Un método de alto rendimiento a nivel mundial para estudiar la morfología orgánulo en S. cerevisiae
2 de marzo de 2009
De fusión GFP-proteínas son ampliamente utilizados para visualizar los orgánulos por microscopía confocal. Sin embargo, la detección de mutaciones que afectan a la morfología de los orgánulos por lo general requiere de mutagénesis individual y requiere mucho tiempo. En este caso, se demuestra un método para incorporar al mismo tiempo orgánulo-GFP marcadores en casi 5.000 genes no esenciales en la levadura.
Este procedimiento comienza con la preparación de un arreglo de un CP uno GFP, primero cultivando una línea de células y luego repicando el arreglo en una placa fresca. Al mismo tiempo, prepare una copia fresca de DMA. A continuación, aparee el arreglo ACP uno GFP con el DMA y seleccione los diploides, los cuales luego se esporulan en medio de esporulación.
Cinco días después, la progenie mítica germina en medio LRK, en el cual solo crecerán los haploides MAT A. Mediante dos rondas adicionales de selección, recuperamos células haploides que portan tanto ACP1-GFP como un gen eliminado mediante canamicina. Finalmente, podemos seleccionar cepas individuales directamente de la placa y observar la morfología mitocondrial mediante microscopía confocal.
Hola, soy Chap T del Laboratorio Law del Departamento de Biología Celular y del Desarrollo del Instituto de Ciencias de la Vida de la Universidad de Columbia Británica. Hola, soy Jesse Chao, también del Laboratorio Loan. Hoy les mostraremos un método de alto rendimiento para incorporar marcadores GFP en diversos fondos mutantes en levadura utilizando un sistema robótico.
Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la morfología de orgánulos como D, retículo endoplasmático y mitocondrias. Así que comencemos. Para este protocolo, utilizamos dos cepas de levadura diferentes.
Un CP uno GFP es una cepa con una etiqueta GFP en el extremo C-terminal de ACP uno, que se genera mediante recombinación homóloga mediada por PCR utilizando el plásmido PKT 1 28. El fondo de la cepa es BY 7 0 4 3. También utilizamos la cepa DMA o el arreglo de mutantes de deleción, que es un arreglo de aproximadamente 5.000 mutantes de deleción de genes no esenciales.
Todos estos genes no esenciales fueron eliminados en G cuatro 18. El fondo de cepa del arreglo es BY 47 41. Para comenzar, cultive colonias de células ACP uno GFP vertiendo cinco mililitros de un cultivo nocturno de ACP uno GFP sobre una placa con hiss.
Deje secar la placa suficientemente mediante una llama o en una campana extractora biológica. Una vez seca, incube la placa a 30 grados Celsius durante la noche. Después de la incubación, utilice un robot para distribuir la cepa A CP uno GFP en 1.536 colonias por placa.
Al mismo tiempo, prepare una copia fresca del DMA mediante pinzamiento por réplica a 18 placas YPDG. Posteriormente, incube las placas a 30 grados Celsius durante la noche después de que las cepas hayan crecido. Obtenga la cepa A CP uno GFP con el DMA mediante pinzamiento por réplica y superposición de las colonias en placas YPD, e incube las placas a 30 grados Celsius durante la noche.
Después de la incubación de la placa réplica, las colonias en placas SD hiss G cuatro 18 con el fin de seleccionar células transformadas se incuban a 30 grados Celsius durante la noche. Con el fin de iniciar la esporulación y germinación en la primera placa réplica, se replica el diploide a placas YPDG cuatro 18 para aumentar la eficiencia de esporulación en el siguiente paso. Después de incubar a 30 grados Celsius durante un día, se replica el diploide a medio de esporulación mejorado, que contiene niveles reducidos de fuentes de carbono y nitrógeno para inducir la formación de esporas meióticas.
A continuación, incubar las placas a 25 grados Celsius durante un mínimo de cinco días. Después de la incubación, germinar el material, una progenie mitótica, mediante la siembra por replica de las colonias en medio LRK. Este medio inducirá la germinación de células tabuladas a partir de esporas; incubar las placas a 30 grados Celsius durante dos días con el fin de seleccionar células que porten tanto el alelo GFP como el alelo mutante simple.
Las células Matt A se replica-platan en medio lade G cuatro 18, que selecciona células haploides que portan la deleción del gen; incubar estas placas a 30 grados Celsius durante la noche. A continuación, replicar por placa la progenie miótica de mat A en medio L-H-R-K-G cuatro 18 para seleccionar el crecimiento de mutantes simples que también porten ACP uno GFP, e incubar durante la noche a 30 grados Celsius.
Las placas pueden almacenarse entonces a cuatro grados Celsius durante hasta tres meses. Para visualizar los mutantes deseados que expresan una CP unida a GFP directamente desde la placa, comience por seleccionar las colonias deseadas de las placas. Incube las células a 30 grados Celsius en medio YPD o SD hiss hasta la fase logarítmica temprana.
Finalmente, visualice los mutantes utilizando microscopía confocal con el conjunto de filtros GFP; en esta imagen confocal, un mutante y un tipo silvestre con el marcador ACP1-GFP se visualizaron mediante microscopía confocal para estudiar la morfología mitocondrial. Este mutante en particular presenta un fenotipo mitocondrial alterado y, por lo tanto, es un buen candidato para investigaciones posteriores. Hemos demostrado cómo incorporar eficientemente un marcador multiclonal, el ACP1-GFP, en una matriz de mutantes de deleción utilizando un sistema robótico.
Al realizar este procedimiento, es importante preparar el medio de cultivo recién y permitir que el lugar tenga tiempo suficiente para secarse. Si hay demasiada humedad, se acumulará condensación, lo que aumentará el riesgo de contaminación. Además, debe verificar cuidadosamente que todos los medios de selección se hayan preparado correctamente, ya que son fundamentales para este protocolo.
Este procedimiento también puede utilizarse para otros tipos de marcadores. Por ejemplo, para visualizar er, utilizamos rutinariamente el marcador air 11 y GSP. Eso es todo.
Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.
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Descripción general
Este estudio presenta un método para incorporar marcadores de orgánulos con GFP en casi 5.000 genes no esenciales en levadura, agilizando el proceso de visualización de la morfología de los orgánulos. Mediante este enfoque, los investigadores pueden analizar eficientemente mutaciones que afectan la estructura de los orgánulos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Genética
Antecedentes
- Las proteínas de fusión GFP son herramientas esenciales para visualizar estructuras celulares.
- Los métodos tradicionales para cribar mutaciones son intensivos en mano de obra.
- La levadura sirve como organismo modelo para estudios genéticos.
- La microscopía confocal permite obtener imágenes detalladas de orgánulos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para la incorporación simultánea de marcadores de orgánulos.
- Facilitar el cribado de mutaciones que afectan la morfología de los orgánulos.
- Mejorar la eficiencia de los estudios genéticos en levaduras.
Métodos Utilizados
- Preparación de un arreglo CP uno GFP a partir de células en cultivo.
- Reproducción del arreglo GFP con un DMA para seleccionar diploides.
- Esporulación de diploides en medios específicos.
- Observación de la morfología mitocondrial mediante microscopía confocal.
Resultados principales
- Incorporación exitosa de marcadores de orgánulos-GFP en genes de levadura.
- Recuperación eficiente de células haploides con modificaciones genéticas deseadas.
- Visualización de la morfología de los orgánulos mediante microscopía confocal.
- Proceso optimizado para el cribado de mutaciones genéticas.
Conclusiones
- El método reduce significativamente el tiempo necesario para el cribado genético.
- Proporciona un marco robusto para estudiar la función de los orgánulos.
- Este enfoque puede aplicarse a diversos estudios genéticos en levaduras.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método de alta productividad para la morfología de orgánulos en levaduras permite la interrogación sistemática de la función génica en la biogénesis de orgánulos, apoyando la validación de dianas en las fases iniciales del descubrimiento. Al integrar el manejo robótico de matrices con selección mediante dos marcadores, proporciona datos fenotípicos escalables y reproducibles para la reducción de riesgos mecanicistas de descubrimientos genéticos. Este enfoque acelera el mapeo de vías y la priorización de dianas que afectan la función mitocondrial o del retículo endoplasmático en programas preclínicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación a nivel del genoma de las eliminaciones génicas sobre la morfología mitocondrial para validar dianas implicadas en la herencia de orgánulos.
- Valor operativo: Utiliza pinzas robóticas para procesar 4.672 mutantes de manera eficiente, reduciendo la manipulación manual y aumentando el rendimiento.
- Valor predictivo: Identifica modificadores genéticos de la estructura de orgánulos para reducir los riesgos asociados a las dianas en las primeras etapas del proceso de descubrimiento.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera resultados cuantificables de la morfología de orgánulos mediante microscopía confocal para la estandarización de ensayos.
- Valor operativo: Produce cepas con deleciones homocigotas y marcadores GFP integrados, asegurando una expresión constante del reportero en toda la matriz.
- Preparación para ensayos: Proporciona mutantes haploides dispuestos en matriz, listos para cribado de compuestos o mapeo de interacciones genéticas.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Traduccional: Relaciona los fenotipos de orgánulos en levaduras con vías conservadas relevantes para modelos de enfermedades humanas.
- Reducción Mecanicista de Riesgos: Clarifica la función génica en la biogénesis de orgánulos para apoyar la selección de dianas en la validación preclínica.
- Elucidación de Vías: Mapea redes genéticas que regulan la dinámica mitocondrial para orientar cribados de compuestos basados en mecanismos.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en la fase temprana de descubrimiento hasta la identificación de compuestos activos, al proporcionar datos sobre la morfología de orgánulos que aportan información sobre la confianza en el blanco y la relevancia de la vía antes del cribado de compuestos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la función génica en la formación de orgánulos mediante un perfilado morfológico sistemático.
- Tamizaje: Permite imágenes de orgánulos basadas en matrices, reproducibles, para tamizaje de alto contenido de perturbaciones genéticas o químicas.
- Análisis: Proporciona lecturas fenotípicas basadas en imágenes que permiten comparar condiciones mutantes con controles de tipo silvestre.
- Investigación Traducional: Relaciona defectos en orgánulos de levadura con procesos celulares conservados, con posible relevancia para modelos preclínicos de enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para el tamizaje fenotípico a escala de orgánulos mediante múltiples marcadores etiquetados con GFP.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona confianza predictiva en la validación de objetivos al vincular el genotipo con el fenotipo de orgánulos a gran escala.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad mediante un manejo robótico estandarizado y un flujo de trabajo de doble selección.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la evaluación paralela de miles de contextos genéticos.
- Impacto en la cartera: Facilita la priorización de objetivos ajustada al riesgo basada en fenotipos de morfología de orgánulos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en genética de levaduras, apareamiento, esporulación y microscopía fluorescente.
- Depende de sistemas robóticos de transferencia por puntas y de entornos de incubación controlados para el manejo de matrices.
- Necesita protocolos estandarizados de preparación de medios y de selección para evitar contaminación y asegurar la recuperación de mutantes.
- Implica consideraciones de adaptación al aplicar el método a marcadores de diferentes orgánulos (por ejemplo, retículo endoplasmático frente a mitocondrias).
- Limitado a cepas con genes no esenciales; los genes esenciales requieren enfoques alternativos, como alelos condicionales o CRISPRi.
