Name: Un método de alto rendimiento a nivel mundial para estudiar la morfología orgánulo en S. cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Aprende un método de alto rendimiento para incorporar marcadores GFP en genes no esenciales de S. cerevisiae mediante apareamiento y esporulación. Esta técnica permite visualizar la morfología de orgánulos como mitocondrias mediante microscopía confocal.

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Este trabajo fue apoyado por la Biotecnología y Ciencias Biológicas de Investigación (subvención 31/C15982), los Institutos Canadienses de Investigación en Salud, la Fundación Canadiense para la Innovación, el Conocimiento Columbia Británica Fondo para el Desarrollo, la Fundación Michael Smith de Investigación en Salud (subvención a CJR Loewen), y la lucha por la vista.

Material y métodos: <ol><li> Cepas de levadura: <ul><li> ACP1-GFP (GFP:: Su): C-terminal GFP-etiquetado de ACP1 fue generado por una PCR mediada por recombinación homóloga utilizando el plásmido pKT128 (contiene las buenas prácticas agrarias y HIS5). Transformantes positivos fueron confirmados por microscopía confocal y la colonia PCR. La cepa de antecedentes se BY7043 (MAT alfa can1Δ:: STE2pr-lue2 lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0) de Boone laboratorio (Tong y Boone, 2006). </li><li> Eliminación de matriz mutante (DMA) (xxx:: KanR): es un conjunto de alrededor de 5.000 mutantes de deleción de genes no esenciales. Todos estos genes no esenciales fueron eliminados en la G418. La cepa de antecedentes de la matriz es BY4741 (MATA his3_1 leu2_0 met15_0 ura3_0). Nuestra DMA fue originalmente de Boone laboratorio. </li></ul></li><li> La incorporación de ACP1-GFP en la DMA: El siguiente protocolo para la toma de una amplia GFP es una adaptación del análisis genético sintético (SGA) tecnología (Tong y Boone, 2006) con modificaciones. Todos los pasos están depositadas réplica hecha usando un ROTOR Cantante de alta densidad arraying sistema robótico. Por otra parte, manual o fijando una base líquida de alta densidad de robots arraying puede ser utilizado. Siglas: YPD, extracto de levadura peptona-dextrosa, SD, el abandono de síntesis; LRK, Lue / Arg / Lys deserción medios de comunicación; LHRK, Lue / Su / Arg / Lys medios de deserción escolar Preparación <ol><li> Crecer el césped de ACP1-GFP células mediante el vertido de un 5 ml de la noche ACP1-GFP cultura sobre una placa de YPD. Permitir que la placa se seque lo suficiente por una llama o en una campana de extracción biológica. </li><li> Incubar la placa a 30 ˚ C durante la noche. </li><li> El uso de un robot, matriz ACP1-GFP cepa en 1536 colonias por placa. Al mismo tiempo, preparar una nueva copia de la DMA por réplica depositadas en placas YPD + G418. </li><li> Incubar las placas a 30 ˚ C durante la noche. El apareamiento y la selección diploide </li><li> Compañero de la cepa ACP1-GFP con la DMA por réplica de fijación y colocación de más de las colonias en las placas de YPD. </li><li> Incubar las placas a 30 ˚ C durante la noche. </li><li> Placa de réplica, las colonias en SD - Su + placas G418 para seleccionar las células diploides (MATA / MATalpha). </li><li> Incubar las placas a 30 ˚ C durante la noche. Sporulationg y la germinación </li><li> Placa de réplica, las colonias diploides en los medios de comunicación una mayor esporulación, el cual contiene los niveles de reducción de fuentes de carbono y nitrógeno para inducir la formación de esporas meióticas. </li><li> Las placas se incuban a 25 ˚ C durante un mínimo de 5 días. </li><li> Germinan las progenies MATa meiótica de las colonias en placas replica-LRK los medios de comunicación e incubar las placas a 30 ˚ C durante dos días. </li><li> Este medio se induce la germinación de las células haploides a partir de esporas. Desde un marco de apertura de la lectura LUE2 (ORF) se integra en el promotor MATa específicos STE2, todos los haploides germinado se MATA. Selección de los dos alelos </li><li> Ahora es necesario seleccionar tanto el alelo GFP y el alelo mutante único. Para lograr esto, las células de Mata son réplica chapada en los medios de comunicación LRK + G418, que selecciona las células haploides que llevan el gen de supresión (xxx:: KanR). </li><li> Incubar las placas a 30 ˚ C durante la noche. </li><li> Por último, las progenies MATa meiótica son réplica chapada en LHRK medios G418 + para seleccionar el crecimiento de los mutantes individuales (xxx:: KanR) también alberga ACP1-GFP (GFP:: Su). Estas placas pueden ser almacenadas a 4 ˚ C durante un máximo de 3 meses. </li></ol> El siguiente protocolo para la toma de una amplia GFP es una adaptación del análisis genético sintético (SGA) tecnología (Tong y Boone, 2006) con modificaciones. Todos los pasos están depositadas réplica hecha usando un ROTOR Cantante de alta densidad arraying sistema robótico. Por otra parte, manual o fijando una base líquida de alta densidad de robots arraying puede ser utilizado. Siglas: YPD, extracto de levadura peptona-dextrosa, SD, el abandono de síntesis; LRK, Lue / Arg / Lys deserción medios de comunicación; LHRK, Lue / Su / Arg / Lys medios de deserción escolar Preparación </li><li> Microscopía: <ol><li> Elija el que desee mutante (s) que expresa ACP1-GFP directamente desde la placa. </li><li> Se cultivan las células a 30 ° C en YPD o SD - Sus medios de comunicación para la fase de registro inicial. </li><li> Visualizar por microscopía confocal utilizando el filterset GFP. Un ejemplo del resultado esperado se muestra en la Figura 1. </li></ol></li></ol> SGA medios de comunicación: Los medios de cultivo (YPD) y los medios de selección (SD) que se utiliza en este protocolo se utiliza habitualmente en biología molecular de levaduras. Por favor refiérase a los métodos de la levadura (Amberg et al., 2005) para mayor información. LRK, LHRK los medios de comunicación (para un total de 400 ml) <table border="0"><tbody><tr><td> Añadir el fin </td><td> Cantidad </td></tr><tr><td> Base nitrogenada de levadura con sulfato de amonio </td><td> 2,7 g </td></tr><tr><td> Aminoácidomezcla </td><td> 0,8 g </td></tr><tr><td> Agar </td><td> 8 g </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> 360 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave </td></tr><tr><td> 20% de dextrosa </td><td> 40 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Enfriar a 65 ˚ C </td></tr><tr><td> 100 mg / ml canavanina </td><td> 0,2 ml </td></tr><tr><td> 100 mg / ml thialysine </td><td> 0,2 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Mezclar, verter 50 ml por placa </td></tr></tbody></table> LRK, LHRK + G418 medios de comunicación (para un total de 400 ml) <table border="0"><tbody><tr><td> Añadir el fin </td><td> Cantidad </td></tr><tr><td> Base nitrogenada de levadura sin sulfato de amonio </td><td> 0,7 g </td></tr><tr><td> Mezcla de aminoácidos </td><td> 0,8 g </td></tr><tr><td> Glutamato monosódico </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> Agar </td><td> 8 g </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> 360 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave </td></tr><tr><td> 20% de dextrosa </td><td> 40 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Enfriar a 65 ˚ C </td></tr><tr><td> 100 mg / ml canavanina </td><td> 0,2 ml </td></tr><tr><td> 100 mg / ml thialysine </td><td> 0,2 ml </td></tr><tr><td> 200 mg / ml G418 </td><td> 0,4 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Mezclar, verter 50 ml por placa </td></tr></tbody></table> Enriquecido esporulación los medios de comunicación (para el total de 400 ml) <table border="0"><tbody><tr><td> Añadir el fin </td><td> Cantidad </td></tr><tr><td> Acetato de potasio </td><td> 4 g </td></tr><tr><td> Extracto de levadura </td><td> 0,4 g </td></tr><tr><td> Dextrosa </td><td> 0,2 g </td></tr><tr><td> Esporulación mezcla de aminoácidos </td><td> 0,04 g </td></tr><tr><td> Agar </td><td> 8 g </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> 360 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Autoclave </td></tr><tr><td colspan="2"> Enfriar a 65 ˚ C </td></tr><tr><td> 200 mg / ml G418 </td><td> 0,4 ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Mezclar, verter 50 ml por placa </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAmberg%2C+DC+%22Methods+in+yeast+genetics+%3A+a+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+course+manual%22">Methods in yeast genetics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2005).</li>
<li>Tong, A. H., Boone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+genetic+array+analysis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic genetic array analysis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Mol Biol. 313, 171-192 (2006).</li>
</ol>

Este método puede ayudar a incorporar de manera eficiente un marcador mitocondrial, ACP1-GFP en varios mutantes antecedentes. Se basa en el uso de un sistema robótico, y fácilmente se puede adoptar para su uso con cualquier sistema robótico. Este procedimiento puede ser utilizado también para la incorporación de otros tipos de marcadores. Por ejemplo, para visualizar la sala de emergencia, nosotros usamos el marcador Erg11-GFP. En nuestras imágenes representativas, un mutante y un tipo salvaje con el fabricante de ACP1-...

<table><tbody><tr><td>Medios SGA</td><td></td><td></td><td>Los medios de crecimiento (YPD) y los medios sintéticos de eliminación (SD), incluyendo LRK y LHRK, así como el medio enriquecido de esporulación utilizados en este protocolo, se emplean habitualmente en biología molecular de levaduras. Para descripciones detalladas, consulte Methods in Yeast (Amberg et al., 2005).</td></tr></tbody></table>

un método de alto rendimiento a nivel mundial para estudiar la morfología orgánulo en s. cerevisiae

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

Métodos de alto rendimiento para examinar la localización de proteínas o la morfología orgánulo es una herramienta eficaz para el estudio de interacciones de proteínas y puede ayudar a lograr una comprensión integral de las vías moleculares. En Saccharomyces cerevisiae, con el desarrollo del conjunto de genes no esenciales la eliminación, que el mundo puede estudiar la morfología de los diferentes orgánulos como el retículo endoplasmático (ER) y las buenas prácticas agrarias con las mitocondrias (o variantes), los marcadores en los fondos genéticos diferentes. Sin embargo, la incorporación de los marcadores GFP en cada solo mutante individual es un proceso de trabajo intensivo. Aquí se describe un procedimiento que se utiliza habitualmente en nuestro laboratorio. Mediante el uso de un sistema robótico para manejar matrices de alta densidad de levadura y las técnicas de selección de medicamentos, se puede acortar significativamente el tiempo necesario y mejorar la reproducibilidad. En resumen, se cruza un marcador GFP-etiquetados mitocondrial (Apc1-GFP) en una matriz de alta densidad de 4.672 mutantes supresión de genes no esenciales de robótica depositadas réplica. A través de la selección diploide esporulación, la germinación y el marcador de selección dual, recuperamos los dos alelos. Como resultado, cada uno único mutante haploide contiene Apc1-GFP incorporado en su locus genómico. Ahora, podemos estudiar la morfología de las mitocondrias en todos los antecedentes mutante no esenciales. El uso de este enfoque de alto rendimiento, que convenientemente se puede estudiar y delimitar las vías y genes implicados en la herencia y la formación de orgánulos en un ambiente de todo el genoma.

De fusión GFP-proteínas son ampliamente utilizados para visualizar los orgánulos por microscopía confocal. Sin embargo, la detección de mutaciones que afectan a la morfología de los orgánulos por lo general requiere de mutagénesis individual y requiere mucho tiempo. En este caso, se demuestra un método para incorporar al mismo tiempo orgánulo-GFP marcadores en casi 5.000 genes no esenciales en la levadura.

Un método de alto rendimiento a nivel mundial para estudiar la morfología orgánulo en S. cerevisiae

Los métodos de alto rendimiento para examinar la localización de proteínas o la morfología de los orgánulos constituyen una herramienta eficaz para estudiar las interacciones proteicas y pueden ayudar a ...

Este procedimiento comienza con la preparación de un arreglo de un CP uno GFP, primero cultivando una línea de células y luego repicando el arreglo en una placa fresca. Al mismo tiempo, prepare una copia fresca de DMA. A continuación, aparee el arreglo ACP uno GFP con el DMA y seleccione los diploides, los cuales luego se esporulan en medio de esporulación.Cinco días después, la progenie mítica germina en medio LRK, en el cual solo crecerán los haploides MAT A. Mediante dos rondas adicionales de selección, recuperamos células haploides que portan tanto ACP1-GFP como un gen eliminado mediante canamicina. Finalmente, podemos seleccionar cepas individuales directamente de la placa y observar la morfología mitocondrial mediante microscopía confocal.Hola, soy Chap T del Laboratorio Law del Departamento de Biología Celular y del Desarrollo del Instituto de Ciencias de la Vida de la Universidad de Columbia Británica. Hola, soy Jesse Chao, también del Laboratorio Loan. Hoy les mostraremos un método de alto rendimiento para incorporar marcadores GFP en diversos fondos mutantes en levadura utilizando un sistema robótico.Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la mo

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Deleción del gen y la sobreexpresión de la proteína son métodos comunes para el estudio de las funciones de las proteínas. En este artículo se describe un protocolo para el análisis del fenotipo de desarrollo en función de la concentración de proteínas en la población y de una sola célula en los...

Análisis de la elaboración de un fenotipo morfológico en función de la concentración de proteínas en la levadura en ciernes

Un enfoque sólido para controlar la entrega de los orgánulos de la luz del ácido de la vacuola de levadura para la degradación y el reciclaje se describe. El método se basa en el etiquetado específico de los orgánulos de destino con una codificada genéticamente doble emisión de fluorescencia de pH biosensor, y la visualización de las células individuales mediante microscopía de fluorescencia.

Un ensayo de microscopía de fluorescencia para Mitophagy Vigilancia de la levadura Saccharomyces cerevisiae

Cuantitativa de células vivas por fluorescencia microscopia análisis de la levadura de fisión

Este protocolo describe el análisis de compartimentos intracelulares etiquetados fluorescentemente en levaduras en ciernes utilizando microscopía confocal 4D (time-lapse 3D) multicolor. Los parámetros de imagen se eligen para capturar señales adecuadas mientras se limitan los fotodaños. Los plugins Personalizados ImageJ permiten rastrear y analizar cuantitativamente las estructuras etiquetadas.

Microscopía 4D de levadura

Aquí, presentamos imágenes de células vivas que es un método de microscopía no tóxico que permite a los investigadores estudiar el comportamiento de las proteínas y la dinámica nuclear en las células de levadura de fisión viva durante la mitosis y la meiosis.

Examen de la dinámica nuclear de levadura de ficción mitotica y meiótica por microscopía de células vivas de fluorescencia

Los fenotipos de crecimiento de levadura se miden con precisión a través de imágenes de lapso de tiempo altamente paralelas de células inmovilizadas que crecen en microcolonías. Simultáneamente, se puede monitorear la tolerancia al estrés, la expresión proteica y la localización de proteínas, generando conjuntos de datos integrados para estudiar cómo las diferencias ambientales y genéticas, así como la heterogeneidad de la expresión génica entre las células isogénicas, modulan el crecimiento.

Imágenes en vivo de alto rendimiento de microcolonias para medir la heterogeneidad en crecimiento y expresión génica

A pesar de los avances recientes, muchas proteínas mitocondriales de levadura aún permanecen con sus funciones completamente desconocidas. Este protocolo proporciona un método sencillo y fiable para determinar la localización submitocondrial de proteínas, que ha sido fundamental para la elucidación de sus funciones moleculares.

Evaluación de la localización de proteínas submitochondriales en levaduras en ciernes Saccharomyces cerevisiae

La microscopía de lapso de tiempo es una herramienta valiosa para estudiar la meiosis en levaduras en ciernes. Este protocolo describe un método que combina la sincronización del ciclo celular, la microscopía de lapso de tiempo y el agotamiento condicional de una proteína diana para demostrar cómo estudiar la función de una proteína específica durante la segregación cromosómica meiótica.

Uso de microscopía de lapso de tiempo y agotamiento nuclear de proteínas en etapa específica para estudiar la meiosis en S. cerevisiae

La levadura de fisión se utiliza aquí como huésped heterólogo para expresar proteínas citoesqueléticas bacterianas como FtsZ y MreB como proteínas de fusión traduccional con GFP para visualizar su polimerización. Además, los compuestos que afectan a la polimerización se identifican mediante imágenes con un microscopio de fluorescencia.

La levadura de fisión como plataforma para el cribado de fármacos antibacterianos dirigidos a las proteínas del citoesqueleto bacteriano

Este protocolo detalla dos métodos de detención del ciclo celular de levadura y liberación opcional, y elabora el uso de microscopía de fluorescencia para estudiar los procesos dependientes del ciclo celular en S. cerevisiae.

Manipulación y análisis de procesos dependientes del ciclo celular en levaduras en ciernes

Aprende un método de alto rendimiento para incorporar marcadores GFP en genes no esenciales de S. cerevisiae mediante apareamiento y esporulación. Esta técnica permite visualizar la morfología de orgánulos como mitocondrias mediante microscopía confocal.

Un método de alto rendimiento a nivel mundial para estudiar la morfología orgánulo en S. cerevisiae

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