La detección de ubiquitinación de proteínas

Hola, soy Chu del laboratorio de Jo en el Instituto de Investigación Médica de Birmingham. Hoy te mostraremos un procedimiento para detectar la nueva uación de proteínas. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar los tres ligatos y su sustrato.

Así que comencemos. Para comenzar este protocolo, transfecte células con plásmidos que expresen tanto la proteína objetivo como una versión marcada con epítopo de ubiquitina. Deje que las células crezcan durante unas 40 horas, luego muévalas a la mesa de laboratorio para cortar las células en la mesa, aspirar el medio líquido y lavar las células dos veces con PBS.

A continuación, las células mediante la adición de 100 microlitros de tampón de lisis celular, que contiene un 2% de SDS por placa de seis centímetros. Gire cada placa de modo que el tampón cubra completamente las celdas. A continuación, utilice un raspador de células para recoger las células lisadas y transferirlas a un tubo de 1,5 mililitros.

Coloque inmediatamente el tubo en un bloque de calor y hierva las células de lisis durante 10 minutos para desnaturalizar y disolver aún más las proteínas. Después de hervir, utilice un dispositivo de sonicación para cortar las células y su ADN. Este paso hace que los lisados celulares sean menos viscosos.

Después de la sonicación, añadir 900 microlitros de tampón de dilución y dejar que las muestras giren a cuatro grados centígrados durante 30 a 60 minutos. Después de la incubación, centrifugar las muestras diluidas a 20.000 Gs durante 30 minutos a cuatro grados centígrados para obtener proteínas solubles. Luego, con cuidado de no alterar la pellet, transfiera el sobrenadante a un nuevo einor.

Por último, mida la concentración de proteínas en el sobrenadante mediante un método como el ensayo de Lowry modificado que estamos utilizando aquí y ahora. Está listo para utilizar la inmunoprecipitación para aislar la proteína de interés de las demás en el sobrenadante. El primer paso en la inmunoprecipitación es preparar las perlas conjugadas con anticuerpos contra la proteína de interés.

Puede usar perlas conjugadas de anticuerpos disponibles en el mercado o hacer su propio anticuerpo inmovilizado usando reticulantes. Como hemos hecho aquí, prepare el anticuerpo inmovilizado en un tampón compatible para hacer una suspensión del 50% para establecer la reacción de precipitación de aminoácidos. Corte el extremo estrecho de la punta de una pipeta P 200 y transfiera de 14 a 20 microlitros de resina a 500 a 1500 microgramos de lisados celulares preparados.

Ajuste la cantidad de lisado celular que utiliza de acuerdo con la eficiencia de transfección de sus células. Deje que la mezcla de perlas de lisado celular gire a cuatro grados centígrados durante la noche. Durante este tiempo, el anticuerpo conjugado con perlas se unirá específicamente a la proteína objetivo.

Al día siguiente, gire las perlas a 5.000 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados para pellets su proteína. Ahora unido a las perlas, aspirar el sobrenadante y lavar la resina dos veces con el tampón de lavado con alto contenido de sal girando a 5.000 Gs durante cinco minutos. A cuatro grados centígrados, gire las perlas por última vez a 20.000 GS durante 30 segundos y aspire el tampón de lavado residual.

Ahora que ha purificado la proteína de su interés, es hora de agotar la proteína en un gel de página SDS. Primero, hierva la resina de perla con tampón de carga dos veces SDS para desnaturalizar las proteínas y darles una carga negativa. Cargue las muestras preparadas en una página SDS.

El gel L transfiere las proteínas a una membrana utilizando el protocolo de su laboratorio para la transferencia occidental. A continuación, propague el blot con anticuerpos contra la ubiquitina o la proteína diana y desarrolle la membrana en una película para visualizar las proteínas ubiquitinadas. Acabamos de mostrarte cómo detectar la ubiquitinación de proteínas en células cultivadas.

Este mismo experimento se puede realizar in vitro en un tubo de ensayo. Esta reacción tiene un volumen total de 40 y se puede realizar en un tubo de PCR. Prepare cada reacción de la siguiente manera.

En primer lugar, se añade cinco veces el tampón de UBIQUITINACIÓN, que contiene un TP y un agente reductor DIO tres etol, DTT. A continuación, agregue las enzimas de ubiquitinación E uno y E dos. Agregue los sustratos, la ubiquitina y la proteína objetivo.

Lleve el volumen total de reacción a 40 microlitros con agua como controles. Prepare reacciones similares en ausencia de ubiquitina E uno, E dos o la proteína objetivo. Incuba la mezcla a 37 grados centígrados durante una hora o más.

Detenga la reacción agregando la página SDS, búfer de muestra. Hervir la muestra durante 10 minutos. Cargue las muestras en un gel de página SDS y proceda con el análisis de inmunotransferencia como lo hizo para el experimento in vivo.

A continuación, se muestra un ejemplo de resultado de este protocolo. Parkinson. Una proteína asociada a la enfermedad de Parkinson es la proteína de interés aquí. Y el carril cuatro muestra parin ubiquitinado.

Los frotis fuertes típicos o escaleras se muestran por encima del peso molecular de la parina no modificada para comparar varias condiciones experimentales, los niveles de expresión celular de la proteína diana no modificada, la parina y la ubiquitina que también deben considerarse en cada condición. Este es un ejemplo de afinidad de la parina in vitro con afinidad de la parina purificada para la ubiquitinación in vitro en presencia de E uno recombinante, E dos y la parina de la marca de biotina ubiquitina biotina ubiquitinada se detectó por estreptavidina HRP. La parina ubiquitinada aparece como escaleras por encima del peso molecular de la parina no modificada carriles uno, dos y cuatro son controles que no contienen ubiquitina E uno, E dos y parkina respectivamente.

Acabamos de mostrarles cómo detectar la nueva vacuna de proteínas en las células de cultivo. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que se debe preparar el lisado celular en un estado muy intenso y diluir el lisado celular antes de agregar los anticuerpos movilizados. Así que eso es todo.

Gracias por mirar y buena suerte con tu experimento.