La preparación de los Drosophila Los embriones para Live-Imaging utilizando el protocolo de gota
13 de marzo de 2009
Un método simple, barato y eficaz de la preparación de los embriones de Drosophila para vivir de imágenes de análisis se presenta. El protocolo proporciona la humedad y el intercambio de gases y no comprime el embrión de Drosophila. Este método es adecuado para las buenas prácticas agrarias basadas en imágenes en vivo de embriones de Drosophila utilizando un microscopio estereoscópico o el microscopio compuesto en posición vertical.
Hola. Me llamo Bruce Reed. Soy profesor asistente en el Departamento de Biología de la Universidad de Waterloo en Waterloo, Ontario, Canadá. Estamos creando hoy este archivo de videos para documentar una nueva técnica que hemos desarrollado para preparar embriones blandos para el análisis de imágenes en vivo.
Al realizar análisis de imágenes en vivo utilizando embriones de drosófila, frecuentemente empleamos la adquisición lapseada, la cual puede durar varias horas. Por lo tanto, es importante contar con una técnica en la que los embriones estén protegidos contra la deshidratación y la hipoxia. Además, también deseamos desarrollar una técnica que evite cualquier compresión del embrión.
En el montaje, lo que hemos desarrollado es un método muy sencillo, económico y eficaz que denominamos preparación de gota colgante. La preparación de gota colgante es adecuada para el análisis por imágenes en vivo de embriones utilizando microscopía estereoscópica o cualquier microscopio compuesto vertical. Esta película de lapso de tiempo muestra ocho embriones que expresan GFP preparados mediante el protocolo de gota colgante e imagenados por microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo.
Esta secuencia de imágenes representa más de cuatro horas de tiempo transcurrido. El inicio del movimiento indica que estos embriones se encuentran en condiciones viables. A continuación, le guiaremos a través de una descripción detallada paso a paso sobre cómo realizar el protocolo de gota colgante.
Los embriones se recogen en placas estándar de jugo de uva, huevo u otras. Utilizando un colector automático de huevos dsof FLA del equipo científico Fly max, el colector automático proporciona recogida sincronizada de embriones en una etapa de desarrollo predeterminada. En preparación para la decoración manual de embriones, se coloca un trozo de cinta adhesiva de doble cara sobre un portaobjetos de microscopio y se retira el respaldo de la cinta.
El protocolo de gota colgante requiere una cámara personalizada hecha de una lámina de plástico de policarbonato de cinco milímetros de grosor. La lámina se corta a las dimensiones de un portaobjetos de microscopio, y se realiza una depresión de tres milímetros de profundidad con un rotor. La humidificación de la cámara para imágenes en vivo se logra utilizando un trozo de tejido que se corta para ajustarlo al pocillo de la cámara y se humedece con agua destilada.
El aceite Halo Carbon es ideal para la obtención de imágenes en tiempo real de embriones de Drosophila porque es permeable a los gases y ópticamente claro. Mezclar el aceite Halo Carbon serie 700 y serie 56 en una proporción uno a uno da como resultado una viscosidad adecuada para trabajar con embriones de Drosophila. Los embriones pueden recolectarse de las placas de agar con jugo de uva utilizando pinzas de joyero o un pincel muy fino.
Los embriones se adhieren entre sí y a las puntas de la pinza. Se agrupan fácilmente en cúmulos, grupos de embriones. Adheridos a la pinza.
Las puntas se bajan suavemente sobre la superficie adhesiva de la cinta en la portaobjetos de decoración previamente preparado. Mientras se observan los embriones a través de un microscopio estereoscópico, empuje suavemente los embriones o páselos con el lado de la pinza. Debe abrir la corone sin romper la membrana interna de vilin.
Esto requiere una mano firme, paciencia y algo de práctica. Una vez que se ha roto la corona externa, el embrión desclorado tiende a adherirse a la pinza. Tenga cuidado de no permitir que el embrión desclorado entre en contacto con la superficie pegajosa de la cinta.
Puede ser muy difícil recuperarlo de la cinta; transfiera rápidamente los embriones desclorinados al halo. Gotas de aceite de carbono en la cubreobjetos. Es recomendable mantener esto cerca tocando la punta de la pinza contra la superficie de la gota de aceite de carbono.
El embrión se desprende de la pinza y se transfiere al aceite; la transferencia del embrión puede confirmarse a simple vista utilizando un fondo negro y una fuente de iluminación de fibra óptica colocada en un ángulo oblicuo antes de clorinar el siguiente embrión. Es útil limpiar el aceite de las pinzas debido a su flotabilidad en el aceite de halo carbono. Los embriones coordinados flotan sobre la superficie de la gota de aceite.
Podemos controlar la posición y orientación de los embriones empujándolos hacia el fondo de la gota de aceite e invirtiendo rápidamente la cubeta en el protocolo de gota colgante. Invertimos la cubeta sobre el pocillo humedecido de la cámara de imagen en vivo. Cuando la cubeta se invierte, los embriones quedarán apoyados contra la cara inferior de la cubeta.
Las posiciones de reposo de los embriones se pueden verificar bajo un microscopio estereoscópico. Si no son satisfactorias, el procedimiento puede repetirse. Una vez que los embriones están en la posición deseada, la cubreobjetos se fija a la cámara de imagen en vivo con cinta.
La cámara se ventila cortando agujeros en la cinta. Los embriones ya están listos para ser observados.
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Descripción general
Este artículo presenta un método sencillo y eficaz para preparar embriones de Drosophila para análisis mediante imágenes en vivo. El protocolo garantiza una humedad adecuada y el intercambio de gases, a la vez que evita la compresión de los embriones, lo que lo hace adecuado para imágenes basadas en GFP.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología
- Técnicas de imagen
Antecedentes
- El análisis de imágenes en vivo de embriones de Drosophila se realiza comúnmente mediante la adquisición de lapsos de tiempo.
- Los embriones son vulnerables a la deshidratación y la hipoxia durante sesiones prolongadas de imágenes.
- Una técnica que evite la compresión de los embriones es esencial para obtener imágenes precisas.
- La imagen basada en GFP requiere condiciones específicas para obtener resultados óptimos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método que proteja a los embriones de Drosophila contra la deshidratación.
- Asegurar un intercambio gaseoso adecuado durante la adquisición de imágenes.
- Evitar la compresión de los embriones durante la adquisición de imágenes en vivo.
Métodos Utilizados
- Preparación de embriones de Drosophila para imágenes en vivo.
- Implementación del control de humedad durante las sesiones de imagen.
- Uso de estereomicroscopio o microscopio compuesto vertical para la obtención de imágenes.
- Aplicación de técnicas de imagen basadas en GFP.
Resultados principales
- El método mantiene eficazmente la humedad e intercambio de gases para los embriones.
- Los embriones permanecen sin comprimir, lo que permite una mejor calidad de imagen.
- La imagen basada en GFP produce resultados claros durante períodos prolongados.
- La técnica es sencilla y rentable para los investigadores.
Conclusiones
- Este método mejora la calidad de la imagen en vivo de embriones de Drosophila.
- Proporciona un enfoque confiable para investigadores en el campo.
- El protocolo puede adoptarse fácilmente en diversos entornos de laboratorio.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El imagenado en vivo de organismos modelo es fundamental para la validación de objetivos y el cribado fenotípico en las primeras etapas del descubrimiento. El protocolo de gota colgante aborda limitaciones clave como la deshidratación, la hipoxia y la compresión mecánica, que comprometen la viabilidad de los embriones y la calidad de los datos durante el imagenado por lapsos de tiempo prolongados. Al permitir un imagenado sin compresión y fisiológicamente relevante de embriones de Drosophila, este método facilita la eliminación de riesgos mecanicistas en intervenciones genéticas y farmacológicas en un formato escalable y rentable.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar la regulación genética en procesos dinámicos como la morfogénesis tisular y la adhesión celular sin artefactos mecánicos provocados por compresión.
- Valor operativo: Mantiene la viabilidad del embrión durante más de cuatro horas, lo que posibilita la observación longitudinal de la función génica y la dinámica de vías metabólicas.
- Valor predictivo: Reduce los falsos positivos derivados de fenotipos inducidos por estrés, mejorando la confianza en los ensayos de validación de dianas.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Proporciona una plataforma estandarizada y reproducible para imágenes en vivo basadas en GFP que minimiza la variabilidad ambiental.
- Valor operativo: Utiliza materiales de bajo costo y fácil acceso (aceite de halocarburo, cámara de policarbonato, cinta), adecuados para adaptación de alto rendimiento.
- Preparación del ensayo: Aprovecha la flotabilidad embrionaria en aceite para mantener la estabilidad posicional, reduciendo la deriva y mejorando la consistencia de la señal en la adquisición de imágenes de lapso de tiempo.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Continuidad Translacional: Permite la obtención de imágenes de procesos de desarrollo conservados que son relevantes para los modelos de enfermedades humanas, facilitando la extrapolación entre especies.
- Reducción Mecanicista de Riesgos: Permite observar comportamientos celulares (por ejemplo, muerte celular, adhesión) bajo condiciones fisiológicas, mejorando la confiabilidad predictiva para modelos preclínicos posteriores.
- Sistema Relevante para Enfermedades: Se pueden utilizar embriones de Drosophila que expresan reporteros GFP asociados a enfermedades para monitorear la modulación de vías en vivo.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El protocolo de gota colgante se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos iniciales, especialmente para ensayos que requieren imágenes dinámicas y sin compresión de reporteros codificados genéticamente.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis mediante la visualización directa de los efectos del silenciamiento génico o de la sobreexpresión génica en la morfogénesis embrionaria.
- Selección: Proporciona lecturas cuantitativas y resueltas temporalmente mediante fluorescencia, esenciales para comparar los efectos de compuestos o condiciones genéticas.
- Análisis: Genera datos de lapso de tiempo estables y de alta calidad, adecuados para análisis morfométrico y cuantificación fenotípica.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos genéticos en Drosophila con vías conservadas, orientando la selección de dianas para modelos de vertebrados.
- Reutilización Empresarial: La simplicidad y bajo costo del protocolo permiten su amplia adopción entre equipos como un método estandarizado de preparación para imágenes.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva al eliminar artefactos de compresión y mantener las condiciones fisiológicas durante la obtención de imágenes.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad mediante un control estandarizado de la humedad, el intercambio de gases y el manejo de embriones.
- Valor estratégico: Reduce el ruido biológico en campañas de cribado, aumentando la sensibilidad del ensayo y disminuyendo las tasas de falsos positivos.
- Impacto en la cartera: Permite tomar decisiones más confiables de continuar o descartar en la validación de objetivos al proporcionar datos fenotípicos de mayor fidelidad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de embriones de Drosophila y en técnicas de descorionación.
- Depende del acceso a aceites de halocarbono y herramientas básicas de microfabricación para la preparación de cámaras.
- Necesita la estandarización de la edad del embrión, el genotipo y la consistencia en el montaje entre diferentes usuarios.
- La adaptación a otros sistemas modelo puede requerir la optimización de la flotabilidad del aceite y de la geometría de la cámara.
- Limitación práctica: es más adecuado para embriones que permanecen flotantes en aceite de halocarbono; no es aplicable a tipos celulares más densos o adhesivos.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
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Title
0:15
Introduction
1:52
Step 1: Collect Embryos
2:24
Step 2: Prepare a Dechorionation Slide
2:51
Step 3: Prepare Imaging Chamber
3:32
Step 4: Place Halocarbon Oil on a Coverslip
4:05
Step 5: Picking Embryos From Plates
4:38
Step 6: Place Embryos onto Tape
5:01
Step 7: Roll Embryos to Remove the Chorion
6:15
Step 8: Transfer Embryos to Halocarbon Oil
6:47
Step 9: Push Embryos to Bottom of Oil
7:14
Step 10: Invert Coverslip on Live Imaging Chamber
7:38
Step 11: Secure Coverslip with Tape
