Name: La preparación de los Drosophila Los embriones para Live-Imaging utilizando el protocolo de gota (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-13T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Aprenda a preparar embriones de Drosophila para imagen en vivo mediante el protocolo de gota suspendida. Este método sencillo evita la deshidratación, la hipoxia y la compresión, permitiendo obtener imágenes GFP de alta calidad durante varias horas.

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Agradecemos el apoyo de la HRB a través de una beca de descubrimiento, así como herramientas de investigación y subvención de instrumentos de las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC). También reconocemos H. Oda y el Bloomington Drosophila Stock Center para proporcionar materiales genéticos que se utilizaron en las secuencias de imágenes en vivo ejemplo.

Preparación <ol><li> Recoger los embriones en el estándar placas de agar jugo de uva-4. Es conveniente utilizar un sistema automatizado de Drosophila huevo Collector (flymax Scientific Equipment Ltd.). El uso sincrónico realizaron colecciones embrión reducir el número de dechorionations que se deben realizar a fin de obtener un número suficiente de embriones en la etapa de desarrollo deseado. </li><li> Prepare una diapositiva dechorionation uniendo un pedazo de cinta de doble cara a un portaobjetos de microscopio, retire el papel protector de la cinta. </li><li> Prepare la cámara de imágenes en vivo cortando un pedazo de tejido para que quepa en el pozo de la cámara. Coloque el tejido en el pozo y mojado con agua destilada. </li><li> Mezcle el aceite de halocarbonos (halocarbonos Products Corp.) la viscosidad de la serie 700 y serie 56 en una proporción de 1:1. La mezcla puede ser almacenada y utilizada de forma indefinida. </li><li> Coloque varias gotas de aceite de halocarbonos en la superficie de un cubreobjetos (22 x 40 mm, n º 2). El volumen no es crítica, pero debe ser del orden de l 20-40. </li></ol> Procedimiento <ol><li> Con la ayuda de un microscopio estereoscópico, recoger los embriones de la uva agar jugo de placas utilizando un par de pinzas de joyero (N º 5) o un pincel muy fino. Embriones tienden a pegarse entre sí y con puntas de la pinza &quot;, fácilmente se reunieron en grupos. </li><li> Con la ayuda de un microscopio estereoscópico, baje suavemente las acumulaciones de embriones que se han adherido a las puntas de la pinza sobre la superficie de la cinta en la diapositiva dechorionation. </li><li> Una vez más utilizando el microscopio estereoscópico, suavemente empujón o un accidente cerebrovascular que los embriones con el lado de la pinza con el fin de romper el corion cerosa exterior sin romper la membrana vitelina interna (el embrión va a estallar si la membrana vitelina se rompe). </li><li> Una vez que el corion exterior se ha roto, se burlan de el embrión del corion, el embrión dechorionated tiende a adherirse a la superficie de las pinzas. Tenga cuidado de no tocar el embrión dechorionated a la superficie de la cinta. </li><li> Tan pronto como un embrión es dechorionated, rápidamente se traslado a la caída previamente preparado de aceite de halocarbonos en el cubreobjetos. Toque la punta de la pinza que lleva el embrión dechorionated a la superficie de la gota de aceite de halocarbonos - esto desplaza el embrión de la pinza en el aceite. </li><li> Confirmar la transferencia del embrión a la gota de aceite. Esto se puede hacer a simple vista, siempre que se trabaja sobre un fondo negro y el uso de una fuente de iluminación de fibra óptica en un ángulo oblicuo. </li><li> Antes de intentar dechorionate otro embrión, limpie el aceite de la pinza. Pinzas recubiertas de aceite tienen menos de compra en la superficie del corion, por lo que dechorionation más difícil. </li><li> Dechorionated embriones son flotantes en el aceite de halocarbonos. Con unas pinzas o un pincel, y mientras se visualiza a través de un microscopio estereoscópico, empuje el embrión a la parte inferior de la gota de aceite y disponerla en la posición deseada. </li><li> Rápidamente invertir el cubreobjetos sobre el pozo de la cámara de imágenes en vivo. Confirmar que los embriones están descansando contra el cubreobjetos en la orientación deseada. Debido a su flotabilidad en el aceite, los embriones ahora flotan en la superficie inferior del cubreobjetos. Fijar el cubreobjetos a la cámara de imágenes en vivo con cinta adhesiva. Ventilar la cámara haciendo agujeros en la cinta en la zona donde la cinta se extiende la brecha entre el final del cubreobjetos y el final del pozo de la cámara de imágenes en vivo. </li><li> Un microscopio de fluorescencia en posición vertical o un microscopio estereoscópico de fluorescencia se puede utilizar ahora a la imagen de los embriones. </li></ol>

<ol><li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> J. Cell Biol. 149, 471-490 (2000).</li>
<li>Schock, F., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+processes+associated+with+germ+band+retraction+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Cellular processes associated with germ band retraction in.</a> , 248-2429 (2002).</li>
<li>Reed, B. H., Wilk, R., Schock, F., Lipshitz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-dependent+apposition+of+Drosophila+extraembryonic+membranes+promotes+morphogenesis+and+prevents+anoikis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrin-dependent apposition of Drosophila extraembryonic membranes promotes morphogenesis and prevents anoikis.</a> Curr. Biol. 14, 372-380 (2004).</li>
<li>Wieschaus, E. p, Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWieschaus%2C+Ep+%22Drosophila%3A+a+practical+approach%22">Drosophila: a practical approach</a>. Roberts, D. B. , IRL Press Limited. Oxford, England. 199-227 (1986).</li>
</ol>

Se describe un nuevo método de preparación de los embriones de Drosophila para el análisis de imágenes en vivo, lo que llamamos el protocolo de gota. Por desgracia, no es posible utilizar el protocolo de gota si se trabaja con un microscopio invertido. En este caso la técnica de sándwich (como se describe en el resumen anterior) debe ser utilizado y la compresión de los embriones sigue siendo una preocupación. En experimentos donde se mide la forma y el tamaño de la celda con el fin de calcu...

Equipamiento de serie y los materiales necesarios para preparar a los embriones para vivir de imágenes utilizando el protocolo de gota incluyen los siguientes elementos: portaobjetos, cubreobjetos (22 x 40 mm, n º 2), cinta de doble cara, pinzas de joyero (Dumont estilo N º 5 ), halocarbonos aceite serie 56 y serie 700 (halocarbonos Products Corp.), un cuchillo o una hoja de un solo filo de la navaja, un pañuelo de papel, tijeras, agua destilada, la cinta de uso general, y una pipeta adecuada para la entrega de l 20-40. El protocolo de imágenes en vivo también se requiere una cámara de medida de imagen en vivo. Este es preparado por el corte de 5 mm que placa de policarbonato de plástico para las dimensiones de un portaobjetos de microscopio estándar (75 x 25 mm) y el uso de un rotor para crear una profunda depresión en la diapositiva 3 mm (20 x 55 mm). El acceso a un microscopio estereoscópico (microscopio de disección) y una fuente de iluminación de fibra óptica es también necesaria.

la preparación de los drosophila los embriones para live-imaging utilizando el protocolo de gota

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

La proteína verde fluorescente (GFP) basado en timelapse en vivo de imágenes es una técnica poderosa para el estudio de la regulación genética de procesos dinámicos, como la morfogénesis de tejidos, la adhesión célula-célula, o muerte celular. Embriones de Drosophila que expresan GFP son fácilmente imágenes utilizando microscopía estereoscópica o confocal. Uno de los objetivos del protocolo en vivo de imágenes es reducir al mínimo los efectos perjudiciales tales como la deshidratación y la hipoxia. Protocolos anteriores para la preparación de los embriones de Drosophila para vivir de imágenes de análisis que consistía en colocar los embriones dechorionated en el aceite de halocarbonos y intercalando entre ellos una halocarbonos permeables al gas de membrana y un cubreobjetos<sup&gt; 3.1</sup&gt;. La introducción de compresión a través de embriones de montaje de esta manera representa una complicación indeseable para cualquier análisis biomecánico basado en la morfogénesis. Nuestro método, que llamamos el protocolo de gota, los resultados de la viabilidad de los embriones durante excelentes imágenes en vivo y no requiere que los embriones se comprime. En pocas palabras, el protocolo de gota consiste en la colocación de los embriones en una gota de aceite de halocarbonos que se suspende de un cubreobjetos, que es, a su vez, en una posición fija en una cámara húmeda. Además de proporcionar el intercambio gaseoso y prevención de la deshidratación, este sistema se aprovecha de la flotabilidad de los embriones en el aceite de halocarbonos para evitar que se deriva de su posición durante la adquisición de timelapse. Este vídeo describe en detalle cómo recoger y preparar los embriones de Drosophila para imágenes en vivo a través del protocolo de gota. Este protocolo es adecuado para los embriones de imágenes dechorionated utilizando microscopía estereoscópica o cualquier microscopio de fluorescencia compuesto en posición vertical.

Un método simple, barato y eficaz de la preparación de los embriones de Drosophila para vivir de imágenes de análisis se presenta. El protocolo proporciona la humedad y el intercambio de gases y no comprime el embrión de Drosophila. Este método es adecuado para las buenas prácticas agrarias basadas en imágenes en vivo de embriones de Drosophila utilizando un microscopio estereoscópico o el microscopio compuesto en posición vertical.

La preparación de los Drosophila Los embriones para Live-Imaging utilizando el protocolo de gota

La imagen en vivo de lapso de tiempo basada en la proteína verde fluorescente (GFP) es una técnica potente para estudiar la regulación genética de procesos dinámicos tales como...

Hola. Me llamo Bruce Reed. Soy profesor asistente en el Departamento de Biología de la Universidad de Waterloo en Waterloo, Ontario, Canadá. Estamos creando hoy este archivo de videos para documentar una nueva técnica que hemos desarrollado para preparar embriones blandos para el análisis de imágenes en vivo.Al realizar análisis de imágenes en vivo utilizando embriones de drosófila, frecuentemente empleamos la adquisición lapseada, la cual puede durar varias horas. Por lo tanto, es importante contar con una técnica en la que los embriones estén protegidos contra la deshidratación y la hipoxia. Además, también deseamos desarrollar una técnica que evite cualquier compresión del embrión.En el montaje, lo que hemos desarrollado es un método muy sencillo, económico y eficaz que denominamos preparación de gota colgante. La preparación de gota colgante es adecuada para el análisis por imágenes en vivo de embriones utilizando microscopía estereoscópica o cualquier microscopio compuesto vertical. Esta película de lapso de tiempo muestra ocho embriones que expresan GFP preparados mediante el protocolo de gota colgante e imagenados por microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo.Esta secu

the-preparation-drosophila-embryos-for-live-imaging-using-hanging

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Hemocitos Drosophila se dispersan sobre la totalidad del embrión en desarrollo. Este protocolo demuestra cómo montar y la imagen de estas migraciones el uso de embriones con hemocitos marcados con fluorescencia.

Imágenes en directo de Drosophila melanogaster Migraciones hemocitos embrionarias

Aquí se presenta un protocolo de montaje para...

Imagen de la posición vertical Drosophila Los embriones

Preparación Individual Drosophila Huevos Cámaras de Imágenes en directo

El cinetocoro es donde el SAC inicia su señal de control de la segregación mitótica de las cromátidas hermanas. Se describe un método para visualizar la contratación y la rotación de una de las kinetochore proteínas y su coordinación con el movimiento de los cromosomas...

El estudio de puesto de control mitótico, ilustrando comportamiento dinámico de proteínas cinetocoro y el movimiento de cromosomas en vivo<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones Sincitial

Este video describe cómo realizar microinyecciones que administran reactivos en embriones vivos de Drosophila. Los investigadores pueden utilizar este método para introducir compuestos exógenos como ácidos nucleicos y proteínas durante las primeras etapas del desarrollo embrionario. El protocolo presentado demuestra cómo configurar y realizar el procedimiento para la inyección de cualquier reactivo soluble, en este caso, una proteína fluorescente para experimentos de imágenes en vivo.

Microinyección de embriones vivos de Drosophila: entrega temprana de reactivos al embrión en desarrollo

Aquí se describe un método eficaz para estudiar la dinámica de aclaramiento celular...

Imágenes de Apoptotic Liquidación de células vivas durante<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriogénesis

Este protocolo presenta un método eficiente para obtener imágenes del neuroepitelio vivo del ojo de la pupa de Drosophila. Este método compensa el movimiento del tejido y la topología irregular, mejora la visualización de los límites celulares mediante el uso de múltiples proteínas de unión marcadas con GFP y utiliza un equipo de imágenes fácil de ensamblar.

Live-proyección de imagen de la Drosophila Pupal Ojo

Aquí se presenta un protocolo para microinyecyar y al mismo tiempo la imagen de múltiples embriones Drosophila durante el desarrollo embrionario utilizando un imager basado en placas y alto contenido.

Preparación y Microinyección de embriones de Drosophila para microscopía de células vivas realizada mediante un analizador automatizado de alto contenido

La microscopía de fluorescencia basada en láminas de luz es la herramienta más valiosa en biología del desarrollo. Un problema importante en los estudios comparativos es la varianza ambiental. Nuestro protocolo describe un marco experimental para la proyección de imagen viva simultánea de especímenes múltiples y, por lo tanto, trata este problema favorablemente activamente.

Imágenes simultáneas en vivo de múltiples embriones de insectos en microscopios de fluorescencia de hoja de luz basados en cámaras de muestra

Aquí, proporcionamos un protocolo de disección requerido para obtener imágenes en vivo de la gónada masculina embrionaria tardía de Drosophila . Este protocolo permitirá la observación de procesos celulares dinámicos en condiciones normales o después de la manipulación transgénica o farmacológica.

Disección e imágenes en vivo de la Drosophila gonad embrionaria tardía

Este protocolo describe el marcaje de fluorescencia personalizado basado en anticuerpos y la inyección en embriones tempranos de Drosophila para permitir la obtención de imágenes en vivo de proteínas de baja abundancia o modificaciones postraduccionales que son difíciles de detectar utilizando los enfoques tradicionales de GFP/mCherry-tag.

Visualización de proteínas de baja abundancia y modificaciones postraduccionales en embriones vivos de Drosophila mediante inyección de anticuerpos fluorescentes

Aprenda a preparar embriones de Drosophila para imagen en vivo mediante el protocolo de gota suspendida. Este método sencillo evita la deshidratación, la hipoxia y la compresión, permitiendo obtener imágenes GFP de alta calidad durante varias horas.

La preparación de los Drosophila Los embriones para Live-Imaging utilizando el protocolo de gota

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