Preparación de las Culturas Rata total del cerebro de las neuronas y la glía de Estudios para el Desarrollo
30 de septiembre de 2009
A los protocolos de un sistema de cerebro de rata embrionaria cultura global se describe. Progenitoras multipotentes en los agregados pueden desarrollarse y diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos.
Presentamos un sistema para cultivar progenitores neuronales del SNC mientras se desarrollan y diferencian en neuronas y glía maduras. El procedimiento comienza con el aislamiento de cuatro cerebros de fetos de rata E16 y su digestión con propano. Los tejidos se disocian en una suspensión de células individuales, se filtran, se cuentan y se distribuyen en un seis.
Las células de la placa de cultivo se resuspenden suavemente una vez al día durante dos o tres días para permitir la formación de agregados. Luego, los agregados se recolectan y se tamizan a través de una malla de 200 micrómetros, y los pequeños grumos y los restos celulares se eliminan mediante lavados. Finalmente, se cuentan los agregados y se siembran sobre cubreobjetos recubiertos con matrigel.
Hola, soy Coto del laboratorio del Dr. John L en el Departamento de Ciencias Biosanitarias Veterinarias Integradas de la Universidad Texas A&M. Hoy les mostraremos un procedimiento para cultivos de agregados cerebrales. Utilizamos este procedimiento en nuestro nivel tres para estudiar la linaje endocítica, el desarrollo celular y las interacciones aceleradas.
Así que comencemos. Antes de empezar, tenga listos sobre la mesa herramientas esterilizadas, etanol al 70 %, una almohadilla para trabajar y placas de Petri de 10 centímetros para la disección. Medio sobre hielo.
En la campana, prepare un microscopio de disección con una plataforma de hielo y varias placas de 10 centímetros con medio de disección también sobre hielo. Por último, prepare las soluciones que utilizará y caliente el medio de siembra a 37 grados en un baño de agua. Comience este protocolo obteniendo embriones del día embrionario 16 (E16) de una rata Sprague Dawley.
Primero, sacrifique una hembra preñada siguiendo un procedimiento aprobado por el comité institucional de cuidado y uso de animales. Coloque la rata sacrificada sobre una almohadilla para pañales y rocíe su abdomen con alcohol para limpiarlo. A continuación, use pinzas para pellizcar la piel abdominal y, con la otra mano, use tijeras para cortar únicamente la piel, separe la piel y use otro juego de pinzas y tijeras esterilizadas para cortar a través de la capa muscular.
A continuación, retire el útero y transfiéralo a una placa de 10 centímetros que contenga medio de disección frío con hielo. El siguiente paso se lleva a cabo en la campana extractora utilizando tijeras de disección microquirúrgicas. Retire cuidadosamente cada embrión del útero.
Ahora es momento de cosechar y comenzar. Trabaje con los cerebros embrionarios. Extraiga el cerebro de cada embrión y coloque los cerebros liberados en un platillo limpio de 10 centímetros con medio de disección sobre una plataforma de hielo. Bajo el microscopio de disección, termine de diseccionar los cerebros.
Retire las secciones del mesencéfalo y del rombencéfalo. Utilice pinzas finas para eliminar las meninges y transfiera lo que queda del prosencéfalo a un tubo cónico de 50 mililitros que contenga medio de disección. Ahora el tejido está listo para el siguiente paso.
Disociación de células mediante digestión enzimática. Justo antes de estar listo para comenzar la digestión, prepare soluciones frescas de inhibidor de proteasa e inhibidor de tripsina. Estérilicelas y caliéntelas a 37 grados Celsius en un baño de agua.
Retire el medio en exceso de los cerebros diseccionados. A continuación, agregue cuatro mililitros de la solución digestiva de propano preparada al tubo de 50 mililitros. Incube el tubo en un baño de agua a 37 grados Celsius durante exactamente cinco minutos.
Cuando se cumpla el tiempo, utilice una pipeta para eliminar la solución de propano. A continuación, agregue cinco mililitros de solución recién preparada de inhibidor de tripsina y coloque el tubo nuevamente en el baño de agua a 37 grados Celsius durante dos o tres minutos más. Cuando se cumpla el tiempo, retire la solución de inhibidor de tripsina.
Repita la incubación con la solución de inhibidor de tripsina otras tres veces. Después de eliminar la solución de inhibidor de tripsina por última vez, agregue 20 mililitros. Medio de siembra tibio pm a su tubo.
Ahora es momento de iterar y lavar sus células. Itere las células con una pipeta de 10 mililitros hasta que todos los agregados hayan desaparecido, aproximadamente de 20 a 30 veces. Luego, centrifugue a cien G durante siete minutos.
En este momento, sus células deben estar bien separadas entre sí. Después de siete minutos, retire el sobrenadante y resuspenda el precipitado en 10 mililitros de medio de siembra para lavar las células.
Luego, centrifúgelos nuevamente. Retire el sobrenadante y repita la lavada y la centrifugación. Paso tras la segunda lavada.
ReSuspender el sedimento en 10 mililitros de medio de cultivo de agregados, pasar las células a través de un tamiz celular de 70 micrómetros. Finalmente, contar las células viables utilizando un hemocitómetro.
Y ahora está listo para permitir que las células cerebrales disociadas formen agregados. Después de contarlas, suspenda las células disociadas en medio de cultivo para agregados a una densidad de dos veces 10 a la sexta células por mililitro. Transfiera dos mililitros de la suspensión celular a cada pocillo de una placa de seis pocillos no recubierta.
Las células se resuspenden suavemente cada día durante tres noches. Una vez utilizando una pipeta P1000, las células comenzarán a formar agregados el día del sembrado de agregados. Después de que las células hayan crecido durante tres noches, resuspenda nuevamente las células suavemente y pase la suspensión a través de una malla de 200 micrómetros hacia un tubo falcón de 50 mililitros.
Deje que los agregados sedimenten en el fondo del tubo durante aproximadamente tres a cinco minutos. Luego, retire cuidadosamente el sobrenadante, agregue medio, resuspenda suavemente los agregados y déjelos sedimentar nuevamente. Repita este procedimiento varias veces.
Para eliminar células muertas, células individuales y restos celulares, utilice el microscopio para verificar si los sobrenadantes aún contienen células no agregadas y restos. Una vez que haya lavado completamente los agregados, resuspenda suavemente estos en el mismo medio y cuente los agregados para determinar su concentración. Luego, ajuste la densidad de los agregados a aproximadamente 25-30 agregados por 50 microlitros.
Ahora es el momento de sembrar los cubreobjetos con agregados. Transfiera alícuotas de 1000 microlitros de la suspensión de agregados a tubos eppendorf de dos mililitros; dado que los agregados tienden a sedimentar en el fondo de los tubos, es fundamental preparar varios tubos de la suspensión de agregados para su siembra. Los cubreobjetos utilizados en este paso están recubiertos con matrigel, un sustrato para cultivo celular, mediante una incubación nocturna a 37 grados Celsius.
Después de haber preparado Alec watts de la suspensión agregada, retire la placa de cultivo que contiene las cubreobjetos recubiertas con matrigel del incubador. Retire la solución de cada una. Lave las cubreobjetos con PBS tibio y luego con H2O DD.
Ya están listos para la siembra de agregados para sembrar la laminilla con agregados. Invierta el tubo de la suspensión de agregados para mezclar y distribuir uniformemente los agregados. A continuación, cargue 50 microlitros de la suspensión de agregados en el centro de cada laminilla.
Coloque suavemente la placa de nuevo en el incubador sin ninguna perturbación adicional para permitir que los agregados se adhieran uniformemente a la laminilla. La densidad de los agregados es crucial, ya que si se sitúan demasiado cerca unos de otros o si la densidad de siembra es alta, tienden a fusionarse a medida que crecen, cuatro a seis horas después de la siembra inicial. Añada 500 microlitros de medio de cultivo a cada pocillo.
Para mantener la cultura de agregados, cambie la mitad del medio cada tres o cuatro días. Cuando cambie el medio, añádalo a lo largo de la pared lateral del pocillo para evitar perturbar los agregados. Unas horas después de que los agregados se adhieran al cubreobjetos, se puede observar la neurita que brota de los agregados.
Los axones crecen rápidamente durante las primeras dos semanas y forman conexiones abundantes entre los agregados. Los precursores de glía migran radialmente hacia fuera de los agregados y se diferencian con el tiempo en astrocitos y oligodendrocitos maduros. Acabamos de mostrarle cómo cultivar agregados de CS.
Al realizar este procedimiento, es importante recordar citar correctamente la capacidad y verter el agregado de manera uniforme. Eso es todo.
Gracias por ver este video y buena suerte con su experimento.
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Resumen
Este artículo describe un protocolo para el cultivo de agregados cerebrales de rata embrionaria. Los progenitores pluripotentes dentro de estos agregados pueden diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Cultivo celular
- Biología del desarrollo
Antecedentes
- Comprender el desarrollo del SNC es fundamental para la investigación en neurociencia.
- Los progenitores pluripotentes pueden dar lugar a diversos tipos celulares en el sistema nervioso.
- Los cultivos agregados proporcionan un modelo para estudiar la diferenciación celular.
- Este método permite la observación del comportamiento celular en un entorno controlado.
Objetivo del estudio
- Establecer un sistema de cultivo confiable para progenitores neuronales del SNC.
- Facilitar el estudio de la diferenciación en neuronas y glía maduras.
- Proporcionar un protocolo que pueda replicarse en otros laboratorios.
Métodos Utilizados
- Aislamiento de cerebros de fetos de rata E16.
- Digestión del tejido cerebral para crear una suspensión de células individuales.
- Filtrado y conteo de células antes de la formación de agregados.
- Siembra de agregados sobre cubreobjetos recubiertos con matrigel para su posterior análisis.
Resultados principales
- Formación exitosa de agregados a partir de células progenitoras aisladas.
- Demuestra la diferenciación en neuronas y células gliales.
- Establecimiento de un protocolo reproducible para estudios futuros.
- Aplicaciones potenciales en la comprensión del desarrollo y trastornos del SNC.
Conclusiones
- El sistema de cultivo descrito es eficaz para estudiar células progenitoras del SNC.
- Los agregados pueden servir como modelo para la diferenciación neuronal y glial.
- Este método puede mejorar la investigación en neurociencia del desarrollo.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo establece un modelo in vitro reproducible del desarrollo del SNC que permite la investigación mecanicista de las interacciones neurogliales y la progresión de la línea oligodendrocítica. Al reproducir la diferenciación de progenitores en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos en un sistema libre de suero, este modelo apoya la validación de dianas y el cribado fenotípico en la investigación de enfermedades neurodegenerativas. El sistema proporciona una plataforma escalable para evaluar los efectos de compuestos sobre la mielinización y la maduración glial, aportando información útil para estrategias preclínicas de reducción de riesgos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la validación funcional de dianas en el sistema nervioso central mediante la observación de la diferenciación de progenitores multipotentes en fenotipos maduros de neuronas y células gliales.
- Valor operativo: Proporciona un sistema de cultivo sin suero y relevante para humanos que reduce el riesgo de traslación específica de especie en estudios de interacción con dianas.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera lecturas cuantificables del crecimiento axonal, la migración glial y la formación de la vaina de mielina para campañas de cribado de compuestos.
- Valor operativo: Facilita la estandarización de ensayos mediante una densidad definida de agregados (25–30 agregados/50 µL) y cambios programados del medio cada 3–4 días.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Modela las interacciones axo-gliales y la maduración de oligodendrocitos, proporcionando un sistema relevante para la investigación de trastornos desmielinizantes.
- Valor operativo: Permite el seguimiento longitudinal de la diferenciación celular durante 3–4 semanas, facilitando el perfilado de eficacia y toxicidad dependiente del tiempo.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos iniciales, ofreciendo una plataforma biológicamente desprovista de riesgos para la evaluación temprana de compuestos antes de avanzar hacia modelos preclínicos complejos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre vías de señalización glioneuronales mediante la diferenciación controlada de progenitores del SNC.
- Selección: Permite la evaluación cuantitativa y reproducible de los efectos de compuestos sobre la integridad de los agregados y la expresión de marcadores específicos de linaje.
- Análisis: Genera resultados cuantificables, incluyendo la longitud de los axones, la migración radial de los astrocitos y las etapas de maduración de los oligodendrocitos, para facilitar la toma de decisiones basada en datos.
- Investigación Traducional: Conecta el descubrimiento con la validación preclínica mediante la modelización de procesos de desarrollo del SNC y vías relacionadas con la mielina relevantes para el ser humano.
- Reutilización Empresarial: Establece un flujo de trabajo escalable y estandarizado para la producción de agregados, aplicable a múltiples proyectos de neurociencia y áreas terapéuticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva en los mecanismos diana al reducir la dependencia de líneas celulares sobreactivadas y capturar la dinámica fisiológica de la diferenciación.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad mediante procedimientos estandarizados de disociación, agregación y siembra que utilizan densidades celulares definidas y cronogramas de maduración.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de avance o interrupción del desarrollo al proporcionar una visión temprana de los efectos del compuesto sobre procesos críticos del SNC, como la mielinización y las funciones de soporte glial.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización de candidatos ajustada al riesgo, basada en la actividad demostrada en un sistema de co-cultivo glial-neuronal fisiológicamente relevante.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en la disección de tejidos embrionarios, disociación enzimática y técnicas de cultivo estéril de agregados.
- Depende del acceso a ratas Sprague-Dawley preñadas sincronizadas, equipo de disección e incubadoras de CO2 para el mantenimiento del cultivo durante 3–4 semanas.
- Necesita la estandarización de los protocolos de lavado de agregados, densidad de siembra y cambio de medio entre diferentes usuarios para garantizar la consistencia fenotípica.
- La adaptación a otras especies o etapas de desarrollo requeriría una reoptimización de los tiempos de digestión enzimática y de las densidades de siembra.
- Está limitado por la ausencia de componentes vasculares e inmunitarios, lo cual podría afectar la modelización de los aspectos neuroinflamatorios de los trastornos del SNC.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:52
Introduction
0:00
Title
1:27
Preparing for Dissection
2:02
Harvesting the E16 Rat Embryos
3:19
Isolating the Forebrains
4:25
Digesting and Triturating the Forebrain Tissue
6:09
Washing, Filtering, and Counting the Dissociated Cells
7:03
Culturing the Dissociated Cells to Promote Aggregation
7:54
Preparing the Coverslips and Washing the Aggregates
9:15
Seeding the Coverslips with the Aggregates
11:06
Representative Connections Formed Among Aggregates
11:29
Conclusion
