Name: La detección de ubiquitinación de proteínas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Aprende a detectar la ubiquitinación de proteínas en células cultivadas mediante transfección, lisis celular e inmunoprecipitación. Este método permite estudiar ligasas de ubiquitina y sus sustratos en neurociencia y biología celular.

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Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones RO1 DC006497, RO1 NS057289 y PO1 ES016738 (A a la Z. Zhang), Instituto de California para la Medicina Regenerativa subvenciones RS1-00331-1 y RL1-00682-1 (A a la Z. Zhang), el Parkinson estadounidense Asociación de la Enfermedad (A a la Z. Zhang y Choo YS) y la Fundación Michael J. Fox para la Investigación del Parkinson (Z. Zhang).

La detección de la ubiquitinación de proteínas en las células cultivadas <ol><li> Transfectar células cultivadas con plásmidos que expresan la proteína de interés y (epítopo de etiquetado de la versión) ubiquitina. </li><li> Hacer búfer completo lisis celular (2% SDS, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) con ortovanadato de sodio 2 mM, 50 mM de fluoruro de sodio, y los inhibidores de la proteasa. </li><li> Lisis de las células con 100 l buffer de lisis celular por placa (6 cm plato). Si un plato más grande se utiliza, ajustar el volumen en consecuencia. Agite el plato con cuidado para que el tampón de lisis cubrir toda el área de las células cultivadas. </li><li> Recoger las células con un rascador de células y la transferencia de los lisados ​​de células en un tubo eppendorf de 1,5 ml. Coloque el tubo en un plato caliente de inmediato a hervir durante 10 minutos. </li><li> Shear las células con un dispositivo de ultrasonidos. </li><li> Añadir 900ul de buffer de dilución (10 Triton mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1%). Incubar las muestras a 4 ° C durante 30-60 minutos con la rotación. </li><li> Girar las muestras diluidas a 20.000 xg durante 30 min. Transferir el sobrenadante resultante a un nuevo tubo eppendorf. Tenga cuidado de no perturbar el sedimento. </li><li> Medir la concentración de proteínas. </li><li> Prepare la proteína A o G-agarosa bolas conjugado de anticuerpos contra la proteína de interés en un buffer compatible (50% de lodo). Corte el extremo estrecho de una punta de pipeta P-200 y la transferencia de 14 a 20 l de resina de 500-1.500 mg de lisados ​​celulares preparados para inmunoprecipitación. Para las células con una eficiencia de transfección de alto, 500 mg será suficiente. Para las células con una eficiencia de transfección de baja, más proteínas puede ser necesario. </li><li> Se incuban las células lisado de perlas mezcla a 4 ° C durante la noche con la rotación. </li><li> De girar las bolas a 5000 xg durante 5 min. Aspirar el sobrenadante. Lavar la resina con la solución de lavado (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40) dos veces. </li><li> Girar las cuentas por última vez a 20.000 xg durante 30 segundos. Aspirar la solución de lavado residual y hervir la resina con tampón de carga 2X SDS. </li><li> Cargar las muestras en un gel de SDS-PAGE para el análisis de inmunotransferencia. </li><li> Detectar la ubiquitina y la proteína diana con anticuerpos respectivos. Por immunoblotting, por lo general, detectar la ubiquitina en primer lugar. La membrana entonces se utiliza para detectar la proteína precipitada. </li></ol> La detección de la ubiquitinación de las proteínas diana a través de En el ensayo in vitro ubiquitinación <ol><li> Hacer buffer ubiquitinación 5X (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 25 mM MgCl2, 2,5 mM de DTT, 10 mM ATP). Guárdelos en pequeñas alícuotas a -20 ° C hasta por 6 meses. Algunos protocolos también añadir el fosfato de creatina y la creatina quinasa en el buffer de ATP 1,2 regeneración. </li><li> Para cada reacción, prepare una mezcla que contiene lo siguiente: <table border="1"><tbody><tr><td> L 8 </td><td> Buffer ubiquitinación 5X </td></tr><tr><td> 250 ng </td><td> ubiquitinación E1 </td></tr><tr><td> 500 ng </td><td> ubiquitinación E2 </td></tr><tr><td> 0,5 mg </td><td> ubiquitina </td></tr><tr><td> 0,5 mg </td><td> proteína de interés </td></tr><tr><td></td><td> agua a 40 l volumen total </td></tr></tbody></table> Como controles, preparar reacciones similares en la ausencia de cualquiera de E1, E2, o ubiquitina. </li><li> Incubar la mezcla a 37 ° C durante 1 hora o más. </li><li> Detener la reacción mediante la adición de SDS-PAGE muestra de amortiguación y hervir la muestra durante 10 minutos. </li><li> Cargar las muestras en gel SDS-PAGE para el análisis de inmunotransferencia. </li><li> Detectar la ubiquitina y la proteína diana con anticuerpos respectivos. </li></ol>

<ol><li>Xiong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1%2C+and+DJ-1+form+a+ubiquitin+E3+ligase+complex+promoting+unfolded+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">PINK1, and DJ-1 form a ubiquitin E3 ligase complex promoting unfolded protein degradation.</a> J Clin Invest. 119, 650-660 (2009).</li>
<li>Xirodimas, D. P., Saville, M. K., Bourdon, J. C., Hay, R. T., Lane, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdm2-mediated+NEDD8+conjugation+of+p53+inhibits+its+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mdm2-mediated NEDD8 conjugation of p53 inhibits its transcriptional activity.</a> Cell. 118, 83-97 (2004).</li>
<li>Didier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNF5%2C+a+RING+finger+protein+that+regulates+cell+motility+by+targeting+paxillin+ubiquitination+and+altered+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNF5, a RING finger protein that regulates cell motility by targeting paxillin ubiquitination and altered localization.</a> Mol Cell Biol. 23, 5331-5345 (2003).</li>
<li>Laney, J. D., Hochsetrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unit+14.5+Analysis+of+Protein+Ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Unit 14.5 Analysis of Protein Ubiquitination.</a> Current Protocols in Protein Science. , 14.5.1-14.5.11 (2002).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En esta presentación, lo primero que describió las medidas que permitan detectar modificaciones ubiquitina a una proteína de interés en los cultivos de células de mamíferos. Con el fin de detectar la ubiquitinación específicamente en la proteína de interés, no en las proteínas que interactúan de forma no covalente, se utilizó una condición estricta para la lisis celular, inmunoprecipitación y el lavado de 1,3. Ubiquitinación, detectado por inmunoprecipitación de la proteína diana en un estado severo seguido d...

la detección de ubiquitinación de proteínas

Detection of Protein Ubiquitination

Ubiquitinación, la unión covalente de la ubiquitina polipéptido que se dirigen a proteínas, es una modificación postraduccional clave llevadas a cabo por un conjunto de tres enzimas. Estos incluyen la activación de la enzima ubiquitina E1, E2 ubiquitina-conjugación enzima, y ​​E3 ubiquitina ligasa. A diferencia de E1 y E2, E3 ubiquitina ligasas pantalla especificidad de sustrato. Por otro lado, numerosas enzimas deubiquitylating tienen un papel en el procesamiento de las proteínas polyubiquitinated. Ubiquitinación puede resultar en un cambio de la estabilidad de las proteínas, localización celular y la actividad biológica. Las mutaciones de los genes implicados en la vía de ubiquitinación / deubiquitination o alteración de la función del sistema ubiquitina están asociados con muchas enfermedades diferentes humanos, tales como varios tipos de cáncer, neurodegeneración, y trastornos metabólicos. La detección de ubiquitination alterado o normal de las proteínas diana pueden proporcionar una mejor comprensión de la patogénesis de estas enfermedades. Aquí se describen los protocolos para detectar la ubiquitinación de proteínas en las células cultivadas<em&gt; In vivo</em&gt; Y tubos de ensayo<em&gt; In vitro</em&gt;. Estos protocolos son también útiles para detectar otras ubiquitina-como la modificación de moléculas pequeñas como sumolyation y neddylation.

Ubiquitinación es una modificación postraduccional clave llevadas a cabo por un conjunto de tres enzimas. Las mutaciones de los genes implicados en esta modificación se asocian con muchas enfermedades humanas diferentes. Aquí se describen los protocolos para detectar la ubiquitinación de proteínas en las células cultivadas<em&gt; In vivo</em&gt; Y tubos de ensayo<em&gt; In vitro</em&gt;.

La detección de ubiquitinación de proteínas

La ubiquitiniación, la unión covalente del polipéptido ubiquitina a proteínas diana, es una modificación postraduccional clave llevada a cabo por un conjunto de...

Hola, soy Chu del laboratorio de Jo en el Instituto de Investigación Médica de Birmingham. Hoy les mostraremos un procedimiento para detectar la ubiquitinación de proteínas. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar el parkin o los ligasas UBI3 y su sustrato.Así que comencemos. Para iniciar este protocolo, transfecte las células con plásmidos que expresen tanto la proteína diana como una versión marcada con un epítope de ubiquitina. Deje crecer las células durante aproximadamente 40 horas, luego trasládelas al banco de laboratorio para lisarlas; aspire el medio líquido y lave las células dos veces con PBS.A continuación, lise las células añadiendo 100 microlitros de tampón de lisis celular, que contiene SDS al 2%, por cada placa de seis centímetros. Agite suavemente cada placa para que el tampón cubra completamente las células. A continuación, utilice un raspador celular para recoger las células lisadas y transfiéralas a un tubo eppendorf de 1,5 mililitros.Coloque inmediatamente el tubo en un bloque térmico y hierva las células lisadas durante 10 minutos para desnaturalizar y disolver aún más las proteínas. Después de la ebullición, utilice un dispositivo de sonicación para romper las células y su ADN. Este paso hace que los lisados celulares sean menos viscosos.Después de la sonicación, añada 900 microlitros de tampón de dilución y deje que las muestras giren a cuatro grados Celsius durante 30 a 60 minutos. Tras la incubación, centrifugue las muestras diluidas a 20.000 Gs durante 30 minutos a cuatro grados Celsius para obtener las proteínas solubles. Luego, sin perturbar el precipitado, transfiera el sobrenadante a un nuevo einor.Por último, mida la concentración de proteína en el sobrenadante mediante un método como el ensayo de Lowry modificado que estamos utilizando aquí. Y ahora, está listo para usar una inmunoprecipitación para aislar su proteína de interés de las demás en el sobrenadante. El primer paso en la inmunoprecipitación consiste en preparar las perlas conjugadas con anticuerpos contra su proteína de interés.Puede utilizar perlas con anticuerpos conjugados disponibles comercialmente o preparar su propio anticuerpo inmovilizado usando agentes de reticulación. Como tenemos aquí, prepare el anticuerpo inmovilizado en un tampón compatible para obtener una suspensión al 50 % y así establecer la reacción de precipitación de aminoácidos. Corte el extremo estrecho de una punta de pipeta P200 y transfiera de 14 a 20 microlitros de resina a 500-1500 microgramos de lisados celulares preparados.Ajuste la cantidad de lisado celular que utiliza según la eficiencia de transfección de sus células. Deje la mezcla de lisado celular y perlas rotando a cuatro grados Celsius durante la noche. Durante este tiempo, el anticuerpo conjugado a la perla se unirá específicamente a su proteína diana.Al día siguiente, centrifugue las perlas a 5 000 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius para obtener el sedimento de su proteína. Ahora que están unidas a las perlas, aspire el sobrenadante y lave la resina dos veces con el tampón de lavado de alta salinidad centrifugando a 5 000 G durante cinco minutos. A cuatro grados Celsius, centrifugue las perlas por última vez a 20 000 G durante 30 segundos y aspire el tampón de lavado residual.Ahora que ha purificado su proteína de interés, es momento de separar la proteína en un gel de SDS-PAGE. Primero, hierva la resina con dos volúmenes de tampón de carga SDS para desnaturalizar las proteínas y conferirles una carga negativa. Cargue sus muestras preparadas en un gel de SDS-PAGE.Transfiera los proteínas a una membrana mediante el protocolo de su laboratorio para inmunotransferencia. Luego, incube la membrana con anticuerpos contra la ubiquitina o la proteína diana y revele la membrana en una película para visualizar las proteínas ubiquitinadas. Acabamos de mostrarle cómo detectar la ubiquitinación de proteínas en células en cultivo.Este mismo experimento puede realizarse in vitro en un tubo de ensayo. Esta reacción tiene un volumen total de 40 y puede llevarse a cabo en un tubo para PCR. Prepare cada reacción de la siguiente manera.Primero, agregue cinco veces el tampón de UBIQUITINACIÓN, que contiene un TP y el agente reductor DIO tres etol, DTT. A continuación, agregue las enzimas de ubiquitinación E uno y E dos. Añada los sustratos, ubiquitina y proteína diana.Lleve el volumen total de la reacción a 40 microlitros con agua como controles. Prepare reacciones similares en ausencia de ubiquitina E1, E2 o la proteína diana. Incube la mezcla a 37 grados Celsius durante una hora o más.Detenga la reacción añadiendo tampón de muestra para electroforesis SDS-PAGE. Hierva la muestra durante 10 minutos. Cargue las muestras en un gel SDS-PAGE y continúe con el análisis de inmunotransferencia tal como lo hizo para el experimento in vivo.Aquí se muestra un ejemplo del resultado de este protocolo. Parkinson. Una proteína asociada a la enfermedad de Parkinson es la proteína de interés en este caso. Y la banda cuatro muestra parina ubiquitinilada.Las típicas bandas intensas o escaleras se muestran por encima del peso molecular de la parina no modificada para comparar varias condiciones experimentales, los niveles celulares de expresión de la proteína diana no modificada, parina y ubiquitina, que también deben considerarse en cada condición. Este es un ejemplo de ubiquitinación in vitro de parina; la parina purificada por afinidad fue analizada para ubiquitinación in vitro en presencia de E uno recombinante, E dos y ubiquitina marcada con biotina; la parina ubiquitinada con biotina fue detectada mediante estreptavidina-HRP. La parina ubiquitinada aparece como una escalera por encima del peso molecular de la parina no modificada. Las calles uno, dos y cuatro son controles que no contienen ubiquitina, E uno y parina, respectivamente.Nosotros, acabamos de mostrarle cómo detectar proteínas nuevas tras la vacunación en células en cultivo. Al realizar este procedimiento, es importante recordar preparar el lisado celular en condiciones altamente tamponadas y diluir el lisado celular antes de añadir los anticuerpos marcados. Eso es todo.Gracias por ver este video y mucha suerte con su experimento.

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video describe un método para extraer y purificar péptidos ubiquitinilados que contienen péptidos di-glicina remanentes de una mezcla compleja de péptidos. El método presentado puede ayudar a identificar los sitios originales de ubiquitinación en la proteína.

Extracción basada en inmunoafinidad de péptidos ubiquitinilados: una técnica para extraer selectivamente péptidos marcados con ubiquitina a partir de fracciones de péptidos purificados

El actual protocolo detalla un método para medir la actividad de las enzimas funcionalmente homóloga deubiquitinating. Sondas especializadas modifican covalentemente la enzima y permiten la detección. Este método tiene el potencial de identificar nuevas dianas terapéuticas.

Método para medir la actividad de enzimas deubiquitinating en líneas celulares y muestras de tejido

Presentamos un método para la purificación, detección e identificación de péptidos digliquenados que se originan a partir de proteínas ubiquitinadas a partir de muestras biológicas complejas. El método presentado es reproducible, robusto y supera a los métodos publicados con respecto al nivel de profundidad del análisis ubiquitinome.

Detección de sitios de ubiquitinación de proteínas por enriquecimiento de péptidos y espectrometría de masas

La ubiquitinación es una modificación post-traduccional que desempeña un papel importante en los procesos celulares y está estrechamente coordinada por la desubiquitinación. Los defectos en ambas reacciones subyacen a patologías humanas. Proporcionamos protocolos para la realización de la ubiquitinación y la reacción de desubiquitinación in vitro utilizando componentes purificados.

Ensayos in Vitro Ubiquitination y Deubiquitination de histonas nucleosomales

Este protocolo tiene como objetivo establecer proteomes específicos de ubiquitina (Ub) y ubiquitinas (Ubls) con el fin de identificar alteraciones de este tipo de modificaciones post-traduccionales (PtM), asociadas a una condición específica como un tratamiento o un fenotipo.

Perfilado de Ubiquitina y Ubiquitina-como Modificaciones Post-traduccionales dependientes e Identificación de Alteraciones Significativas

Este método describe la evaluación de los cambios globales en la topología de la cadena de ubiquitina. La evaluación se realiza mediante la aplicación de un enfoque proteómico específico basado en espectrometría de masas.

Análisis de la cadena de ubiquitina por monitoreo paralelo de reacciones

Proporcionamos un protocolo detallado para un ensayo de ubiquitilación de un sustrato específico y una ubiquitina ligasa E3 en células de mamíferos. Se utilizaron líneas celulares HEK293T para la sobreexpresión de proteínas, el sustrato poliubiquitilado se purificó a partir de lisados celulares por inmunoprecipitación y se resolvió en SDS-PAGE. Se utilizó immunoblotting para visualizar esta modificación post-traduccional.

Evaluación de la ubiquitilación del sustrato por E3 Ubiquitina-ligasa en lisados de células de mamíferos

El protocolo describe un método paso a paso para purificar proteínas ubiquitinadas de células de mamíferos utilizando la proteína supresora de tumores p53 como ejemplo. Las proteínas p53 ubiquitinadas se purificaron de células bajo estrictas condiciones no desnaturalizantes y desnaturalizantes.

Purificación de proteínas p53 ubiquitinadas a partir de células de mamíferos

El presente protocolo destaca un método modificado para detectar y cuantificar los enlaces cruzados ADN-proteína (DPCs) y sus modificaciones postraduccionales (PTMs), incluyendo la ubiquitilación, la SUMOilación y la ADP-ribosilación inducida por inhibidores de la topoisomerasa y por formaldehído, permitiendo así el estudio de la formación y reparación de DPCs y sus PTMs.

Detección cuantitativa de enlaces cruzados ADN-proteína y sus modificaciones postraduccionales

El experimento utilizado aquí muestra un método de acoplamiento molecular combinado con tecnologías de sonda para predecir y validar la interacción entre pequeñas moléculas de la medicina tradicional china y objetivos proteicos.

Detección de compuestos de la medicina tradicional china para inhibir la actividad de UCHL3 basada en la tecnología de sonda de enzimas de acoplamiento molecular y desubiquitinación

La ubiquitinación es un regulador crítico de las funciones intracelulares de las proteínas. Aquí describimos dos métodos de lisis celular para detectar los niveles de ubiquitinación de proteínas del sustrato en células de mamíferos y comparamos su eficacia para analizar los niveles de ubiquitinación. La sobreexpresión de proteínas en HEK293T células fue inducida por transfección transitoria, y proteínas ubiquitinadas fueron detectadas mediante análisis de western blot.

Estrategias comparativas para la detección de ubiquitinación en lisados celulares de mamíferos utilizando SMAD2/SMURF2 como modelo

Aprende a detectar la ubiquitinación de proteínas en células cultivadas mediante transfección, lisis celular e inmunoprecipitación. Este método permite estudiar ligasas de ubiquitina y sus sustratos en neurociencia y biología celular.

La detección de ubiquitinación de proteínas

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