Pez cebra todo el montaje de alta resolución doble fluorescente In Situ La hibridación

Este procedimiento nos permite determinar los patrones de expresión génica en embriones de pez cebra con alta resolución; una sonda de riboprobes antisentido se hibrida con el ARNm diana complementario. La sonda de riboprobes marcada es reconocida por un anticuerpo conjugado con una enzima peroxidasa; se añade fluoro cuatro conjugado con aramida a los embriones y la peroxidasa convierte el IDE en un compuesto altamente reactivo. Esto conduce a la deposición estable del fluoro cuatro; el IDE no unido se elimina mediante lavados, revelando el patrón subcelular detallado de la distribución del ARNm.

La expresión de un segundo gen puede observarse utilizando una sonda con marcaje diferente y un fluoróforo distinto, lo que permite una comparación detallada de la expresión. Hola, soy Tim Brent del laboratorio de Scott Holly en el Departamento de Biología Molecular, Celular y del Desarrollo de la Universidad de Yale. Hoy les mostraremos un procedimiento para la hibridación in situ fluorescente doble de alta resolución en montaje completo de embriones de pez cebra en todo el laboratorio.

Utilizamos este procedimiento para estudiar la segmentación en pez cebra. Así que comencemos. Inicie el procedimiento con embriones que se fijaron durante la noche en frío en paraformaldehído.

Es fundamental utilizar un stock recién descongelado de paraformaldehído para esta fijación, a fin de lograr una tinción exitosa. Retire la solución fijadora y lave los embriones a temperatura ambiente dos veces durante cinco minutos cada vez con PBS. A continuación, retire el corion de los embriones.

Los embriones se colocan en placas de vidrio con cavidad. Utilizando pinzas de relojero, retire el Corian a partir de ahora. Use una pipeta de Pasteur de vidrio pulida al fuego para transferir los embriones.

De lo contrario, los embriones se adherirán a las puntas regulares de polipropileno. Los embriones desclorinados se transfieren mediante una serie de lavados con concentraciones crecientes de metanol. El último lavado se realiza en metanol al 100%.

Por último, los embriones se colocan en metanol fresco y se almacenan a menos 20 grados durante la noche. Al día siguiente, transfiera los embriones mediante una serie de lavados con concentraciones decrecientes de metanol y realice dos lavados con tampón PBST de cinco minutos cada uno. A continuación, fije los embriones con paraformaldehído durante 20 minutos.

Finalice la fijación corta con dos lavados de cinco minutos con PBST. Ahora estamos listos para permeabilizar los embriones. Los embriones fijados se vuelven permeables al incubarlos con la proteína ACE K. Asegúrese de colocar el tubo de microcentrífuga de lado.

La duración del paso de digestión depende de la edad del embrión. Por ejemplo, los embriones en etapa de agénesis somática se incuban durante tres a cuatro minutos. Enjuague brevemente con PBST y lave una vez con PBST durante cinco minutos.

Fije los embriones en paraformaldehído. Finalmente, lave los embriones dos veces en PBST durante cinco minutos. Los embriones ya están listos para la hibridación con las sondas de ARN.

Ahora que hemos fijado y permeabilizado los embriones, comenzamos el proceso de hibridación con una incubación de cinco minutos en alta menos a 65 grados Celsius. Recuerde precalentar la solución HIIN antes de usarla. A continuación, incube los embriones en alta más durante una hora.

De nuevo, recuerde precalentar la solución high plus. Ahora retire la mayor parte de la solución hip plus, pero deje 50 microlitros, asegurándose de que los embriones estén completamente sumergidos. Añada un microlitro de cada sonda y mezcle agitando suavemente el tubo.

A partir de ahora, cubra los tubos con papel de aluminio. Dado que la fluoresceína es sensible a la luz e incuba toda la noche a 65 grados Celsius, se realiza la hibridización. Por lo tanto, eliminemos las sondas en exceso a partir de ahora.

Se elimina el detergente para mejorar la tinción. Sin embargo, observe que los embriones se vuelven pegajosos en ausencia de detergente. Lave dos veces con solución de 50% de formamida y dos veces la concentración de XSSC durante 30 minutos cada vez.

Lave una vez con solución XSSC dos veces durante 15 minutos. Finalmente, lave dos veces con SSC 0,2 veces durante 30 minutos cada vez. A continuación, visualizaremos cada sonda.

Ahora podemos comenzar la detección de las sondas hibridadas. Detecte primero la sonda de fluoresceína porque es menos estable y más débil que la sonda de digoxigenina. Primero, bloquee con 500 microlitros de reactivo de bloqueo al 2% en tampón de ácido málico durante una hora a temperatura ambiente.

A continuación, agregue el anticuerpo anti-fluoresceína conjugado con peroxidasa en una dilución de uno a 500 en la solución de bloqueo. Incube durante la noche a cuatro grados Celsius. Asegúrese de colocar el tubo de microcentrífuga de lado.

A continuación, inicie la detección utilizando el sistema de amplificación de señal tyrom o TSA. TYROM IDE está conjugado a un fluoro cuatro. La peroxidasa de rábano picante en el anticuerpo convierte el TY IDE en un intermediario altamente reactivo. El TY IDE reactivo forma un enlace covalente con residuos cercanos al anticuerpo, lo que resulta en la deposición localizada del fluoro cuatro.

Comience con cuatro lavados de 20 minutos cada uno con tampón de ácido málico al 1x a temperatura ambiente, lavado dos veces en PBS. La IDE de fluoresceína se había disuelto previamente en DMSO para su almacenamiento. Someta este sustrato de TSA a una breve centrifugación.

A continuación, diluya el sustrato de TSA uno a 50 en el tampón de dilución para amplificación. Añada la solución a los embriones e incube durante 45 minutos. Coloque el tubo de microcentrífuga de lado.

Durante este paso de incubación, transfiera los embriones mediante una serie de lavados de 10 minutos con concentraciones crecientes de metanol. El último lavado consiste en 10 minutos en metanol al 100 %, seguido de una incubación de 30 minutos en una solución de peróxido de hidrógeno al 1 % para inactivar la peroxidasa del anticuerpo. De lo contrario, podría interferir con la detección del oxígeno dig.

Transfiera los embriones mediante una serie de lavados con concentraciones decrecientes de metanol y dos lavados de 10 minutos con tampón PBS. Esto asegura que todo el metanol sea eliminado. La etiquetación con anticuerpos del dig xigen y la sonda comienza con un bloqueo, de manera similar al anticuerpo anterior.

A continuación, agregue el anticuerpo antigitoxígenina en una dilución de uno a 1000. Coloque el tubo de microcentrífuga de lado e incube durante la noche en frío hasta el día siguiente. Lave a temperatura ambiente con tampón de ácido málico.

Luego, con PBS quickpin, el sustrato de cinco tiros de SCI. Dilúyalo uno a 50 y añádalo a los embriones. Incube durante 45 minutos colocando el tubo de lado.

Finalmente, lave tres veces con PBST. Un paso final de tinción con yoduro de propidio marca los núcleos. Comience con dos lavados de cinco minutos en dos XSSC.

A continuación, trate con ARNs durante 30 minutos a 37 grados. Lave seis veces con dos XSSC a temperatura ambiente y agregue ahora la solución de yoduro de propidio y tiña durante ocho minutos. Lave seis veces con dos XSSC.

Fije los embriones en paraformaldehído durante 20 minutos. Y finalmente, dos lavados de cinco minutos en PBST. La montaje de los embriones para su observación comienza con dos incubaciones de 10 minutos en glicerol al 25 % y al 50 %.

A continuación, coloque las muestras en glicerol al 75 % e incúbelas durante la noche a cuatro grados Celsius. Este paso de clarificación nocturno facilita la disección de los embriones. Finalmente, deseque y retire la yema de los embriones.

Con el fin de reducir la fluorescencia de fondo, monte los embriones en un portaobjetos para microscopio y examínelos al microscopio. Estas imágenes muestran una única sección confocal a través del extremo posterior de un embrión de pez cebra en el estadio de 10 somitas. La tinción roja muestra el ARNm de delta C detectado con una sonda marcada con digoxigenina y el reactivo TSA sci-fi.

La tinción verde representa su ARNm detectado con una sonda marcada con fluoresceína. Y los núcleos teñidos con el reactivo TSA fluoresceína y yoduro de propidio se colorean en azul en un embrión doblemente teñido.

Pueden determinarse sin ambigüedad regiones de expresión distintas o solapadas. Y este procedimiento revela la localización subcelular del ARNm, como se observa en estas vistas de aumento de su tinción. La transcripción activa del gen se evidencia mediante puntos de tinción en el núcleo.

Otras células exhiben localización citoplasmática del ARNm. En el embrión doblemente teñido, podemos observar células que transcriben ambos genes o cualquiera de los dos genes.

Por separado, acabamos de mostrarle cómo realizar una hibridación in situ fluorescente doble de alta resolución en preparación completa de embriones de pez cebra. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que primero debemos probar nuestras sondas utilizando sondas de tinción mediadas por fosfatasa alcalina estándar, ya que aquellas que produzcan una señal clara e intensa funcionarán bien en la hibridación in situ fluorescente.

También hemos utilizado con éxito la inmunolocalización de beta catenina en lugar de la tinción con yoduro de propidio. Cuando realizamos esta variación, llevamos a cabo las reacciones de hibridación a 55 grados Celsius en lugar de a 65. Eso es todo.

Gracias por ver el video y mucha suerte con sus experimentos.