Name: Preparación de las Culturas Rata total del cerebro de las neuronas y la glía de Estudios para el Desarrollo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-30T23:59:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Aprende a preparar cultivos de agregados cerebrales de rata embrionaria para estudiar la diferenciación de progenitores neuronales en neuronas y glía. Este protocolo permite analizar el desarrollo del SNC in vitro.

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Este estudio fue financiado en parte por los fondos iniciales de la Texas A &amp; M University

Preparación antes de la disección Instrumentos quirúrgicos: esterilizar todos tijeras y pinzas de disección por autoclave Cubreobjetos de limpieza: <ol><li> Ponga todos los cubreobjetos (15 mm de diámetro por 24 y placa) en el vaso 1 litro de hierba en el 33% de HCl por lo menos 24 h </li><li> Lavar con agua corriente durante 10 minutos con un movimiento de vez en cuando para eliminar todo residuo de HCl </li><li> Enjuague con agua Millipore </li><li> Drenar el agua </li><li> Remoje cubreobjetos en el 95-98% de etanol </li><li> Cubreobjetos traslado a un paño limpio sobre una placa plana y el aire seco del cubreobjetos </li><li> Transferencia cubreobjetos a un vaso de vidrio, cubrir con papel de aluminio y autoclave Nota: Los cubreobjetos se pueden almacenar en esta etapa </li><li> Coloque el cubreobjetos individuales en placas de cultivo. Listo para el revestimiento </li></ol> Cubreobjetos recubrimiento: <ol><li> Diluir 100 acciones x de poli-D-lisina (PDL, 10 mg / ml en el 0,5% de albúmina sérica bovina en PBS, almacenados en alícuotas a -20 ° C) con PBS y el filtro de esterilización (0,22 m) </li><li> Cubreobjetos cubrir con una solución x PDL (~ 0,15 ml / cm 2) durante 2 horas a 37 ° C en una incubadora </li><li> Retire la solución PDL y lavar 3 veces con agua estéril O ddH 2 y cubreobjetos se seque por completo </li></ol> Nota: El pelo lo suficientemente cubreobjetos / placas para cada disección. PDL recubierto cubreobjetos se puede almacenar durante un par de semanas a 4 ° C. Los medios de comunicación y soluciones Medio de la disección (DM): El uso de solución salina equilibrada estéril helada de Hank (w / o Ca 2 +, Mg 2 +) (HBSS, Invitrogen 14.175), complementado con HEPES 10 mM (Invitrogen 15630). Los medios de comunicación agregado cultural: El medio DMEM/NBB27 contiene DMEM / Neurobasal (1:1 vol: vol), el 2% B27, 1 x Sato, 0,5 mM piruvato sódico, 0,75 Glutamax, 60μg/ml N-acetilcisteína, 5 mg / ml la insulina, 10 nM d-biotina y el 1% penicilina / estreptomicina. Para hacer 100 ml del medio de cultivo total, mezclar 50 ml de DMEM (w / o piruvato / glutamina, Invitrogen 11.960), 50 ml de medio Neurobasal (Invitrogen 211.034), 375 l Glutamax (100 x, Invitrogen 35.050), 5,5 mg de sodio piruvato (Sigma P2256), 2 ml B27 (Invitrogen 17.504), 6,3 mg de N-acetilcisteína (Sigma A8199), 1 ml de Sato acciones (100 acciones x, ver más abajo), 25 l de d-biotina madre (4000 x acciones, 40 M en PBS almacenado en alícuotas a -20 ° C. Sigma B4639), 100 l de la insulina (1000 x stock, 5 mg / ml de HCl 0,01 N almacenado en alícuotas a -20 ° C, Sigma 16 634), y 1 ml de penicilina / estreptomicina (100 x acciones, Invitrogen 15.140), filtro de esterilizar y almacenar a 4 ° C. Sato 100 x solución de reserva: Para hacer 40 ml de la acción: mezcla de 40 ml Neurobasal con 400 mg apo-transferrina (Sigma T2252), 400 mg de BSA (Sigma A9647), 10 l de progesterona (25 mg / ml de etanol, se almacena como alícuotas a -20 ° C. Sigma P8783), 64 mg putrescina (Sigma P7505), y 40 l de selenito de sodio (30 mM en PBS, almacenados en alícuotas a -20 ° C, Sigma S5261). Filtro de esterilización de la solución madre de Sato, y almacenar en alícuotas a -20 ° C. Neurona medio chapado (PM): Media Neurobasal, el 2% B27, 2 mM de glutamina (stock 100x, alícuotas almacenadas a -20 ° C, Invitrogen 25.030), 25μM ácido glutámico (100 acciones, alícuotas almacenadas a -20 ° C) y el 1% penicilina / estreptomicina. Neurona medio de cultivo (CM): Media Neurobasal, el 2% B27, 2 mM de glutamina (stock 100x, alícuotas almacenadas a -20 ° C) y 1% de penicilina / estreptomicina. 5-FdU acciones: acciones 100x, 1mM 5-fluoro-2&#39;-desoxiuridina (Sigma F0503) and1mM uridina (Sigma U3003) en medio de Neurobasal. Filtro esterilizado y almacenado en alícuotas a -20 ° C. La papaína solución de digestión (hace fresco antes de la disección): <ol><li> Disolver 3,2 mg L-cisteína (Sigma C-7352) en 4 ml de DM </li><li> Ajustar el pH a aproximadamente 7,4 con NaOH 1 N (prueba de tiras reactivas de pH) y en un baño de agua a 37 ° C Nota: Realice el siguiente paso justo antes de la digestión del tejido (ver más abajo). </li><li> Añadir la papaína a una concentración final de 20 unidades / ml </li><li> Filtro de esterilización (0.22mm), y en un baño de agua a 37 ° C </li></ol> Tripsina inhibidor de la solución (que inmediatamente antes de su disección): <ol><li> Disolver 0,2 g de inhibidor de tripsina (Sigma T7295) en 20 ml DM </li><li> Verificar el pH y ajustar el pH a ~ 7,4 con NaOH 1 N </li><li> Filtro de esterilización, y en un baño de agua a 37 ° C </li></ol> La disección del cerebro Configuración: <ul><li> Pinzas esterilizadas y tijeras </li><li> 70% de etanol </li><li> Un pañuelo de papel limpio y DIAPer pad en el banco </li><li> Platos de Petri de 10 cm con helado de DM para el útero y el feto en el banco </li><li> De hielo en la plataforma microscopio de disección </li><li> 2-3 platos de 6 cm con DM en el hielo </li><li> PM caliente en un baño de agua 37 ° C </li></ul><ol><li> La eutanasia a una mujer embarazada de ratas Sprague-Dawley (E16) de acuerdo con un procedimiento aprobado por el Comité Institucional de nosotros Comité (IACUC) </li><li> Sentar las ratas en la plataforma de pañal y el alcohol de esterilización en la región abdominal </li><li> Use pinzas para sujetar la piel abdominal y un par de tijeras para hacer una incisión en forma de V corta solamente la piel </li><li> Separe la piel y el uso de otro pinzas esterilizadas y las tijeras para cortar a través de la capa muscular </li><li> Extracto de la cadena de los sacos embrionarios y transferirlos a un plato de 10 cm que contiene helada DM </li><li> Utilizando unas tijeras de microdisección, retire con cuidado cada embrión del saco y el cerebro de cada embrión, y el lugar liberado cerebro en un plato de 10cm limpio con DM en una plataforma de hielo </li><li> En una campana de laminar y bajo un microscopio de disección, retirar el cerebro medio / rombencéfalo secciones, y el uso de unas pinzas finas para eliminar las meninges, y la transferencia de la corteza limpia / hipocampo de un nuevo plato con 6 cm de DM en una bolsa de hielo Nota: en esta etapa, el tejido está listo para su digestión por enzimas. </li><li> Hacer la papaína y la solución de inhibidor de la tripsina y el filtro de esterilización </li><li> Eliminar el exceso de DM de corteza / hipocampo </li><li> Agregar 4 ml de la solución de papaína digestión preparado </li><li> La transferencia de todo el contenido de un tubo de 50 ml y colocar el tubo Falcon en un baño de agua a 37 ° C durante exactamente 5 minutos </li><li> Retire la solución con una pipeta de la papaína </li><li> Añadir 5 ml de solución de inhibidor de la tripsina, agitar el tubo, y colocar en un baño de agua a 37 ° C durante 2-3 minutos </li><li> Eliminar la solución de inhibidor de tripsina </li><li> Repita el paso 13 y 14 tres veces </li><li> Añadir PM caliente 20ml </li><li> Triturar hasta que todos los grupos han desaparecido (~ 20 a 30 veces) </li><li> Centrifugar a 100xg de 7min </li><li> Resuspender el precipitado en 10 ml de PM y lavar dos veces por centrifugación </li><li> Resuspender el precipitado en 10 ml de cultivos de neuronas PM regular o en NBB27/DMEM de las culturas agregado </li><li> Pasar a las células a través de un tamiz de células 70μm </li><li> Contador de células vivas </li><li> Proceder a la cultura global, como se describe a continuación o la placa de las células de cultivos de neuronas regulares Nota: En este paso, altamente enriquecido cultivos de neuronas se puede lograr mediante siembra de las células disociadas en las placas de recubrimiento PDL-con una densidad de 200 a 640 células / mm 2 en función de la finalidad de los experimentos. Después las células se han conectado (~ 2-4h), reemplace medio con PM caliente. Si el cultivo durante períodos prolongados de tiempo, el día 4, reemplace la mitad de la media con CM caliente. Para altamente purificada cultivos neuronales, inhibidor de la mitosis 5 FdU (concentración final 10 mM) se puede añadir en DIV2 para inhibir la no proliferación de las células neuronales (es decir, durante DIV2-3). Después de la recuperación en la CM durante 2 días, las células son el pulso de nuevo al tratamiento con 5-FdU durante 2 días (DIV 6-7) seguido de un cambio de medio completo. A partir de entonces, reemplazar la mitad de la media con CM dulce, caliente cada 3-4 días. Las neuronas son viables hasta por 4 semanas. </li></ol> Agregados de preparación y de las planchas <ol><li> Suspender las células disociadas en el medio que contiene 1x NBB27/DMEM Sato, CNTF 10ng/ml y forskolin 10μM a una densidad de 2x10 6 células / ml </li><li> Transferencia de 2 ml de suspensión celular en cada pocillo de un sin recubrimiento de 6 pocillos </li><li> Cultura por 3 noches. Cada día, suavemente volver a suspender las células una vez con un Pipetman P1000 Nota: Las células comienzan a formar agregados (Figura 1). </li><li> En el día de las placas, agregado, la capa de placa / cubreobjetos con Matrigel: <ul><li> Diluir acciones Matrigel (factor de crecimiento reducido, BD Biosciences 354230) 1:20 con DMEM frío en hielo Nota: alícuotas de Matrigel debe ser preparado por el protocolo del fabricante. Todas las puntas, tubos Eppendorf y soluciones para la toma de alícuotas de las acciones debe estar fría para evitar la polimerización Matrigel. Alícuotas de Matrigel se mantienen a -80 ° C y se descongelaron a 4 ° C. </li><li> Escudo previamente PDL-cubreobjetos recubiertos con 300μl/well de la solución diluida Matrigel durante la noche en una incubadora a 37 ° C </li><li> Lavar con PBS caliente, lavar la placa con agua tibia estéril O ddH 2 y dejar las placas en la incubadora. </li></ul></li><li> 3 días después de la formación de agregados, resuspender suavemente las células de nuevo y se tamiza la suspensión a través de una malla de 200μm en un tubo de 50 ml Falcon. Permita que los agregados se depositen en el fondo del tubo por la gravedad (~ 3-5min) </li><li> Retire con cuidado el sobrenadante </li><li> Añadir medio, suavemente volver a suspender los agregados y dejar a establecerse de nuevo. Repita este procedimiento varias veces para eliminar las células muertas, las células individuales y los escombros. Use el microscopio para verificar si el sobrenadante aún contienen las células no agregados y basuras </li><li> Resuspenda suavemente los agregados en el medio NBB27/DMEM mismo (Figura 1) y el recuento de los agregados </li><li> Ajustar la densidad de los agregados de alrededor de 25-30 aggreggats/50ul </li><li> Transferencia de alícuotas (500-1000μl) de la suspensión total de 2 ml tubos Eppendorf para la siembra Nota: Dado que los agregados tienden a asentarse en el fondo de los tubos, es crucial para hacer tubos múltiples de la suspensión total para la siembra. Resuspenda suavemente los agregados a menudo antes de la siembra que en cubreobjetos recubiertos o placas de cultivo para garantizar un número similar de agregados chapada en cada portaobjetos. </li><li> Saque la placa de cultivo que contienen Matrigel recubierto cubreobjetos de la incubadora. Retire la solución de cada pocillo, lavar los cubreobjetos con PBS caliente y se ddH2O, y luego brevemente en seco. Ahora están listos para la siembra de agregado </li><li> Invertir un tubo que contiene la suspensión total para que puedan ser distribuidos de manera uniforme antes de la siembra. Carga 50μl de la suspensión total en el centro de cada cubreobjetos, y colocó suavemente la placa posterior a la incubadora sin ningún tipo de perturbación adicional para permitir que los agregados para fijar de manera uniforme para el cubreobjetos Nota: La densidad de los agregados es crucial. Si los agregados se siembran demasiado cerca uno del otro o si la densidad de siembra es alta, tienden a fusionarse a medida que crecen. </li><li> Añadir DMEM/NBB27medium adicionales (500 l) a cada pocillo 4-6 horas más tarde o temprano la mañana siguiente </li><li> Para mantener la cultura global, la mitad de cambiar el medio cada 3-4 días. Cuando cambio de medio, tenga cuidado de no romper los agregados y esto se hace añadiendo lentamente un medio a lo largo de la pared lateral del pozo. Nota: Pocas horas después de agregados unida a la placa, crecimiento de las neuritas de los agregados se pueden observar. Los axones crecen rápidamente en las primeras dos semanas y forman abundantes conexiones entre los agregados (Figura 2). Gliales progenitores migran radialmente hacia fuera de los agregados y se diferencian en el tiempo en los astrocitos y oligodendrocitos maduros. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1304/1304fig1.jpg" alt="la figura 1" /> Figura 1. Imágenes de contraste de fase de células que forman los agregados en diferentes días y agregados después del lavado. <img src="/files/ftp_upload/1304/1304fig2.jpg" alt="la figura 2" /> Figura 2. Imágenes de contraste de fase de una cultura global 2 y 12 días después de sembradas en Matrigel recubierto cubreobjetos.

<ol><li>Matthieu, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+in+rat+brain+aggregating+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Myelination in rat brain aggregating cell cultures.</a> Neuroscience. 3, 565-56 (1978).</li>
<li>Chen, Y. ing <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nat. Protocols. 2, 1044-10 (2007).</li>
<li>Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+stages+of+myelination+regulated+by+gamma-secretase+and+astrocytes+in+a+rapidly+myelinating+CNS+coculture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system.</a> Neuron. 60, 555-55 (2008).</li>
<li>Svenningsen, A. F., Shan, W. ei-S. ong, Colman, D. avidR., Pedraza, L. iliana <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+method+for+culturing+embryonic+neuron-glial+cell+cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid method for culturing embryonic neuron-glial cell cocultures.</a> Journal of Neuroscience Research. 72, 565-56 (2003).</li>
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Los primeros estudios informó la formación de sinapsis y de la mielina madura libre mediada la rotación de cultivos de agregados flotantes 1. El agregado del SNC sistema de cultivo se describe aquí se combina el suero libre de crecimiento de las células progenitoras multipotentes en tres dimensiones con los agregados de la comodidad de las culturas tradicionales en 2D para facilitar el análisis de desarrollo de las células, la migración y la diferenciación in vitro. El sistema puede ser modificado y ...

preparación de las culturas rata total del cerebro de las neuronas y la glía de estudios para el desarrollo

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

Un sistema in vitro que recapitula el desarrollo y diferenciación de células progenitoras en neuronas maduras y células gliales en el sistema nervioso central (SNC) que proporcionan una poderosa plataforma para los neurocientíficos para investigar axo-glial interacciones, propiedades y la diferenciación de células progenitoras multipotentes, y la progresión de oligodendroglial células de linaje en el nivel celular y molecular. Se describe aquí un total de SNC sistema de cultivo de prosencéfalos embrionario de la rata, que puede ser mantenido en un medio libre de suero hasta 3-4 semanas y se utiliza en nuestro laboratorio como un modelo para estudiar las neuronas-glia la interacción y la mielinización del SNC. Este video clip se mostrará cómo aislar y cultivar estas culturas agregada del SNC de cerebro de rata E16. Además, a partir de la disección del cerebro mismo, altamente enriquecido regulares cultivos de neuronas disociadas se pueden obtener fácilmente y se utiliza para diversos estudios sobre las neuronas del SNC o utilizados para co-cultivos con otras células.

A los protocolos de un sistema de cerebro de rata embrionaria cultura global se describe. Progenitoras multipotentes en los agregados pueden desarrollarse y diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos.

Preparación de las Culturas Rata total del cerebro de las neuronas y la glía de Estudios para el Desarrollo

Un sistema in vitro que recapitula el desarrollo y la diferenciación de progenitores en neuronas y glía maduras en el sistema nervioso central (SNC) ...

Presentamos un sistema para cultivar progenitores neuronales del SNC mientras se desarrollan y diferencian en neuronas y glía maduras. El procedimiento comienza con el aislamiento de cuatro cerebros de fetos de rata E16 y su digestión con propano. Los tejidos se disocian en una suspensión de células individuales, se filtran, se cuentan y se distribuyen en un seis.Las células de la placa de cultivo se resuspenden suavemente una vez al día durante dos o tres días para permitir la formación de agregados. Luego, los agregados se recolectan y se tamizan a través de una malla de 200 micrómetros, y los pequeños grumos y los restos celulares se eliminan mediante lavados. Finalmente, se cuentan los agregados y se siembran sobre cubreobjetos recubiertos con matrigel.Hola, soy Coto del laboratorio del Dr. John L en el Departamento de Ciencias Biosanitarias Veterinarias Integradas de la Universidad Texas A&M. Hoy les mostraremos un procedimiento para cultivos de agregados cerebrales. Utilizamos este procedimiento en nuestro nivel tres para estudiar la linaje endocítica, el desarrollo celular y las interacciones aceleradas.Así que comencemos. Antes de empezar, tenga listos sobre la mesa herramientas esterilizadas, etanol al 70 %, una almohadilla para trabajar y placas de Petri de 10 centímetros para la disección. Medio sobre hielo.En la campana, prepare un microscopio de disección con una plataforma de hielo y varias placas de 10 centímetros con medio de disección también sobre hielo. Por último, prepare las soluciones que utilizará y caliente el medio de siembra a 37 grados en un baño de agua. Comience este protocolo obteniendo embriones del día embrionario 16 (E16) de una rata Sprague Dawley.Primero, sacrifique una hembra preñada siguiendo un procedimiento aprobado por el comité institucional de cuidado y uso de animales. Coloque la rata sacrificada sobre una almohadilla para pañales y rocíe su abdomen con alcohol para limpiarlo. A continuación, use pinzas para pellizcar la piel abdominal y, con la otra mano, use tijeras para cortar únicamente la piel, separe la piel y use otro juego de pinzas y tijeras esterilizadas para cortar a través de la capa muscular.A continuación, retire el útero y transfiéralo a una placa de 10 centímetros que contenga medio de disección frío con hielo. El siguiente paso se lleva a cabo en la campana extractora utilizando tijeras de disección microquirúrgicas. Retire cuidadosamente cada embrión del útero.Ahora es momento de cosechar y comenzar. Trabaje con los cerebros embrionarios. Extraiga el cerebro de cada embrión y coloque los cerebros liberados en un platillo limpio de 10 centímetros con medio de disección sobre una plataforma de hielo. Bajo el microscopio de disección, termine de diseccionar los cerebros.Retire las secciones del mesencéfalo y del rombencéfalo. Utilice pinzas finas para eliminar las meninges y transfiera lo que queda del prosencéfalo a un tubo cónico de 50 mililitros que contenga medio de disección. Ahora el tejido está listo para el siguiente paso.Disociación de células mediante digestión enzimática. Justo antes de estar listo para comenzar la digestión, prepare soluciones frescas de inhibidor de proteasa e inhibidor de tripsina. Estérilicelas y caliéntelas a 37 grados Celsius en un baño de agua.Retire el medio en exceso de los cerebros diseccionados. A continuación, agregue cuatro mililitros de la solución digestiva de propano preparada al tubo de 50 mililitros. Incube el tubo en un baño de agua a 37 grados Celsius durante exactamente cinco minutos.Cuando se cumpla el tiempo, utilice una pipeta para eliminar la solución de propano. A continuación, agregue cinco mililitros de solución recién preparada de inhibidor de tripsina y coloque el tubo nuevamente en el baño de agua a 37 grados Celsius durante dos o tres minutos más. Cuando se cumpla el tiempo, retire la solución de inhibidor de tripsina.Repita la incubación con la solución de inhibidor de tripsina otras tres veces. Después de eliminar la solución de inhibidor de tripsina por última vez, agregue 20 mililitros. Medio de siembra tibio pm a su tubo.Ahora es momento de iterar y lavar sus células. Itere las células con una pipeta de 10 mililitros hasta que todos los agregados hayan desaparecido, aproximadamente de 20 a 30 veces. Luego, centrifugue a cien G durante siete minutos.En este momento, sus células deben estar bien separadas entre sí. Después de siete minutos, retire el sobrenadante y resuspenda el precipitado en 10 mililitros de medio de siembra para lavar las células.Luego, centrifúgelos nuevamente. Retire el sobrenadante y repita la lavada y la centrifugación. Paso tras la segunda lavada.ReSuspender el sedimento en 10 mililitros de medio de cultivo de agregados, pasar las células a través de un tamiz celular de 70 micrómetros. Finalmente, contar las células viables utilizando un hemocitómetro.Y ahora está listo para permitir que las células cerebrales disociadas formen agregados. Después de contarlas, suspenda las células disociadas en medio de cultivo para agregados a una densidad de dos veces 10 a la sexta células por mililitro. Transfiera dos mililitros de la suspensión celular a cada pocillo de una placa de seis pocillos no recubierta.Las células se resuspenden suavemente cada día durante tres noches. Una vez utilizando una pipeta P1000, las células comenzarán a formar agregados el día del sembrado de agregados. Después de que las células hayan crecido durante tres noches, resuspenda nuevamente las células suavemente y pase la suspensión a través de una malla de 200 micrómetros hacia un tubo falcón de 50 mililitros.Deje que los agregados sedimenten en el fondo del tubo durante aproximadamente tres a cinco minutos. Luego, retire cuidadosamente el sobrenadante, agregue medio, resuspenda suavemente los agregados y déjelos sedimentar nuevamente. Repita este procedimiento varias veces.Para eliminar células muertas, células individuales y restos celulares, utilice el microscopio para verificar si los sobrenadantes aún contienen células no agregadas y restos. Una vez que haya lavado completamente los agregados, resuspenda suavemente estos en el mismo medio y cuente los agregados para determinar su concentración. Luego, ajuste la densidad de los agregados a aproximadamente 25-30 agregados por 50 microlitros.Ahora es el momento de sembrar los cubreobjetos con agregados. Transfiera alícuotas de 1000 microlitros de la suspensión de agregados a tubos eppendorf de dos mililitros; dado que los agregados tienden a sedimentar en el fondo de los tubos, es fundamental preparar varios tubos de la suspensión de agregados para su siembra. Los cubreobjetos utilizados en este paso están recubiertos con matrigel, un sustrato para cultivo celular, mediante una incubación nocturna a 37 grados Celsius.Después de haber preparado Alec watts de la suspensión agregada, retire la placa de cultivo que contiene las cubreobjetos recubiertas con matrigel del incubador. Retire la solución de cada una. Lave las cubreobjetos con PBS tibio y luego con H2O DD.Ya están listos para la siembra de agregados para sembrar la laminilla con agregados. Invierta el tubo de la suspensión de agregados para mezclar y distribuir uniformemente los agregados. A continuación, cargue 50 microlitros de la suspensión de agregados en el centro de cada laminilla.Coloque suavemente la placa de nuevo en el incubador sin ninguna perturbación adicional para permitir que los agregados se adhieran uniformemente a la laminilla. La densidad de los agregados es crucial, ya que si se sitúan demasiado cerca unos de otros o si la densidad de siembra es alta, tienden a fusionarse a medida que crecen, cuatro a seis horas después de la siembra inicial. Añada 500 microlitros de medio de cultivo a cada pocillo.Para mantener la cultura de agregados, cambie la mitad del medio cada tres o cuatro días. Cuando cambie el medio, añádalo a lo largo de la pared lateral del pocillo para evitar perturbar los agregados. Unas horas después de que los agregados se adhieran al cubreobjetos, se puede observar la neurita que brota de los agregados.Los axones crecen rápidamente durante las primeras dos semanas y forman conexiones abundantes entre los agregados. Los precursores de glía migran radialmente hacia fuera de los agregados y se diferencian con el tiempo en astrocitos y oligodendrocitos maduros. Acabamos de mostrarle cómo cultivar agregados de CS.Al realizar este procedimiento, es importante recordar citar correctamente la capacidad y verter el agregado de manera uniforme. Eso es todo.Gracias por ver este video y buena suerte con su experimento.

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Biología

Aquí les ofrecemos un protocolo para el cultivo de neuronas de rata cortical en presencia de una capa alimentadora glial. Los cultivos de neuronas de establecer la polaridad y la creación de sinapsis, y se puede separar de la glía para su uso en diversas aplicaciones, tales como la electrofisiología, imágenes de calcio, los ensayos de supervivencia de las células, inmunocitoquímica, y ADN / ARN / aislamiento de las proteínas.

Bilaminar Co-cultivo de neuronas de rata primaria cortical y la glía

Aislamiento de la microglía primaria a partir de la heterogeneidad celular del cerebro es esencial para investigar su papel en las dos condiciones fisiológicas y patológicas. Este protocolo describe un aislamiento mecánico y técnica mixta de cultivo celular que proporciona un alto rendimiento y alta pureza, viables células primarias microgliales...

El aislamiento de la microglía Primaria cultivos mixtos de células gliales del tejido neonatal cerebro de rata

Se describe un método rápido para aislar y cultivar las neuronas del hipocampo y la corteza a partir de embriones de roedores. Este protocolo nos permite realizar experimentos en los que los cultivos neuronales casi puros son necesarios.

Aislamiento y cultivo de células neuronales de ratas embrionarias: un protocolo rápido

Este video muestra una técnica para establecer un cultivo tridimensional de células gliales. Las células gliales derivadas del cerebro de rata están encapsuladas dentro de una matriz polimérica fotoreticulable que contiene componentes de la matriz extracelular. Al incubar en un medio de crecimiento, las células gliales proliferan dentro de la matriz de soporte para crear un cultivo tridimensional.

Establecimiento de un cultivo tridimensional de células gliales derivadas del cerebro de rata

El objetivo del presente estudio fue validar la reproducibilidad de un modelo de acreditación in vitro que implica una rata singénico co-cultivo de células endoteliales y astrocitos. La monocapa de células endoteliales presentan alta y baja permeabilidad TEER LY. La expresión de proteínas TJ específicos, se evaluaron las respuestas funcionales a la inflamación y la funcionalidad de los transportadores y los receptores.

Establecimiento de un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de Rata barrera hematoencefálica (BBB): Un Enfoque en la acreditación Impermeabilidad y transporte mediado por los receptores

Se describe procedimientos para el etiquetado y la genotipificación ratones recién nacidos y la generación de cultivos primarios de neuronas de ellos. La genotipificación es rápida, eficiente y fiable, y permite la extracción automatizada de ácido nucleico. Esto es especialmente útil para los ratones neonatally letales y sus culturas que requieren previa cumplimentación del genotipado.

Rápido Genotipado de animales seguidas del establecimiento de cultivos primarios de neuronas cerebrales

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Un enfoque optogenética para Evaluar formación de conexiones neuronales en un sistema de co-cultura

Modificamos e implementar un protocolo previamente publicado que describe la diferenciación rápida, reproducible y eficiente de los inducidos por el hombre células madre pluripotentes (hiPSCs) en neuronas corticales excitatorios 12. Específicamente, nuestra modificación permite el control de la densidad celular neuronal y su uso en matrices de micro-electrodos para medir las propiedades electrofisiológicas en el nivel de red.

Neuronal rápida diferenciación de células madre pluripotentes inducidas para la medición de actividad de red en matrices de micro-electrodos

Este artículo describe el protocolo para el cultivo de baja densidad de neuronas del hipocampo primarias que crecen en cubreobjetos de vidrio invertida sobre una monocapa glial. Las capas de neuronas y de la glía están separados por perlas de cera de parafina. Las neuronas cultivadas por este método son adecuados para formación de imágenes ópticas de alta resolución y ensayos funcionales.

Baja densidad primaria del hipocampo Neurona Cultura

Este artículo describe el aislamiento y el cultivo de las neuronas simpatizantes de ratas embrionarias de los ganglios cervicales superiores. También proporciona protocolos detallados para la tinción inmunocitoquímica y para la preparación de extractos neuronales para el análisis espectrométrico de masas.

Cultivar neuronas simpáticas de ratas de Ganglia cervical superior embrionario para análisis morfológico y proteómico

Aquí, presentamos un enfoque simple utilizando medios de cultivo específicos que permiten el establecimiento de culturas enriquecidas con neuronas y astrocitos, o cultivos de neurona-glia de la corteza embrionaria, con alto rendimiento y reproducibilidad.

Un modelo de cultivo celular para estudiar el papel de las interacciones de neuronas y glia en isquemia

Aprende a preparar cultivos de agregados cerebrales de rata embrionaria para estudiar la diferenciación de progenitores neuronales en neuronas y glía. Este protocolo permite analizar el desarrollo del SNC in vitro.

Preparación de las Culturas Rata total del cerebro de las neuronas y la glía de Estudios para el Desarrollo

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