Name: Banca cerebro: Aprovechar al máximo las muestras de su investigación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-24T16:02:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Aprenda a preparar muestras cerebrales para sección en criostato mediante muestreo sistemático en banca cerebral. Este protocolo preserva la integridad tisular para análisis estereológico no sesgado en neurociencia.

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Los autores desean agradecer a Ikiel Ptito por su apoyo técnico continuo.

Parte 1: Pre-procesamiento de tejidos <ol><li> Tejido debe ser buena perfusión con paraformaldehído, glutaraldehído, o formalina. Esto se puede lograr a través de la perfusión estándar transcardial normalmente se utiliza para la cosecha de otros órganos. En el presente estudio el tema fue profundamente sedado con clorhidrato de ketamina (10 mg / kg, im), sacrificados con una sobredosis de pentobarbital sódico (25 mg / kg, iv) y perfundidos transcardially con PBS 0,1 M hasta que esté completamente desangrado. Esto es seguido por una solución de paraformaldehído al 4% en PBS durante 5 minutos (aproximadamente 1 litro). </li><li> El cerebro debe ser stereotaxically bloqueado, removido del cráneo, pesado y determinado volumen 2. El tejido debe ser crioprotegieron en soluciones de sacarosa calificado con una concentración final de 30% de sacarosa en tampón fosfato. Bloques de tejido deberá congelarse en isopentano a -65 º C y almacenadas a -80 ° C hasta que esté listo para cortar. </li></ol> Parte 2: Muestreo sistemático <ol><li> El muestreo sistemático se basa en un plan adecuado antes de cortar. Toda la región de interés, tanto en la extensión rostral-caudal y dorsal-ventral deben estar bien definidos. Un atlas estereotáxico de la especie en uso es útil para definir la región de interés y para determinar la longitud de la región de interés. Una vez que la longitud de la región de interés se determina que es necesario establecer el intervalo de muestreo. Por ejemplo, desde el atlas estereotáxico a determinar que todo el rostro-caudal extensión de la región de interés es de aproximadamente 3 mm de longitud cuando se corte en el plano coronal. A continuación, decide establecer el criostato a la sección a 50 micras, a este paso, tendrá 60 secciones que abarcan la extensión rostral-caudal de la región de interés. Para un típico estudio imparcial estereológicos 10.06 secciones muestreados de manera sistemática se requiere para obtener resultados fiables. En este ejemplo, 10 secciones igualmente espaciados a lo largo de la medida resultado rostro-caudal en un intervalo de muestreo de 1 / 6 secciones. </li></ol> Parte 3: Creación de un banco de cerebros <ol><li> Una vez que la frecuencia de muestreo de la sección se ha determinado, el siguiente paso es determinar que las manchas se llevará a cabo de inmediato. Por ejemplo, si usted es la tinción con violeta de cresilo que captará 6.1 secciones en una diapositiva. Esta será la serie 1. Si usted sabe que hay quizá varias posibles anticuerpos que le gustaría correr, pero, o bien quieren ver los datos que proporciona la principal mancha o simplemente no tienen el tiempo para llevar a cabo la inmunohistoquímica, coloque el restante 5 series de secciones en el orden en que se cortan en preservar los pozos que contienen antígeno (1 polivinilpirrolidona%, 50% de glicol de etileno en o.1M PBS, pH 7,4). La siguiente tabla muestra un esquema de muestreo que consta de un tobogán y una placa (placa estándar de 48 pocillos) de las secciones como parte de un banco de cerebros (Tabla 1). <img src="/files/ftp_upload/1260/table1.jpg" alt="Tabla 1" /> Tabla 1. La frecuencia de muestreo sección aquí es 1 / 6. La primera sección se coloca en un portaobjetos para la tinción de violeta de cresilo y los próximos cinco secciones se colocan en el antígeno preservar. Número de la sección 7 es capturado en la diapositiva y las secciones se colocan en 9.12 antígeno preservar. Este ciclo se repite hasta la región de interés o un bloque de tejido se agota en secciones. </li><li> El siguiente paso es exhaustiva sección del bloque de tejido. Coloque una pequeña cantidad de medio de inclusión en el plato y deje que se congele. Coloque el plato en la cabeza del microtomo y afeitarse suficiente del medio congelados para tener una superficie plana. Quitar el plato de la cabeza microtomo y lugar plano en el criostato. Verter medio de inclusión en el plato y colocar el bloque con firmeza el cerebro con la parte cortada stereotaxically posicionado rotundamente en el plato. Lenta y completamente integrar el cerebro en medio de montaje. Coloque el plato con el cerebro en la cabeza del microtomo y la sección con los parámetros predeterminados para la frecuencia de muestreo de la sección. </li><li> Una vez que el bloque de tejido ha sido exhaustivamente seccionado y las secciones se colocan en los pozos, cubrir la placa con la tapa, ponga la tapa con parafilm, y colóquelo en un congelador a -20 ° C. Registrar el número total de secciones tomadas de cada serie, el intervalo de la sección de muestreo, y el número de serie de cada animal. Este registro será de vital importancia para realizar un seguimiento de la posterior retirada de las secciones del banco de cerebros de la inmunohistoquímica en el futuro. </li></ol> Parte 4: Resultados del representante: Muestreo sistemático de esta manera ha sido una práctica habitual en nuestro laboratorio durante los últimos 3 años. Hemos tenido un gran éxito la realización de inmunohistoquímica en el material que ha sido almacenado en el antígeno de preservar tres años después de que fue cortado, sin deterioro de la señal (Figura 1). Además, como parte de nuestro banco de cerebros que han registrado cerca de 20.000 secciones sistemática de los no humanoscerebro de los primates (Figura 2) como parte de nuestros planes de investigación a largo plazo. <img src="/files/ftp_upload/1260/1260figure1.jpg" alt="" /> Figura 1. Esta es una sección del polo occipital de los primates no humanos immunostained para NeuN que muestra tanto la capa VI e intersticiales neuronas de sustancia blanca. Esta sección en particular se almacena en el antígeno conservar a -20 ° C por un período de 2 años. Barra de escala = 100μm. <img src="/files/ftp_upload/1260/1260fig2.jpg" alt="figura 2" /> Figura 2. Nuestro banco de cerebros de los monos verdes se compone actualmente de cerca de 20.000 secciones sistemática de más de 30 monos.

<ol><li>West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+the+subdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator.+Aat+Rec%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec.</a> 231, 482-497 (1991).</li>
<li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+Non-human+Primate+Brain+in+Stereotaxic+Space%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El muestreo sistemático es un método barato destinado a maximizar el material de investigación. Esta estrategia de muestreo se ha diseñado para cumplir con las normas de estereología imparcial que requiere un muestreo sistemático en toda la región. Es muy importante que el orden de las secciones de cada serie se mantiene. En nuestro laboratorio hemos utilizado con éxito este método para la banca de los hamster y no humanos, cortes de cerebro de los primates. Hasta ahora, hemos recogido cerca de 20.000 monos verdes (...

<table><tbody><tr><td>Glicol etilénico</td><td>Fisher Scientific</td><td>E178-4</td><td></td></tr><tr><td>Poli(vinil pirrolidona)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP431-500</td><td></td></tr><tr><td>Medio de inclusión Thermal Scientific</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

banca cerebro: aprovechar al máximo las muestras de su investigación

Brain Banking: Making the Most of your Research Specimens

Estereología imparcial es un método de forma precisa y eficiente la estimación del número de neuronas total (o otro tipo de células) en un área de interés<sup&gt; 1</sup&gt;. Para lograr este objetivo 60-10 secciones sistemática debe ser probado que cubre toda la estructura. Generalmente, esto implica el procesamiento 1.5 secciones que deja una importante cantidad de material sin procesar. Con el fin de maximizar el material, se propone un método barato para la preservación de tejido fijado como parte de un plan de almacenamiento a largo plazo de la investigación. Medida que el tejido se corta y se procesaron para la deseada mancha o anticuerpos, las secciones alternativas deberían ser sistemáticamente colocado en el antígeno conservar a -20 ° C para el procesamiento futuro. Utilizando placas de 24 pocillos, las secciones se pueden colocar en orden para su futura recuperación. Usando este método, el tejido puede ser almacenada y procesada por inmunohistoquímica en el transcurso de los años.

Banca cerebro y el muestreo sistemático de la materia biológica constituye la base para estereología imparcial y maximiza el potencial de los datos obtenidos de cada ejemplar.

Banca cerebro: Aprovechar al máximo las muestras de su investigación

La estereología imparcial es un método para estimar de manera precisa y eficiente el número total de neuronas (u otro tipo de célula) en un área de interés determinada1. Para...

Para comenzar este procedimiento, se debe preparar el bloque de cerebro para el criostato y determinar la frecuencia de muestreo de las secciones. A continuación, se deben preparar el conservante antigénico y las laminillas. El bloque de cerebro debe colocarse sobre el portamuestras dentro del criostato.Una vez que el cerebro esté firmemente incrustado en la sección del portamuestras a un grosor preestablecido, deben tomarse cortes sistemáticos de forma que la serie uno se coloque sobre un portaobjetos, y series adicionales se coloquen en pocillos previamente llenos con conservante de antígenos. Una vez agotado el bloque, coloque la placa en un congelador a menos 20 grados Celsius como parte de su banco de cerebros. Hola, soy el Dr. Mark Burke del Laboratorio de Neurociencias Visuales en la Escuela de Optometría de la Universidad de Montreal.Hola, soy la Dra. Shahin Zur, también del Laboratorio de Neurociencias Visuales de la Escuela de Optometría de la Universidad de Montreal. Hola, soy el Dr. Mo Petto, director del Laboratorio de Neurociencias Visuales de la Escuela de Optometría de la Universidad de Montreal. Hoy les mostraremos un procedimiento para almacenar sistemáticamente tejido cerebral en preservación de antígenos.Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para maximizar el material de investigación y como base para realizar una teología imparcial. Así que comencemos. Este protocolo describe cómo muestrear sistemáticamente tejido cerebral que ha sido fijado, seccionado estereotácticamente en rebanadas de un centímetro de grosor y congelado.Para ver estos pasos iniciales en detalle, consulte nuestro reciente artículo de JoVE que describe la disección del cerebro de primates no humanos en el espacio estereotáxico. El primer paso en el muestreo sistemático consiste en crear su esquema de muestreo, decidir cómo seccionará su tejido, cómo dividirá esas secciones en series o muestras, y cómo organizará y hará seguimiento de esas muestras. Primero, consulte un atlas estereotáxico según sea necesario.Defina claramente su región de interés tanto en las dimensiones rostral-caudal como dorsal-ventral y elija su plano de seccionamiento. A continuación, decida qué grosor tendrán sus secciones y calcule cuántas secciones puede obtener de su región de interés. Por ejemplo, según el atlas estereotáxico, determina que la extensión rostro-caudal completa de su región mide aproximadamente tres milímetros de longitud.Luego decide ajustar el criostato para seccionar a 50 micrómetros, y a este ritmo, obtendrá 60 secciones coronales que cubren toda la región. En este punto, puede establecer su intervalo de muestreo. Para un estudio teológico imparcial típico, se necesitan seis a diez secciones muestreadas sistemáticamente para obtener resultados confiables.En este ejemplo, 10 secciones espaciadas uniformemente a lo largo de toda la extensión del tejido de Ros coddle dan como resultado un intervalo de muestreo de una de cada seis secciones. Una vez que haya determinado esta frecuencia de muestreo de secciones, deberá decidir a continuación qué tinciones desea realizar. Inmediatamente, montará las secciones que desea teñir directamente sobre portaobjetos mientras secciona su tejido.Por ejemplo, si está tiñendo con violeta de genciana, capturará una de seis secciones sobre un portaobjetos. Esta será la serie uno. Almacenará las secciones restantes en placas que contienen conservante de antígenos para inmunohistoquímica futura.El esquema de muestreo mostrado aquí consiste en dos portaobjetos y una placa estándar de 24 pocillos de secciones, como parte de un banco de cerebros, para un total de seis series para este bloque de tejido. El siguiente paso es seccionar exhaustivamente el bloque de tejido utilizando el microtomo criostático. Primero, debe montar su muestra de tejido congelado sobre la pieza denominada portamuestras, que se ajusta en la cabeza del microtomo y sirve como soporte para su muestra.Para comenzar, coloque una pequeña cantidad de medio de inclusión sobre el portamuestras y déjelo congelar. Coloque el portamuestras en la cabeza del microtomo y corte suficiente del medio congelado para obtener una superficie plana para su muestra. Retire el portamuestras de la cabeza del microtomo y colóquelo plano dentro del criostato.Vierta el medio de inclusión sobre el portamuestras y presione firmemente. Coloque lentamente y completamente el bloque cerebral con la cara cortada hacia abajo sobre el portamuestras. Incluya el trozo de cerebro en el medio de montaje.Coloque el portaobjetos ahora montado con el cerebro en la sección del cabezal del microtomo utilizando la frecuencia predeterminada de muestreo de secciones. Después de obtener una sección, ya sea montada en un portaobjetos o agregada a una serie específica en la placa que contiene el conservante de antígenos, tenga mucho cuidado de mantener las secciones en orden. Córtelas de manera que posteriormente pueda regresar al banco de cerebros y tomar otra muestra sistemática.Una vez que haya seccionado exhaustivamente el tejido y colocado los cortes en los pocillos, cubra la placa con la tapa, envuelva la tapa con parafina y colóquela en un congelador a menos veinte grados Celsius. Registre el número total de cortes en cada serie, el intervalo de muestreo de los cortes y el número de series por animal. Este registro será fundamental para llevar un control de los cortes cuando los retire del banco de cerebros para experimentos futuros.El muestreo sistemático de esta manera ha sido una práctica estándar en nuestro laboratorio. Durante los últimos tres años, hemos tenido un gran éxito realizando inmunohistoquímica en material que ha sido almacenado en conservante de antígenos durante tres años sin deterioro de la señal. Además, como parte de nuestro banco de cerebros, hemos registrado cerca de 20.000 secciones sistemáticas del cerebro de primates no humanos.Como parte de nuestros planes de investigación a largo plazo, acabamos de mostrarle cómo muestrear sistemáticamente un espécimen biológico y preservarlo como parte de sus planes de investigación a largo plazo. Al realizar este procedimiento, es importante recordar llevar un registro detallado del número total de series tomadas y del número total de secciones por serie. Además, si se pierde o daña una sección, anote ese número de sección en el cuaderno de registro para mantener un procedimiento de muestreo sistemático.Así es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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