios y los tejidos. Para mantener la salud de la preparación, es fundamental para mantener la preparación a una temperatura fresca. Esto se logra fácilmente mediante el intercambio de la solución salina cada 30 minutos con solución salina a 4 ˚ C conservarse en la nevera. Cuando se sumerge en una solución salina fría, el aislamiento de preparación STNS es viable por muchas horas. Grabaciones en relación Homarus gammarus han demostrado una actividad rítmica estable desde el STG lo largo de 5 días in vitro 9; robustez similar se ha visto en el H. americanus (obs. pers.). Modulador de entrada a la STG de los ganglios de la comisura es necesario para preservar los patrones motores en marcha. Por lo tanto, para mantener una actividad normal rítmica estos ganglios y el hijo de iones, y los nervios STN deben mantenerse intactos. La disección se describe conserva varios nervios motores (que contiene los axones de la neurona motora): el s AGN (con molino gástrico (GM) axones), el mvn s (que contiene lateral gástrico (LG) e Inferior axones cardiaca (IC)), el s PYN (que contiene las neuronas pilórica (PY) axones), el PDN s (que contiene Dilatador pilórica (PD) axones), y la s LVN (que contiene pilórica lateral (LP), gástrico medial (MG), los axones de GLP, así como los de GM, PD y PA). Mediante la disección de más (o diferente) los nervios, otros axones de neuronas motoras pueden ser grabadas. Cada tipo individual de la neurona motora axonal puede registrarse de forma individual mediante la disección y el registro de los nervios que inervan los músculos a los que ese tipo de proyectos de las neuronas. Esta preparación se puede utilizar para una variedad de estudios se centraron en la función del sistema nervioso. La actividad de las neuronas podrán ser grabadas con registros intracelulares, el electrodo afilado de somata o axones, o mediante el registro de los impulsos eléctricos extracelular de los nervios. Muchos canales de iones en las neuronas STG han sido parcialmente clonado y el ARNm se puede medir de forma manual sacó somata 10,11.

<table><tbody><tr><td>Alambre fino de tungsteno (diámetro de 0,001 pulgadas)</td><td>Herramienta</td><td>California Fine Wire Company</td><td></td><td>Córtelo en trozos de 1-2 mm para usarlos como alfileres finos.</td></tr><tr><td>Pinzas n.º 5</td><td>Herramienta</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Alfileres Minuten</td><td>Herramienta</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte Moria (cuchillas de 7 mm)</td><td>Herramienta</td><td>Fine Science Tools</td><td>15370-52</td><td>Estas son de gama alta. Existen tijeras de resorte más económicas disponibles de la misma compañía.</td></tr><tr><td>Placa de Petri (100x15 mm)</td><td>Herramienta</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td>Llene con 2-4 mm de Sylgard 182.</td></tr><tr><td>Sylgard 182</td><td>Otro</td><td>Dow Corning</td><td>182</td><td></td></tr><tr><td>Soporte para alfileres</td><td>Herramienta</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td>Opcional. La desvainación puede realizarse únicamente con tijeras y pinzas finas.</td></tr><tr><td>Pinzas súper finas n.º 5SF</td><td>Herramienta</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Agujas de tungsteno</td><td>Herramienta</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-05</td><td>Opcional. La desvainación puede hacerse con tijeras o con alfileres cortados de alambre fino de tungsteno.</td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

homarus americanus stomatogastric la disección del sistema nervioso

Homarus Americanus Stomatogastric Nervous System Dissection

Con el objetivo de comprender cómo los sistemas nervioso produce la actividad y responder al medio ambiente, los neurocientíficos a su vez a los sistemas modelo que muestra la actividad de interés y son accesibles y susceptibles a los métodos experimentales. El sistema nervioso stomatogastric (STNS) de la langosta americana (<i&gt; Homarus americanus</i&gt;, También se sabe que la langosta del Atlántico o Maine) se ha establecido como un sistema modelo para estudiar el ritmo de generación de redes y la neuromodulación de las redes. El STNS consta de 3 ganglios anterior (2 ganglios comisural y un ganglio esofágicas), que contiene neuronas moduladoras que el proyecto de forma centralizada para el ganglio stomatogastric (STG). El STG contiene aproximadamente 30 neuronas que forman dos redes centrales de patrones de generación, las redes de píloro gástrico y que subyacen a los comportamientos de alimentación de los crustáceos<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Si bien es posible estudiar este sistema<i&gt; In vivo</i<sup&gt; 3</sup&gt;, El STNS sigue produciendo su actividad rítmica cuando se aíslan<i&gt; In vitro</i&gt;. El aislamiento físico de los STNS en un plato permite un fácil acceso a los cuerpos celulares en los ganglios de los registros electrofisiológicos intracelulares y los nervios de la STNS para las grabaciones extracelular. Aislar el STNS es un proceso de dos partes. La primera parte, la disección del estómago de los animales, se describe en un artículo de video que lo acompaña<sup&gt; 4</sup&gt;. En este artículo de vídeo, las técnicas de disección finas se utilizan para aislar el STNS del estómago. Este procedimiento da como resultado una preparación del sistema nervioso que está disponible para los registros electrofisiológicos.

Se describe la disección fina del sistema nervioso stomatogastric del estómago de la langosta americana (<i&gt; Homarus americanus</i&gt;).

Homarus americanus Stomatogastric La disección del sistema nervioso

Con el objetivo de comprender cómo los sistemas nerviosos producen actividad y responden al entorno, los neurocientíficos recurren a sistemas modelo que exhiben los...

El procedimiento para aislar el sistema nervioso gástrico ST de la langosta puede dividirse en dos partes: la disección gruesa y la disección fina. Este video cubre la disección fina del sistema nervioso gástrico somático a partir del estómago, incluyendo el ganglio estomatogástrico denominado STG y los ganglios comisurales conocidos como COGs. Esencialmente, los nervios y ganglios deben separarse del tejido circundante, comenzando con el aislamiento de los CGs, seguido por el aislamiento del STG. El resultado de este procedimiento es el sistema nervioso gástrico sistematizado, fijado en un recipiente y listo para ser utilizado en una variedad de estudios centrados en la función del sistema nervioso.Hola, soy Annalise Tobin del laboratorio de la Dra. Eve Martyr en el departamento de biología de la Universidad de Brandeis. Hola, soy Hillary Burman, también del Laboratorio Martyr. Hoy les mostraremos un protocolo para aislar el sistema nervioso gástrico somático del estómago de la langosta Homarus americanus con el fin de observar cómo se extrajo el estómago.Consulte nuestro protocolo en video adjunto en JoVE. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la función de las neuronas en pequeños circuitos neuronales que producen comportamientos rítmicos. Así que comencemos.Para comenzar, se requiere una preparación del estómago de la langosta para observar cómo se lleva a cabo este proceso. Vea el video adjunto en el que Beerman y Tobin primero orientan el recipiente de manera que el extremo interior, que está junto al labio, quede alejado de usted y el extremo posterior orientado hacia usted. Esta parte del procedimiento comienza con una sujeción más precisa de la preparación.Sujete el esófago en cada lado del labio y, si es necesario, reacomode las otras agujas colocadas durante la disección macroscópica para que el estómago quede plano. A continuación, retire la hipodermis agarrándola primero cerca del músculo gm, los músculos dos GM tres, desprendiéndola de estos músculos y tirando suavemente en dirección anterior. Separe la hipodermis de la grasa subyacente cortando cualquier conexión usando cuidado alrededor de la arteria central, que rodea parte del sistema nervioso gástrico somático; deje la hipodermis intacta.A una distancia aproximada de 0,5 centímetros alrededor del ganglio gástrico somático, que se encuentra entre los músculos GM uno B, ahora se puede cortar la hipodermis separada. El siguiente paso consiste en separar el cerebro del tejido subyacente. Comience identificando los dos grandes nervios comisurales que se proyectan bilateralmente desde la porción anterior del cerebro hacia los ganglios comisurales en la porción anterior del estómago.Dejando estos nervios intactos, levante suavemente el cerebro con pinzas y corte para separar el cerebro del resto del tejido. Tenga cuidado al hacer esto, ya que el nervio gástrico somático se encuentra debajo del cerebro y debe mantenerse intacto. Para separar los ganglios comisurales del tejido circundante, primero localícelos siguiendo uno de los nervios com hasta un ganglio.Ahora identifique el nervio IO y el nervio SO. Estos nervios deben permanecer intactos. Cada ganglio comisural tendrá muchos nervios que irradian hacia afuera.Corte la mayoría de ellos, excepto el ION y el SON. Deje un nervio adicional unido para sostener el ganglio comisural en su lugar mientras finaliza la disección. Ahora localice y recorte los nervios del otro ganglio comisural de la misma manera.A continuación, limpie el ION y el SON de lateral a medial. Deje el nervio labial intacto para anclar la preparación al estómago. El ganglio esofágico se encuentra con la intersección del iOS.Puede despejar debajo de ella agarrando el nervio ventricular inferior y apuntando hacia arriba para cortar por debajo. El siguiente paso es separar el STG del tejido circundante. El STG se encuentra dentro de una arteria que discurre entre los músculos GM uno B y hacia abajo hasta los músculos GM dos a B.Busque el extremo seccionado de la arteria cerca del gm. Dos músculos AB tiran de la arteria hacia arriba y en dirección interior para exponer el DVN. Continúe tirando hacia arriba para separar el hipodermis restante.Una vez separada, la arteria puede recortarse hasta el nivel en el que toca el hipodermis restante. A continuación, corte la lámina muscular que estaba situada en el rostro del langosta. Luego, levante el hipodermis por encima de la arteria.La arteria forma un túnel dentro de la grasa, por encima del MGT. Introduzca una hoja de las tijeras dentro de la arteria y corte el músculo por encima de ella.Verifique que puede ver el DVN mientras corta para asegurarse de que lo hace de forma segura. Por encima del STG, continúe cortando anteriormente siguiendo la arteria. Mientras corta por encima del STG, podrá observar el STN emergiendo anteriormente desde el STG y dirigiéndose hacia abajo dentro del músculo.Continúe cortando en dirección anterior para separar completamente el músculo por encima del STG. Elimine cualquier tejido alrededor del STN. Ahora podemos proceder a aislar varios nervios adicionales.Los siguientes nervios que deben separarse del tejido circundante son los NGA. Incluso si no tiene previsto realizar grabaciones del NGA, necesitará una porción de este para fijar el ganglio. Para visualizar mejor los NGA, retire el hipodermis restante y una capa delgada del músculo subyacente justo posterior al GST.Busque un túnel oscuro en la grasa y el músculo a ambos lados del nervio DVN, introduzca una hoja de las tijeras dentro del túnel y corte el tejido por encima del nervio. Continúe cortando lateralmente siguiendo el nervio para aislarlo. Un par de milímetros es suficiente para fijar el ganglio, pero exponga al menos cinco milímetros del A GN si planea realizar grabaciones de él.Desprenda un GN del músculo que inerva cortando las conexiones. Ahora repita este proceso en el otro lado para aislar el otro GN A. Una vez que ambos GNA hayan sido diseccionados, corte todos los músculos y tejidos que conectan el GST con el estómago. A continuación, aísle los vn M.Son un par bilateral de nervios pequeños que se ramifican desde el LVN y discurren lateralmente por debajo de la grasa. Utilice tijeras o dos pinzas para cortar a través de la grasa en un lado del DVN cerca del punto donde se ramifica en los dos LVN. Aquí se encuentra lejos del M VNS y no correrá el riesgo de cortarlos.Levante la capa de grasa y observe debajo en busca de un pequeño nervio. El VNSM discurre lateralmente justo posterior al nivel de los músculos GM1B. Retire la capa de grasa por encima del VNSM dejando el nervio intacto por ahora para que no se enrede.Cortará su extremo lateral y cualquier inserción en el M VNS al final de la disección del sistema nervioso. Repita el proceso en el otro lado para aislar el otro MVN. A continuación, en orden para el aislamiento, se encuentran los LVN en los nervios posteriores.Comenzando con la rama de las LVN lateralmente desde la DVN. Siga una LVN cortando la grasa por encima de ella. Dependiendo de la preparación, a veces se puede retirar toda la capa de grasa por encima del nervio.Continúe revelando el nervio lagrimal hasta el punto donde el nervio zigomático se ramifica. Ahora localice el nervio auriculotemporal. Es un nervio que discurre posteriormente sobre el poro.Retire la membrana delgada que cubre esta región. Aísle el PYN cortando una pequeña sección del pori adherida al recipiente del PYN. A continuación, levante suavemente la sección pric y corte el tejido a ambos lados del PYN hasta llegar a la rama que se une al PDN.Proceda con el aislamiento del nervio PDNA que discurre posteriormente al músculo dilatador del pric. Primero, corte una pequeña sección del músculo dilatador del pric adherida al NPD. Luego, levante suavemente la sección del músculo dilatador del pric.Corte el tejido a ambos lados del PDN hasta llegar a la rama que se une al PYN. Ahora localice el LVN ventral que conecta el PYN y el PDN con el LVN en el punto de bifurcación triangular donde el PYN y el PDN se unen al LVN ventral. Aísle cualquier pequeño segmento de nervio que se ramifique del LVN ventral, como el VPLN. Este se utilizará como una manija para tirar del LVN ventral elevando la manija.Corte el tejido a ambos lados del LVN trabajando en dirección anterior hasta llegar al punto donde el PSN se ramifica. Ahora ha disecado con éxito los nervios posteriores en un lado del estómago. A continuación, aísle el LVN y los nervios posteriores en el otro lado.Desprenda completamente el nervio vago izquierdo del estómago. Tire del nervio esplácnico y corte todos los tejidos y nervios adheridos al nervio vago izquierdo y al nervio vago ventral, excepto el nervio duodenal pancreático y el nervio yeyunal pancreático. Repita este procedimiento en el otro lado.A continuación, corte el extremo lateral de cada NVM. Levante el extremo lateral y corte cualquier inserción del NVM en el extremo anterior. Corte cualquier inserción en los ganglios comisurales y corte el nervio labial en cada lado.Examine visualmente el sistema nervioso gástrico somático para identificar y luego cortar cualquier otra conexión con el tejido gástrico. Una vez que haya cortado todas las conexiones, podrá sujetar el extremo anterior de ambos nervios comisurales por encima de los ganglios comisurales y desprender el sistema nervioso gástrico somático del estómago, moviéndolo hacia un lado del recipiente. Mientras realiza esto, corte cualquier otra conexión adicional para liberar completamente el sistema nervioso.La disección ya está completa. Comience preparando el platillo Söderberg al que se fijará el sistema nervioso. Frote un poco de tejido gástrico completamente sobre la superficie del Söderberg en el platillo pequeño.Esto disminuirá la hidrofobicidad del plato de agar de modo que la solución salina se distribuya uniformemente a través del recipiente. Enjuague y llene el plato de agar con solución salina fría. Transfiera el sistema nervioso al plato de agar preparado agarrando los extremos anteriores de ambos nervios comisurales.Levantar el sistema nervioso del recipiente grande y colocarlo en el recipiente pequeño. Para fijar el sistema nervioso, utilice una combinación de alfileres de minutiae y alfileres más finos. Corte primero el alambre de tungsteno y asegúrese de que la preparación esté con la cara dorsal hacia arriba, verificando que el nervio ventricular inferior apunte lejos del guardia sutil.Ahora retire el cerebro y sujete los nervios comisurales. Tire suavemente del sistema nervioso extendido y plano tirando de cada nervio SNP hacia posterior y lateral, y sujételos. A continuación, retire el músculo dilatador del P del SNP y sujete esos nervios.Luego, retire el segmento pilórico de los GYN y sujete los GYN. Finalmente, sujete cualquier nervio aislado restante, como los nervios labiales, los m vns y los AGN. El siguiente paso consiste en desenfundar el S st.Primero, asegúrese de que la S st G esté plana contra la protección S y sostenida de forma tensa por los AGN laterales. El STN anterior y el DVN posterior disponen la iluminación para permitir la visualización de los axones dentro del DVN. Luego, utilizando un alfiler pequeño o una aguja fina de tungsteno.Haga un pequeño orificio superficial en la vaina que rodea el DVN, justo posterior al STG. Pase la aguja a través del DVN tiñendo dorsalmente los axones para crear una rasgadura horizontal en la vaina del nervio. Ahora agarre una lengüeta de la vaina nerviosa posterior al STG y tire de ella hacia delante, luego corte para eliminar la vaina del lado dorsal del STG.Una vez retirada la vaina, el preparado está listo para el experimento, siempre que se mantenga frío entre aproximadamente cuatro y 15 grados Celsius. Se ha observado que este preparado permanece experimentalmente estable hasta cinco días. El sistema nervioso gástrico Sato intacto debe fijarse en forma de T contra el platillo de guardia Syl.Como se muestra, los nervios deben estar libres de daño y accesibles para grabaciones extracelulares. Los cuerpos celulares del STG intacto deben ser visibles y accesibles para grabaciones intracelulares. Acabamos de mostrarle cómo aislar el sistema nervioso gástrico somático de la langosta Homa Americana.Al realizar esta disección, es importante familiarizarse mucho con la anatomía para evitar dañar cualquier tejido o nervio. Asimismo, es fundamental mantener la preparación a una temperatura fría entre cuatro y 15 grados Celsius. Esto se puede lograr fácilmente durante la disección cambiando la salina cada media hora por salina fría que se haya mantenido en el refrigerador a cuatro grados Celsius mientras la preparación permanece fría.Es viable durante horas hasta días. Eso es todo. Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.

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