Name: Proteómica para identificar proteínas que interactúan con los canales de cationes P2X2 ligando (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-18T23:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 36 s
Description: Aprende a identificar proteínas que interactúan con el dominio C de receptores P2X2 mediante proteómica. Este método utiliza GST, SDS-PAGE y espectrometría de masas con lisado de cerebro de rata.

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PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL El procedimiento experimental (Fig. 2) consta de cuatro partes que se describen de una manera gradual a continuación. Parte 1: Subclonación y la expresión de la C-terminal de los receptores P2X2. Hemos expresado la longitud C-terminal de los receptores P2X2 en las bacterias para identificar las proteínas del cerebro al que se une. <ol><li> El C-terminal (residuos 353-472) de los receptores P2X2 (Fig. 1) fue amplificado por PCR, clonado en pGEX 4NT1 (GE Life Sciences) y se verificó con la secuenciación. </li><li> El plásmido recombinante se transformó en E. Coli (BL21) para la expresión de proteínas recombinantes. </li><li> Stocks de glicerol de bacterias (E. coli BL21) que contiene el P2X2 CT-GST plásmido se raspa con una punta de pipeta estéril y se inoculó en 5 ml de medio Luria-Bertani (LB) los medios de comunicación con el marcador adecuado selectiva (50 g / ml ampicilina) y incubaron durante la noche en un agitador orbital a 37 º C. </li><li> Las culturas crecido durante la noche se inocularon en 250 ml de medio LB con los antibióticos adecuados (50 mg / ml ampicilina) y se incubaron en un agitador orbital a 250 rpm durante 2-3 horas a 37 º C hasta que la densidad óptica a 600 nm alcanzó ~ 0.6-0.7. </li><li> La cultura fue inducida con 1 mM de IPTG y se incubaron a 37 º C durante 3 horas para la expresión de la proteína. </li><li> La cultura se separó luego a 5000 g durante 15 min a 4 ° C (1 ml de la cultura se ha guardado para analizar el nivel de expresión y etiquetados como &quot;inducida&quot;). Sobrenadante fue descartado y el pellet se resuspendió en 20 ml de solución salina de Tris-EDTA (STE) buffer (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8,0). </li><li> La suspensión se centrifugó a 5000 g durante 15 minutos en un tubo Falcon de 50 ml. El sobrenadante fue descartado y el pellet semi-seco se congeló a-70C durante la noche. </li><li> El-70C se resuspendió en 40 ml de solución amortiguadora de lisis fría (2% (w / v) sarkosyl, 15 mg de lisozima, 150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,5, 5 mM de TDT y la tableta completa inhibidor de la proteasa) , y la suspensión se incubó en hielo durante 30 min. Durante la incubación, 3 ml de glutatión-Sepharosa 4B cuentas se lavaron con 20 ml de tampón fosfato salino (PBS) y 20 ml T-PBS (0,1% (v / v) TritonX-100 en PBS), seguido por PBS. Las cuentas se resuspendieron en 1 ml de PBS. </li><li> La suspensión bacteriana se congelarse y descongelarse 3 veces en nitrógeno líquido y se sonica (1s de encendido / apagado de 30 micrones de tres minutos sobre el hielo) y se incubaron durante 30 minutos con un 4% (v / v) de Triton X-100, 10 mM MgSO 4 y 2 mM ATP en el hielo. </li><li> El lisado se centrifugó a 20.000 g durante 15 min a 4 ° C y el precipitado se descartó (una muestra de pellet y 1 ml de sobrenadante se guardó para SDS-PAGE para comprobar las cantidades de proteínas en el citosol y las membranas). El sobrenadante se incubó con las cuentas de una hora (o toda la noche) a 4 ° C. </li><li> Las bolas se giró a 500 g por 5 min y se descartó el sobrenadante (muestra se salvó de fracción libre). Las bolas se lavaron con PBS-T en cinco ocasiones (lavados se salvaron de los controles de lavado). </li><li> Las cuentas se resuspendieron en PBS a dar el 50% (w / v) los purines y se almacena en el refrigerador a 4 º C hasta su uso. La concentración de proteínas se estimó por el ensayo de Bradford (siguiendo las instrucciones del fabricante). </li></ol> Parte 2: Preparación de los lisados ​​de todo el cerebro P2X2 receptores son conocidos por ser altamente expresado en el cerebro 8. En el presente análisis, hemos tratado de identificar las proteínas que interactúan con los receptores P2X2 a partir de lisados ​​de cerebro de rata entera (Fig. 3). <ol><li> Cerebro de rata adulta fue cosechada (animales fueron sacrificados de acuerdo con un IAACUC UCLA-protocolo aprobado y de acuerdo con la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio) y aclararán inmediatamente helada PBS (3 veces). </li><li> Para lisar las células de 10 ml (~ 5 veces el peso húmedo del cerebro cosecha) de tampón de lisis helada que contiene 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaF, 1 mM Na 3 VO 4, 1 mM PMSF, 5 mg / ml de leupeptina, 1% (v / v) NP-40, y una tableta de inhibidor de la proteasa cóctel fue introducido en el cerebro cosechado. </li><li> El tejido cerebral se homogeneizó en el hielo con un homogeneizador de vidrio Dounce hasta obtener una mezcla de consistencia homogénea se logró. </li><li> Lisado celular se centrifugó a 2000 g durante 5 minutos para eliminar las células sin romper. El sobrenadante se recogió y se volvió de nuevo a 29.000 g durante 60 minutos para eliminar orgánulos intactos y agregados de la membrana. </li><li> Inmediatamente después de la centrifugación, el sobrenadante se transfirió a un tubo limpio. La concentración de proteínas del lisado de todo el cerebro se midió por el ensayo de Bradford (normalmente ~ 15 mg / ml). </li><li> El lisado se dividió en alícuotas y se almacenaron a-70C. </li></ol> Parte 3: Aislamiento de P2X2 C-cola proteínas asociadas Para identificar a los socios de unión de P2X2 CT-GST a partir de lisados ​​de todo el cerebro, un desplegable ensayo se realizó mediante el uso de CT-GST inmovilizado en glutatión sefarosa 4B cuentas como cebo. Para los controles, solo GST unida a las microesferas se utilizó. <ol><li> Cerebro lisado se precleared con cuentas de IVA durante 1 hora a 4C. El sedimento se desechó y el sobrenadante se utilizó para otros análisis. </li><li> Igual cantidad de GST y P2X2 CT-GST (10 mg) con destino a glutatión sefarosa 4 cuentas B se incubaron durante la noche con 100 g de proteínas precleared solubilizados lisado de cerebro de rata entera, con la rotación a 4 º C en el tampón de lisis. </li><li> Las cuentas se hace girar a 1000 g por 5 min y el sobrenadante fue descartado. </li><li> Las bolas se lavaron una vez con el tampón de lisis y se hierve en modificar Laemli buffer [4% (w / v) SDS, 10% (v / v) 2-mercaptoetanol, 2% (v / v) de glicerol, 0,004% (w / v) azul de bromofenol y 0,125 M pH 6,8 TrisCl] durante 5 min. </li><li> Las muestras se centrifugaron a 5000 g por 5 min y el sobrenadante se separó en un 10% SDS-PAGE (Fig. 4). Los geles fueron teñidos con gel de proteínas SYPRO Rubí mancha (de acuerdo con las instrucciones del fabricante) y se visualizaron bajo luz ultravioleta. P2X2 CT proteínas asociadas fueron comparados con los recuperados utilizando GST de cero como cebo. Cuatro réplicas biológicas fueron realizadas (es decir, cuatro cerebros y cuatro bajas tirar independiente). </li></ol> Parte 4: Identificación de proteínas. Proteínas separadas por electroforesis en gel fueron extirpados del gel y se identifican por espectrometría de masas 12. Nota: la ausencia de polvo durante todo el proceso es fundamental para reducir la contaminación de la queratina. El experimentador debe usar una mascarilla, red para el cabello y guantes en todo momento y nunca toque la región de gel de interés sin el uso de guantes. <ol><li> Todas las bandas de proteínas visible recuperado de la fuerza por P2X2 fueron extirpados con una cuchilla limpia y cortada en cubitos (Fig. 4). Regiones correspondientes del gel en la GST-pull nula por el carril también fueron extirpados de la misma manera sin tener en cuenta a las manchas de banda (bandas específicas para el cebo de GST-nulos fueron extirpados también e identificados), para asegurar que la presencia de proteínas por debajo del nivel de sensibilidad de la tinción no se ha perdido. </li><li> Las piezas de gel se incubaron con 200 l de bicarbonato amónico 50 mM en el 50% (v / v) acetonitrilo (ACN) y los tubos vortex durante 15 min a temperatura ambiente. Repita este paso de lavado. </li><li> Las piezas de gel se deshidrata mediante la adición de 200 l de acetonitrilo (piezas de gel se encogen y se vuelven opacas en color). </li><li> Acetontrile fue removido y las piezas de gel se seca en un speedvac de ~ 10 min. </li><li> Las piezas de gel fueron incubadas con 30 l de la recién preparada 10 mM Tris DTT/10 mM (2-carboxi-etil) clorhidrato de fosfina (TCEP) de un volumen suficiente para sumergir las piezas. Esto se dejó durante 30 minutos a baño de agua 56C. </li><li> A continuación la solución de DTT fue reemplazado con 100 l de bicarbonato de amonio 500 mM en una solución de acetonitrilo al 50% y las rodajas de gel se lavó con bicarbonato ammounium. </li><li> La solución de lavado fue aspirado y 200 l de acetonitrilo añadido a la deshidratación de los geles. </li><li> Acetonitrilo fue eliminado y 100 l recién preparada una solución de 100 mM yodoacetamida se añadió para alquilar sulfhidrilos libres. Este paso procedió durante 25 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. </li><li> Solución de yodoacetamida fue removido y las piezas de gel se lavaron con 200 l de bicarbonato amónico 50 mM en el 50% acetontrile (pH 8,0) durante 2 minutos, mientras agitación. Esta etapa de lavado se repitió. </li><li> Después de retirar la solución de lavado, las piezas de gel se incubaron con 200 l de acetonitrilo que se eliminó por speedvac de ~ 10 minutos. </li><li> En este paso las piezas de gel está listo para la digestión de tripsina. Piezas de gel se incubaron en 30 l de solución de tripsina (20 ng / l de concentración de trabajo) y se coloca en hielo durante 10 minutos para los geles de estar bien hinchado. Tripsina en exceso se eliminó y se rehidrata partículas de gel recubierto con 30 ml con bicarbonato amónico 50 mM para mantenerlos sumergidos a lo largo de la digestión que se le permitió continuar por 12 a 16 horas a 37 º C. </li><li> L Cinco de 5% (v / v) de ácido fórmico se añade a desactivar la digestión de la tripsina y la detención. </li><li> Los tubos se agitaron durante aproximadamente 15 min y se centrifuga brevemente para llevar el líquido a la parte inferior del tubo, que fue trasladado a un ml frasco limpio y etiquetado 0.5. </li><li> Próximos 30 l de 0,1% (v / v) de ácido fórmico en el 50% de acetonitrilo se añadió a piezas de gel por lo que fueron cubiertos solo dos veces seguido por agitación durante 10-15 minutos, separados por centrifugación breve. Este paso se repitió una vez, en sustitución del ácido fórmico y acetonitrilo entre los pasos. </li><li> El líquido final fue eliminado y se combinan todas las solución de extracción en un solo vial. Este volumen se redujo a aproximadamente 30 uL en el speedvac. La muestra estaba listo para la fase inversa nano-cromatografía líquida y la identificación de proteínas por espectrometría de masas. En este ejemplo concreto, este paso se lleva a cabo en un espectrómetro de masas en tándem Orbi-trampa de ThermoFclasificador (elegido por su alta precisión la masa, el ciclo de trabajo rápido para la detección de las proteínas y las características de funcionamiento en general robusta), aunque otros modelos e instrumentos de los fabricantes podría ser, junto con el enfoque descrito en este punto. </li><li> Los detalles y los criterios de análisis de espectrometría de masas son ahora una breve presentación. Todos los péptidos fueron separados de fase inversa nano-LC (Eksigent) y los péptidos fueron cargados en un C18 columna de fase inversa, con un caudal de 3 l / min. Una fase móvil fue de 0,1% de ácido fórmico y 2% de ACN en el agua; B de la fase móvil fue de 0,1% de ácido fórmico y el 20% de agua en ACN. Los péptidos se eluyeron de la columna a un flujo de 220 nl / min con un gradiente lineal de B un 5% a 50% de B durante 90 minutos, y luego a 95% de B durante 5 min y, finalmente, manteniendo constante B del 95% durante 5 minutos . Los espectros fueron adquiridos en los datos de modo dependiente de la Orbi-trampa que se utiliza para los análisis de MS y LTQ de MS / MS análisis. Los péptidos fueron identificados por búsquedas en los espectros de la base de datos de ratas IPI v.3.53 utilizando el algoritmo SEQUEST integrado en el paquete de software BioWorks. Cada péptido se reunieron los siguientes criterios: XCorr ≥ 2 (+1), ≥ 3 (2), ≥ 4 (3), y DeltaCN&gt; 0.1. Todos los espectros utilizados para la identificación de proteínas fueron inspeccionados de forma manual y no las proteínas aceptada cuando menos de dos péptidos fueron identificados. Sólo las proteínas presentes tras cada uno de los cuatro P2X2 bajas tirar y tirar ausente durante bajadas GST-fueron considerados nulos para otros análisis. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1178/1178fig1.jpg" alt="la figura 1" /> Figura 1. Representación esquemática de una subunidad del receptor P2X2. A. La caricatura muestra la topología de una subunidad del receptor P2X2. El dominio citosólico se compone de N y C terminales. El C-terminal de P2X2 receptor (rojo) se utiliza como cebo para tirar hacia abajo del ensayo. B. secuencia de aminoácidos del receptor P2X2 C-terminal utilizado en este estudio. <img src="/files/ftp_upload/1178/1178fig2.jpg" alt="" /> Figura 2. Diagrama de flujo y la línea de tiempo del protocolo usado para la expresión, purificación, tira hacia abajo y la identificación de las proteínas. Mostramos el esquema del protocolo con la línea de tiempo. Rata adulta lisado cerebro estaba preparado fresco inmediatamente antes del uso de la fuerza hacia abajo ensayos. <img src="/files/ftp_upload/1178/1178fig3.jpg" alt="" /> Figura 3. Representación esquemática de los análisis proteómicos de binarios P2X2 C-terminal de la red en el cerebro de la rata. El C-terminal de los receptores P2X2 fusionada con la proteína GST unida a las microesferas GST fue utilizado para tirar hacia abajo los ensayos. Cerebro lisado fue preparado y las proteínas se incubaron con las proteínas recombinantes inmovilizado. Fracción libre se lavó con el tampón de lisis. Se identificaron las proteínas por espectrometría de masas. <img src="/files/ftp_upload/1178/Fig%204%20Singh%20et%20al.jpg" alt="" /> Figura 4. Identificación de los socios de la unión del C-terminal de los receptores P2X2. Gel Sypro manchado muestra un espectro de proteínas putativo que interactúan con el C-terminal de los receptores de fusión con GST (caja azul). Carriles de los controles de GST sola (recuadro amarillo) y cuentas de glutatión sefarosa solo se muestran también. Las flechas indican ejemplos de bandas únicas que fueron extirpados para su posterior análisis por espectrometría de masas.

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</ol>

Los canales iónicos son una clase importante de proteínas integrales de membrana. Que contienen poros llenos de agua que permiten selectivamente el movimiento de iones por sus gradientes electroquímicos a través de la membrana plasmática. Los canales iónicos puerta entre abierta y cerrada de los estados. El paso de disparo es activado por los transmisores (por ejemplo, ATP) en el caso de los canales iónicos P2X ligando, o puede ser regulada por las interacciones con otras proteínas. La última década ha sido testigo de u...

<table><tbody><tr><td>Acrilonitrilo</td><td>Reactivo</td><td>JT Baker</td><td>9829-02</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida</td><td>Reactivo</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0156</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Reactivo</td><td>VWR international</td><td>VW1507-01</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato amónico</td><td>Reactivo</td><td>Fluka</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato amónico (APS)</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Adenosín trifosfato (ATP)</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de Bradford</td><td>Reactivo</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>B-392</td><td></td></tr><tr><td>Comassie azul R-250</td><td>Reactivo</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>Sc-24972</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Reactivo</td><td>EMD Millipore</td><td>3860</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Reactivo</td><td>VWR international</td><td>VW1474-01</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenglicol tetraacético (EGTA)</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8145</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Reactivo</td><td>EMD Millipore</td><td>11670-1</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de Sepharosa de glutatión 4B</td><td>Reactivo</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5132-01</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico (HCl)</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil-beta-D-tiogalactopiranosido (IPTG)</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15502</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamida</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>Medio Luria-Bertani (LB)</td><td>Reactivo</td><td>EMD Millipore</td><td>1.00547.5007</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptina</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8511</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62971</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Fluoruro de sodio (NaF)</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7920</td><td></td></tr><tr><td>Ortovanadato de sodio (Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;VO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>Reactivo</td><td>Fluka</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetanosulfonilfluoruro (PMSF)</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Tableta inhibidora de proteasas</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>Estandar de proteína</td><td>Reactivo</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0305</td><td></td></tr><tr><td>Sarkosyl</td><td>Reactivo</td><td>Acros Organics</td><td>61207</td><td></td></tr><tr><td>Vial con tapón roscado</td><td>Herramienta</td><td>Agilent Technologies</td><td>5182-0866</td><td></td></tr><tr><td>Dodecilsulfato de sodio</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>Tinte para geles de proteínas SYPRO&amp;#174; Ruby</td><td>Reactivo</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3125</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-Tetrametiletilendiamina (TEMED)</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Base de Tris</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tritón X-100</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Reactivo</td><td>Promega Corp.</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>Agua</td><td>Reactivo</td><td>Burdick &amp;amp; Jackson</td><td>365-4</td><td></td></tr><tr><td>Espectrómetro de masas en tándem LTQ-Orbitrap</td><td>Herramienta</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de cromatografía líquida en nanoescala</td><td>Herramienta</td><td>Eksigent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Mercapto&amp;#8211;etanol</td><td>Reactivo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td></td><td>EMD Millipore</td><td>GX0185-6</td><td></td></tr></tbody></table>

proteómica para identificar proteínas que interactúan con los canales de cationes p2x2 ligando

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Ligando la base de los canales iónicos de comunicación sináptica en el sistema nervioso 1. En los mamíferos hay tres familias de ligandos de canales: el lazo cys, el glutamato y los canales de los receptores P2X 2. En cada caso, la unión de emisor lleva a la apertura de un poro por donde fluyen los iones de sus gradientes electroquímicos. Muchos ligando los canales también son permeables a los iones de calcio 3, 4, que tienen funciones de señalización hacia abajo 5 (por ejemplo, la regulación de genes) que pueden superar la duración de la apertura del canal. Así, ligando los canales pueden ser señal en escalas de tiempo amplio que van desde unos pocos milisegundos a días. Teniendo en cuenta estas importantes funciones, es necesario entender cómo ligando los canales iónicos se están reguladas por las proteínas, y cómo estas proteínas pueden sintonizar señales. Estudios recientes sugieren que muchos, si no todos, los canales pueden ser parte de complejos de proteínas de señalización 6. En este artículo se explica cómo identificar las proteínas que se unen a los aspectos C-terminal del dominio del receptor P2X2 citosólica. Receptores P2X ATP-dependientes canales de cationes y constará de siete subunidades (P2X1-P2X7). Receptores P2X se expresan ampliamente en el cerebro, donde median la transmisión sináptica excitatoria y la facilitación presináptica de la liberación de neurotransmisores 7. Receptores P2X se encuentran en las células excitables y no excitables y mediar un papel clave en la señalización neuronal, la inflamación y la función cardiovascular 8. P2X2 receptores son abundantes en el sistema nervioso 9 y son el foco de este estudio. Cada subunidad P2X se cree que tiene dos segmentos que atraviesan la membrana (TM1 y TM2), separadas por una región extracelular intracelular 7 y N y C terminales (Fig. 1a) 7. Subunidades P2X 10 (P2X1-P2X7) muestran un 30-50% de homología de secuencia en el nivel de aminoácidos 11. Receptores P2X contienen sólo tres subunidades, que es el más simple estequiometría entre los receptores ionotrópicos. El P2X2 C-terminal consta de 120 aminoácidos (Figura 1b) y contiene varias proteínas consenso sitios de atraque, que apoya la hipótesis de que P2X2 receptor puede ser parte de complejos de señalización. Sin embargo, a pesar de varias funciones han sido atribuidas a la C-terminal de los receptores P2X2 nueve ningún estudio ha descrito los socios molecular que se acoplan a la parte intracelular de esta proteína a través de toda la longitud C-terminal. En este artículo se describen los métodos de una aproximación proteómica para identificar las proteínas que interactúan con el cuerpo entero C-terminal de los receptores P2X2.

Se describe un protocolo simple de identificar a las proteínas del cerebro que se unen a la terminal C de longitud completa de la ATP-dependientes P2X2 receptores. La extensión y aplicación sistemática de este enfoque a todos los receptores P2X se espera que conduzca a una mejor comprensión de la señalización del receptor P2X.

Proteómica para identificar proteínas que interactúan con los canales de cationes P2X2 ligando

Los canales iónicos activados por ligando son la base de la comunicación sináptica en el sistema nervioso1. En los mamíferos existen tres familias de canales activados por ligando: la de cys ...

Este procedimiento comienza con la sobreexpresión del extremo C recombinante del receptor Puric P dos X o P dos X dos, diseñado como una proteína de fusión GST tras la lisis bacteriana. La proteína purificada se incuba con perlas de glutatión seros cuatro B, y su concentración se determina mediante el método de Bradford. A continuación, se incuban proteínas provenientes de lisado de cerebro de rata purificado con el extremo C de los receptores P dos X dos unidos a glutatión, y los complejos proteicos unidos al extremo C de los receptores P dos X dos se aíslan mediante electroforesis en gel SDS-PAGE, excisión, y se identifican por espectrometría de masas.Hola, soy Harpring del laboratorio del departamento de Fisiología JIT K de la Universidad de California en Los Ángeles. Hola, soy Sarah Walburn del laboratorio de Tom Vka del departamento de Anestesiología de la Universidad de California en Los Ángeles. Hoy les mostraremos el procedimiento para aislar y purificar los CTS de los receptores P dos X dos.Utilizamos estas proteínas para identificar el origen en el cerebro rojo y en nuestro laboratorio empleamos estas proteínas para estudiar las consecuencias funcionales en los receptores

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La célula permeable reticulante DSP [ditiobis (propionato de succinimidilo)] estabiliza interacciones transitoria e...

El aislamiento de lábil Multi-complejos de proteínas por In vivo Control Celular entrecruzamiento y Inmuno-cromatografía de afinidad magnética

Un enfoque bioquímico se describe para identificar in vivo interacciones proteína-proteína (PPI) de proteínas de membrana. El método combina la reticulación de proteínas, purificación por afinidad y espectrometría de masas, y es adaptable a casi cualquier tipo de célula u organismo. Con este enfoque, incluso la identificación de los IBP transitorios se hace posible.

Membrana-COLUMNA: una herramienta bioquímica para identificar las interacciones proteína-proteína de Proteínas de la Membrana En Vivo

Técnicas de biosensor óptico pueden detectar cambios en la masa cerca de la membrana plasmática en las células vivas y permitir una para seguir las respuestas celulares tanto en células individuales y poblaciones de células. Este protocolo describe la detección de la modulación de los canales de potasio por G-receptores acoplados a proteína en células intactas utilizando este enfoque.

El uso de biosensores ópticos sin etiqueta para Detectar la modulación de los canales de potasio por la proteína G-receptores acoplados

Las proteínas interactúan entre sí y estas interacciones determinan en gran medida sus funciones. Los socios de interacción de proteínas se pueden identificar a alto rendimiento in vivo utilizando un ensayo de aptitud de levadura basado en el ensayo de complementación de fragmentos de proteínas de dihidrofolato reductasa (DHFR-PCA).

Genoma toda la Proteína-proteína interacción Screening por Complementación de ensayo de proteínas-fragmento (PCA) en las células vivas

El ensayo celular se describe está diseñado para la identificación del receptor de quimiocina CXC 4 (CXCR4)-agentes interactuantes que inhiben o estimulan, ya sea competitivo o allosterically, la intracelular Ca2 + liberación iniciada por activación de CXCR4.

Un ensayo de cinética basada en fluorescencia Ca2 + movilización para identificar G proteína-juntó el Receptor agonistas, antagonistas y moduladores alostéricos

Aquí, presentamos un protocolo de pantalla proteína extracelular microarrays para la identificación de las interacciones receptor-ligando novela en alto rendimiento. También se describe un método para mejorar la detección de interacciones proteína-proteína transitorias mediante el uso de complejos de proteína-microbead.

Tecnología de microarrays de proteínas extracelulares para detección de alto rendimiento de las interacciones ligando-Receptor de baja afinidad

Proporcionar sensibilidad unicelular, citometría de flujo en tiempo real está especialmente preparado para cuantificar las funciones de receptor multimodal de cultivos vivos. Con células progenitoras neurales adultas, la función del receptor P2X7 se evaluó mediante la afluencia de calcio detectado por colorante indicador de calcio, formación de poros transmembrana por absorción de bromuro de etidio y fagocitosis usando gotas de látex fluorescentes.

Citometría de flujo en tiempo real de células vivas para investigar la afluencia del calcio, formación de poro y fagocitosis por los receptores P2X7 en células progenitoras neurales adultas

Este protocolo presenta un método para medir la unión de nucleótidos de adenina a los receptores en tiempo real en un entorno celular. La unión se mide como transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) entre derivados de nucleótidos de trinitrofenilo y proteínas marcadas con un aminoácido fluorescente no canónico.

Medición de la unión de nucleótidos a proteínas de membrana intactas y funcionales en tiempo real

Se describen técnicas para generar una biblioteca de péptidos cortos que pueden activar los mastocitos a través del receptor MRGPRX2. Las técnicas asociadas son fáciles, económicas y se pueden extender a otros receptores celulares.

Detección de péptidos que activan MRGPRX2 utilizando células HEK modificadas

Aquí, presentamos un protocolo para permitir la captura e identificación de interacciones proteína-proteína específicas de la enfermedad de células y tejidos nativos utilizando sondas químicas y espectrometría de masas. Los conjuntos de datos de interacción resultantes se analizan a través de una plataforma web dedicada para revelar disfunciones dinámicas de la red y alteraciones de la vía relacionadas con la enfermedad.

Mapeo de interacciones proteína-proteína disfuncionales en la enfermedad

Un método ChIRP basado en UV para identificar interacciones directas entre ARNN y proteína.

Un método de chiIRP basado en UV para la identificación verificable de proteínas que interactúan directamente con el ARNnc: desde células cultivadas hasta testículo de ratón

Aprende a identificar proteínas que interactúan con el dominio C de receptores P2X2 mediante proteómica. Este método utiliza GST, SDS-PAGE y espectrometría de masas con lisado de cerebro de rata.

Proteómica para identificar proteínas que interactúan con los canales de cationes P2X2 ligando

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