Name: Imágenes de exocitosis en las células bipolares de retina con microscopía TIRF (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Aprende a visualizar la exocitosis de vesículas sinápticas en células bipolares de retina de pez dorado mediante microscopía TIRF. Este método permite estudiar los mecanismos de liberación de neurotransmisores en tiempo real.

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Este trabajo fue apoyado por el NIH subvención EY 14990.

Parte 1: La disección y aislamiento de células bipolares <ol><li> Preparar las soluciones en la Tabla 2, el pH de timbres &quot;(externo) de soluciones debe ajustarse a 7,4 con NaOH y el pH de la solución interna debe ser ajustado a 7,2 con CsOH. Proteja la solución interna de la luz con papel de aluminio y conservar a 4 ° C hasta su uso; </li><li> Dark-un pez de colores para adaptarse al menos 30 minutos antes de la disección; </li><li> Mientras que el animal se adapta oscuro, preparar 5 ml de la hialuronidasa (tipo hialuronidasa V, 1100 unidades / ml de bajo Ca 2 + de Ringer, Sigma, St. Louis, MO) y 10 ml de la L-cisteína (0,5 mg / ml en el bajo Ca 2 +) del timbre de soluciones y sopesar la papaína (polvo liofilizado, 40 unidades / ml, Sigma, St. Louis, MO) de 5 ml de la solución de digestión; </li><li> La eutanasia de los peces de colores por decapitación rápida con tijeras quirúrgicas y destruir el cerebro y la médula espinal con una hoja de bisturí # 11; </li><li> Quitar los ojos por la destrucción de los músculos extraoculares con la ayuda de unas pinzas Dumont # 7 curvas y el corte del nervio óptico con tijera iris; </li><li> Colocar un ojo bulbo en un pedazo de papel de filtro y perforar el limbo escleral con la punta de una hoja de bisturí # 11; </li><li> Introducir la hoja de un par de tijeras Vannas en el conjunto del pinchado y cortado el segmento anterior conjunto de distancia; </li><li> Coloque un pedazo pequeño de papel de filtro en la parte superior de la copa óptica restantes y ejercer presión a fin de que el papel empape con humor vítreo; </li><li> Levante el papel de filtro con la retina que se le atribuye y cortar el nervio óptico con un par de tijeras Vannas; </li><li> Coloque el papel de filtro que contiene la retina en un plato de plástico cultura 35 mm con una solución de hialuronidasa y se desprenda la retina del papel de filtro con la ayuda de unas pinzas Dumont # 7; </li><li> Corte de la retina en 4-6 piezas con la mitad de un acero industrial de carbono de un solo filo hoja y dejar que repose en la solución de hialuronidasa durante 20 minutos; </li><li> A la espera de hialuronidasa a surtir efecto, añadir 5 ml de la solución de L-cisteína a la papaína y dejar reposar hasta que el líquido se vuelve transparente (aproximadamente 5-10 minutos); </li><li> Lave las piezas de la retina 3x de bajo Ca 2 + de Ringer y dejar que repose en la solución de papaína durante 30-35 minutos; </li><li> Lave las piezas de la retina 3x de bajo Ca 2 + de Ringer y almacenarlos hasta su uso a 4 ° C en una placa de cultivo de 35 mm de plástico con bajo Ca 2 + de Ringer; </li><li> Para disociar las células, poner un pedazo de retina en un tubo de microcentrífuga que contiene 500 ml de bajo Ca 2 + de timbre y lentamente se tritura la retina con la pipeta hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de vidrio de disociación, con cuidado de no producir burbujas de aire. Pipetas de disociación se fabrican mediante el calentamiento de la punta de una pipeta Pasteur de vidrio con un mechero de Bunsen y ligeramente curvado, con la ayuda de unas pinzas anatómicas; </li><li> Placa de las células aisladas mediante la adición de una gota de la suspensión de la retina a un casero de grabación de cámara previamente llenada con 2 mL de bajo Ca 2 + de Ringer. La cámara se compone de la mitad inferior de una placa de cultivo de 35 mm de plástico con un conjunto circular en el centro y un cubreobjetos circular de cristal de 1,78 de índice de refracción (PlanOptik, Alemania), pegado a la parte inferior con un elastómero de silicona (Sylgard 184, Dow Corning , Midland, MI). </li></ol> Parte 2: Carga de la célula bipolar y lavar TIRF imágenes de las vesículas sinápticas se realiza mejor con un microscopio TIRFM objetivo de tipo con un objetivo muy alto NA y una cámara sensible. Para nuestros experimentos, hemos optado por utilizar un 1.65 NA objetivo (Apo x100 O HR, NA 1.65, Olympus, Japón) con un EMCCD (Cascade 512B, la Ciencia Roper, Tucson, AZ). El uso de la NA objetivo muy alto hace necesario el uso de alta refracción cubreobjetos de vidrio y el líquido de inmersión (di-yodometano con azufre). Bajo nuestras condiciones, la luz de excitación se limita a un campo decae de manera exponencial, con una longitud constante de aproximadamente 50 nm. <ol><li> Añadir una gota de líquido de alto índice de refracción (serie M, el índice de refracción = 1,7800, Laboratorios Cargille, Cedar Grove, Nueva Jersey) con el objetivo del microscopio; </li><li> Coloque la cámara de registro con cuidado en la parte superior del objetivo de microscopio y cuidado montaje de electrodos de tierra y el tubo de salida a la cámara de superfusión; </li><li> Vamos a sentarse en la cámara de microscopio de 10-20 minutos para permitir que las células se hunda y se adhieren a la parte inferior; </li><li> Mientras tanto, preparar 5 ml de una Trolox ® 1mM ((±)- 6-hidroxi-2 ,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxílico; Sigma, St. Louis, MO) en una solución de alta de K + del timbre . Sonicar hasta que se disuelva; </li><li> Prepare 15 ml de ADVASEP-7 Solución de lavado: 1 mM ADVASEP-7 (Sigma, St. Louis, MO) en el bajo Ca 2 + de Ringer. Tenga en cuenta que ADVASEP-7 uso es opcional y puede omitirse si se desea; </li><li> Purgar la li superfusiónsolución nes y añadir ADVASEP-7 lavado, bajo Ca 2 + del timbre y el control del timbre para el sistema de superfusión; </li><li> Tire de la carga de pipetas de paredes delgadas de vidrio de borosilicato (Kwik-Fil ® TW150-3; WPI, Sarasota, FL). Puffer pipeta resistencias se encuentran en el rango de 1.5 a 2.5 mW; </li><li> Preparar el FM1-43 ® (N-(3-triethylammoniumpropyl) -4 - (4 - (dibutilamino) estirilo) piridinio dibromuro, &quot;un embalaje especial&quot;, Invitrogen, Carlsbad, CA) soluciones. En primer lugar, hacer una acción mediante la adición de 1 mM de 160 l de agua destilada a un vial (100 mg) de FM1-43 ®. Esta población puede mantenerse a 4 ° C durante un máximo de una semana. A continuación, añadir 5 L de FM1-43 ® a 1 ml de alto K + + ® timbre de 1 mM Trolox. Proteja la solución de la luz con papel de aluminio y conservar a 4 ° C hasta su uso; </li><li> A su vez la luz del microscopio de campo claro y buscar para intactas las células bipolares. Ligeramente toque en el microscopio para asegurarse de que las neuronas están firmemente pegados a la parte inferior de la cámara; </li><li> Posición de la pluma de superfusión cerca de la célula de interés y continuamente perfundir la preparación con bajo Ca 2 + de Ringer; </li><li> Apague las luces de la habitación y añadir un filtro de pase largo de color rojo (es decir, RG630, Schott, Alemania) para que el camino óptico para reducir al mínimo la excitación del colorante FM; </li><li> Llenar una pipeta de carga con 10 l de la solución de colorante FM, montaje de la pipeta en el micromanipulador e inferior de la pipeta sobre la preparación, sin exceso de presión hasta que esté en el mismo plano focal como la célula bipolar que desea cargar. Asegúrese de tener al menos dos pinzas de soldadura: la utilizada para el tinte de FM no se puede utilizar para patch clamp, o de lo contrario pueden contaminar la solución intracelular; </li><li> La posición de la apertura de globo a una distancia de unos 10 m de la terminal del axón, a su vez el sistema de superfusión de hojaldre y la solución de colorante durante 10 segundos girando la sobrepresión en la pipeta; </li><li> A su vez el exceso de presión fuera y, sin moverse de la pipeta, espere 30 segundos; </li><li> A su vez la superfusión y se bañan en la cámara en la solución de ADVASEP-7 durante 5 minutos. Al mismo tiempo, eliminar la pipeta de soplado del baño; </li><li> Después de 5 minutos, cambie a la baja de Ca 2 + del timbre y la cámara de perfusión durante 25-30 minutos para permitir la remoción del exceso de tinte. </li></ol> Parte 3: Revisión de sujeción e Imagen TIRFM <ol><li> Mientras que la preparación es lavado, tire pipetas parche de pared gruesa de vidrio de borosilicato (B150-86-10, la compañía de Sutter Instrument, Novato, CA). Parche pipeta resistencias se encuentran en el rango de 8.10 mW; </li><li> Después de lavar se ha completado, coloque el terminal del axón en el centro del campo de visión; </li><li> Llenar una pipeta de parche con 7μL de solución interna, pulse la pipeta para eliminar las burbujas de aire, capa de la pipeta con cera fundida dental (Cera pegajosa, Kerr Corporation, Orange, CA) y montarlo en el micromanipulador; </li><li> A su vez el exceso de presión en la pipeta y baja lentamente la pipeta en la preparación. Compruebe la resistencia de la pipeta en el amplificador y las compensaciones correcta pipeta y capacidad con los controles del amplificador respectivos; </li><li> Cambiar la superfusión para controlar Ringer. Para crear un gigaseal entre la pipeta y la célula, apenas tocar la punta del electrodo contra el cuerpo de la célula y su vez el exceso de presión fuera de la pipeta, mientras que ejerciendo una suave presión negativa al electrodo; </li><li> Mientras sellado, seleccione &quot;célula entera&quot; en el modo de amplificador y ajuste de la célula con un potencial de -60 mV; </li><li> Elija una región de interés con el software de imagen que abarca toda la terminal del axón, a su vez a la luz de campo claro y fuera, con la exposición breve (30 ms) de la terminal con el láser de 488 nm, encontrar el plano focal de la derecha TIRF imágenes; </li><li> Entrar en la célula mediante el &quot;zapping&quot; de comandos del amplificador, mientras que la aplicación de presión ligeramente negativa en la pipeta; </li><li> Correcto para la capacitancia celular y la resistencia en serie, y luego aplicar el protocolo de tensión de interés, mientras que imágenes del movimiento de las vesículas sinápticas. Es en esta etapa tan importante que el protocolo de voltaje sincronizado con la velocidad de fotogramas de la cámara. En nuestro caso, cada cuadro es de 30 ms de largo, por lo que los cambios de tensión se presentan en múltiplos de este valor (es decir, cada 300 ms o marcos 10); </li><li> Espere al menos 40 segundos entre los ensayos para permitir la recuperación; </li><li> Para comprobar la posición de las cintas sinápticas, tomar fotografías mientras se gira el láser de 561 nm en. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1305/fig1.jpg" alt="la figura 1" /> Figura 1: El montaje del experimento. A 488 nm láser (azul) se centra en la periferia del plano focal posterior del objetivo y sufre una reflexión interna total cuando se llega a la copa-acuosa interfaz de mediano plazo. El campo electromagnético generado por el rayo reflejado excita al fluoróforo carga en las vesículas sinápticas más cercano a la bottom de la cámara de vidrio, que luego fluorescente (verde). La luz fluorescente se guía a los ojos del observador (representados) o una cámara CCD. El potencial de membrana de las células de imágenes se controla de forma simultánea por ellos de patch-clamp. Este enfoque permite el estudio de la relación entre las señales de entrada (el voltaje de la membrana) y la salida neuronal (exocitosis). <img src="/files/ftp_upload/1305/fig2.jpg" alt="la figura 2" /> Figura 2: Los resultados típicos. Izquierda: imagen de campo claro de una célula de peces de colores bipolar aislado. Arriba a la derecha: imagen TIRF de las vesículas sinápticas en el terminal del axón bipolar celular cargado con FM 1-43 ® y la imagen con el láser de 488 nm (FM tinte). Abajo a la derecha: imagen de la misma terminal después de un parche en el celular y la imagen de la terminal del axón con el láser de 561 nm. Cintas sinápticas son etiquetados por la rodamina basado RIBEYE de unión de péptidos (Rpep_rhod). Tabla 1: Reactivos y equipos específicos. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Tipo </td><td> Fabricante </td><td> Catálogo </td><td> Comentario </td></tr><tr><td> - </td><td> Tabla de aire </td><td> Newport Corporation </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> IX70 </td><td> Microscopio invertido </td><td> Olimpo </td><td> - </td><td> Equipado con una lámpara de tungsteno para campo claro y un puerto de apertura lateral para TIRF </td></tr><tr><td> TH4-100 </td><td> Fuente de alimentación de la lámpara </td><td> Olimpo </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> FF498_581-DI01 </td><td> Filtro dicroico </td><td> Semrock </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> NF01-405_488_568 </td><td> Filtro de emisiones </td><td> Semrock </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Apo x100 O HR </td><td> Objetivo </td><td> Olimpo </td><td> - </td><td> NA 1,65 </td></tr><tr><td> RG630 </td><td> Red de filtro de vidrio </td><td> Schott </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> 488 nm láser </td><td> Coherente </td><td> - </td><td> Utilice la potencia mínima </td></tr><tr><td> - </td><td> Obturador </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> VMM-D1 </td><td> Conductor del obturador </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> 561 nm láser </td><td> Melles Griot </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Obturador </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> VMM-D3 </td><td> Conductor del obturador </td><td> Uniblitz </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Kit de presión de perfusión </td><td> Superfusión sistema </td><td> Automatizar la Ciencia </td><td> 09-04 </td><td> - </td></tr><tr><td> Perfusión de la pluma </td><td> Superfusión sistema </td><td> Automatizar la Ciencia </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> ValveLink 8 </td><td> Superfusión controlador del sistema </td><td> Automatizar la Ciencia </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Cascada 512B </td><td> EM cámara CCD </td><td> Roper Científico </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Metamorph 7.1 </td><td> Software de imágenes </td><td> Molecular Devices </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> EPC-9 </td><td> Parche amplificador Clamp </td><td> HEKA Elektronik </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Pulso </td><td> Amplificador de Software </td><td> HEKA Elektronik </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MP-285 </td><td> Micromanipulador </td><td> Sutter Instrumento </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> Portaelectrodos </td><td> HEKA Elektronik </td><td> - </td><td> De 1,5 mm de diámetro exterior de vidrio, 2 unidades </td></tr><tr><td> Kwik-Fil ® TW150-3 </td><td> Capilar de vidrio de borosilicato </td><td> WPI </td><td> - </td><td> Sin filamento </td></tr><tr><td> B150-86-10 </td><td> Capilar de vidrio de borosilicato </td><td> Sutter Instrumento </td><td> - </td><td> Con filamento </td></tr><tr><td> P-97 </td><td> Microelectrodo Extractor </td><td> Sutter Instrumento </td><td> - </td><td> Equipado con caja de 3x3 y filamento cámara ambiental </td></tr><tr><td> - </td><td> Vacío presión del aire de la bomba </td><td> Thomas Scientific </td><td> 7893B05 </td><td> Crea un vacío para extraer líquidos de la cámara y el exceso de presión para pipetas </td></tr><tr><td> MatLab R2008a </td><td> Análisis de Software </td><td> The MathWorks </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> 353001 </td><td> Placas de 35 mm de Cultura de plástico </td><td> Halcón </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> - </td><td> De vidrio de alta refracción Índice </td><td> PlanOptik </td><td> - </td><td> Índice de refracción 488 nm = 1,78 </td></tr><tr><td> Serie M </td><td> Refracción de líquidos de alta Índice </td><td> Cargille Laboratorios </td><td> - </td><td> Índice de refracción = 1,78 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 </td><td> Kit de elastómero de silicona </td><td> Dow Corning </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Glutatión </td><td> Tripéptido </td><td> EMD Chemicals </td><td></td><td> Libre radical tesoro </td></tr><tr><td> Hialuronidasa </td><td> Enzima </td><td> Sigma </td><td> H6254 </td><td> Tipo V </td></tr><tr><td> L-cisteína </td><td> Aminoácido </td><td> Fluka </td><td> 30090 </td><td> Activa la papaína </td></tr><tr><td> Papaína </td><td> Enzima </td><td> Fluka </td><td> 76220 </td><td> De Carica papaya </td></tr><tr><td> Trolox ® </td><td> Solubles de vitamina E </td><td> Sigma </td><td> 56510 </td><td> Depurador de radicales libres </td></tr><tr><td> ADVASEP-7 </td><td> Sulfonados B-ciclodextrina </td><td> Sigma </td><td> A3723 </td><td> Reduce el FM 1-43 ® fluorescencia de fondo </td></tr><tr><td> FM 1-43 ® </td><td> Colorante fluorescente </td><td> Invitrogen </td><td> T35356 </td><td> &quot;Embalaje especial&quot; </td></tr><tr><td> Cera pegajosa </td><td> Pipeta agente de recubrimiento </td><td> Kerr Corporation </td><td> - </td><td> Disminuye la capacidad de pipeta </td></tr></tbody></table> Tabla 2: Soluciones fisiológicas utilizadas en este estudio. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Sustancia </td><td> Bajo Ca 2 + de Ringer </td><td> Control del timbre de </td><td> Alto contenido de K + de Ringer </td><td> Solución interna </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 120 mM </td><td> 120 mM </td><td> 97,5 mM </td><td> - </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 2,5 mM </td><td> 2,5 mM </td><td> 25 mM </td><td> - </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td><td> 4 mM </td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 0,5 mM </td><td> 2,5 mM </td><td> 2,5 mM </td><td> - </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 0,75 mM </td><td> - </td><td> - </td><td> 0,5 mM </td></tr><tr><td> Glucosa </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> Glutatión </td><td> 2 mM </td><td> 2 mM </td><td> - </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> * CH 3 CsO 3 S </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> TEACl </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> ATP-Mg </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> GTP-Li </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> Rpep Rhod-** </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Volumen </td><td> 200 ml </td><td> 100 ml </td><td> 5 l </td><td> 100 L </td></tr></tbody></table> * Metanosulfonato de cesio. ** RIBEYE de unión a péptido: rodamina + EQTVPVDLSVARDR-COOH (mw 1.997,75).

<ol><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology.</a> Traffic. 2, 764-774 (2001).</li>
<li>Zenisek, D., Steyer, J. A., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport%2C+capture+and+exocytosis+of+single+synaptic+vesicles+at+active+zones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones.</a> Nature. 406, 849-854 (2000).</li>
<li>Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+association+and+exocytosis+at+ribbon+and+extraribbon+sites+in+retinal+bipolar+cell+presynaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Vesicle association and exocytosis at ribbon and extraribbon sites in retinal bipolar cell presynaptic terminals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 4922-4927 (2008).</li>
<li>Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+synaptic+ribbons+in+the+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualizing synaptic ribbons in the living cell.</a> J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li>
<li>Rouze, N. C., Schwartz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continous+and+transient+vesicle+cycling+at+a+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Continous and transient vesicle cycling at a ribbon synapse.</a> J. Neurosci. 18, 8614-8624 (1998).</li>
</ol>

Las ventajas de los objetivos de tipo de microscopía TIRF son: 1) que proporciona seccionamiento óptico excelente mediante la restricción de la luz de excitación a una región estrecha en el plano focal del objetivo, minimizando de esta manera fuera del foco de luz, 2) ya que la luz disminuye exponencialmente con la distancia , el movimiento en sentido vertical se puede controlar con un cambio en la intensidad de la fluorescencia, 3) la colección de bajo consumo a través del objetivo de gran apertura numérica de 1,5. El pr...

imágenes de exocitosis en las células bipolares de retina con microscopía tirf

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Total de reflexión interna de fluorescencia (TIRF) microscopía es una técnica que permite el estudio de los acontecimientos que suceden en la membrana celular, por la imagen selectiva de moléculas fluorescentes que están más cerca de una sustancia alto índice de refracción, como el vidrio<sup&gt; 1</sup&gt;. En este artículo, se aplica esta técnica a la exocitosis la imagen de las vesículas sinápticas en la retina las células bipolares aislados de la retina peces de colores. Estas neuronas son muy adecuados para este tipo de estudios debido a sus grandes terminales de los axones. Al mismo tiempo patch clamp las células bipolares, es posible investigar la relación entre la pre-sináptica de tensión y liberación sináptica<sup&gt; 2,3</sup&gt;. Las vesículas sinápticas dentro de las terminales de células bipolares se cargan con un tinte fluorescente (FM 1-43 ®) por la co-fumando el tinte y una solución de Ringer que contiene un alto K<sup&gt; +</sup&gt; Concentración en los terminales sinápticos. Esto despolariza las células y estimula la absorción de colorante endocitosis y consecuente en las vesículas glutamatérgicas. Después de lavar el exceso de tinte de distancia de alrededor de 30 minutos, las células están listas para ser sujeta de parches y la imagen al mismo tiempo con un láser de 488 nm. La solución de la pipeta parche contiene un péptido rodamina basado en que se une selectivamente a la cinta RIBEYE proteína sináptica<sup&gt; 4</sup&gt;, Con lo que el etiquetado cintas específicamente cuando los terminales son imágenes con un láser de 561 nm. Esto permite la localización precisa de las zonas activas y la separación de sináptica de extra-sináptica eventos.

En este video, que muestra cómo la etiqueta y visualizar solo exocitosis de vesículas sinápticas y el tráfico en las células de la retina con peces de colores bipolar total de fluorescencia de reflexión interna (TIRF) microscopía.

Imágenes de exocitosis en las células bipolares de retina con microscopía TIRF

La microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) es una técnica que permite el estudio de eventos que ocurren en la membrana celular, mediante la selección...

Este procedimiento comienza con la disección de la retina neural de pez dorado adulto, que es el tejido nervioso situado en la parte posterior del ojo. Las retinas se colocan en una solución enzimática durante 35 minutos, se enjuagan y se tratan con una pipeta de vidrio pulida al fuego para disociar las células. Luego, las células se siembran sobre cubreobjetos de vidrio de alto índice de refracción y se montan en placas de cultivo de tejidos de plástico.Las células bipolares aisladas se identifican por su morfología distintiva para cargar los terminales. Se aplica por soplo una solución que contiene FM 1-43 durante 10 segundos y se espera 30 segundos antes de lavar el colorante. Después de un lavado de 30 minutos, las células se someten a registro por parche, se fijan y se observan mediante microscopía TIRF.Hola, mi nombre es Christina Jovi del Laboratorio ZEC en el Departamento de Fisiología Celular y Molecular de la Escuela de Medicina de la Universidad de Yale. Hoy les mostraremos un procedimiento para estudiar la exocitosis en células bipolares retinianas vivas utilizando microscopía turf. Utilizamos este procedimiento en el laboratorio para estudiar los mecanismos de liberación sináptica.Así que comencemos. Para iniciar, adapte a oscuridad un pez dorado durante al menos 30 minutos antes de la disección. Tras la decapitación y la extracción del ojo, coloque un bulbo ocular sobre un trozo de papel de filtro y use la punta de una hoja de bisturí número 11 para perforar el limbo escleral. Dentro del orificio perforado.Utilice un par de tijeras bonna para cortar y separar todo el segmento anterior. A continuación, coloque un pequeño trozo de papel de filtro sobre la copa óptica restante y ejerza algo de presión para que absorba el humor vítreo. Levante el papel de filtro con la retina adherida y, usando un par de tijeras VNA, corte el nervio óptico.Coloque el papel de filtro que contiene la retina en una placa de cultivo plástica de 35 milímetros que contenga solución alta de alur y use pinzas Dumont número siete para desprender la retina del papel de filtro. A continuación, utilizando la mitad de una cuchilla industrial de acero al carbono de filo único, corte la retina en cuatro a seis trozos y déjelos reposar en la solución de hialuronidasa durante 20 minutos. Mientras espera que la hialuronidasa haga efecto, agregue cinco mililitros de solución de L-cisteína a la papaina y déjela reposar durante aproximadamente cinco a 10 minutos hasta que el líquido se vuelva transparente. Lave los trozos de retina tres veces con solución de Ringer baja en calcio y déjelos reposar en la solución de papaina durante 30 a 35 minutos.Después de 35 minutos de incubación en la solución de papaína, lave los fragmentos retinianos tres veces. Transfiera los fragmentos a una placa de cultivo plástica de 35 milímetros que contenga ringer con bajo contenido de calcio, y almacene la placa a 12-14 grados Celsius hasta que esté listo para comenzar la disociación de las células.Primero, fabrique una pipeta de disociación usando un mechero Bunsen para calentar la punta de una pipeta de vidrio PE o una pipeta, y luego use fórceps anatómicos para doblarla ligeramente. Coloque un trozo de retina en un tubo microcentrífugo que contenga solución de Ringer con bajo contenido de calcio e itere lentamente la retina pipeteando cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo con la pipeta de disociación fabricada. Tenga cuidado de no producir burbujas de aire y plaque las células aisladas añadiendo una gota de la suspensión retiniana a una cámara de registro casera llena con solución de Ringer con bajo contenido de calcio.La cámara consiste en la mitad inferior de un recipiente de cultivo plástico de 35 milímetros con un orificio circular en el centro y un cubreobjetos circular hecho de vidrio con índice de refracción 1.78 pegado en la base. Con el disección y el aislamiento de las células bipolares completados, estamos listos para comenzar la carga y el lavado de las células bipolares. En este experimento, es mejor utilizar un microscopio de fluorescencia por reflexión interna total del tipo objetivo con un objetivo de alta apertura numérica y una cámara sensible.En este video, utilizaremos un objetivo con una apertura numérica de 1.65 y un dispositivo acoplado a carga con multiplicación electrónica. Para comenzar, agregue una gota de líquido con alto índice de refracción al objetivo del microscopio. Coloque la cámara de grabación encima del objetivo del microscopio.Coloque cuidadosamente el electrodo de tierra y el tubo de salida de la superfusión en la cámara. Deje la cámara sobre el microscopio durante 10 a 20 minutos, permitiendo que las células se asienten y adhieran al fondo. A continuación, purgue las líneas de superfusión y agregue la solución de lavado.Solución ringer con bajo calcio y solución ringer control al sistema de superfusión. Encienda la luz de campo claro del microscopio y busque células bipolares intactas. Toque ligeramente el microscopio para asegurarse de que las neuronas estén firmemente adheridas al fondo de la cámara.Coloque el bolígrafo de superfusión cerca de una célula intacta y perfunda continuamente el preparado con solución de Ringer de bajo calcio. Ahora apague las luces de la habitación y agregue un filtro de paso largo rojo al trayecto óptico para minimizar la excitación del colorante fluorescente. Llene una pipeta de carga con 10 microlitros de solución de colorante fluorescente.Colóquelo en el micromanipulador y luego bájelo sobre la preparación sin usar la opción de sobrepresión hasta que esté en el mismo plano focal que la célula bilar seleccionada. Posicione la abertura del puffer a una distancia de aproximadamente 10 micrómetros del terminal axónico. Apague el sistema de superfusión e insufle la solución de colorante durante 10 segundos activando la sobrepresión en la pipeta.Ahora desactive la sobrepresión y, sin mover la pipeta, espere 30 segundos. Encienda el sistema de superfusión y bañe la cámara con la solución de lavado durante cinco minutos. Mientras tanto, retire la pipeta de perfusión del baño.Después de cinco minutos, cambie el sistema de SUPERFUSIÓN a la solución de ringer con bajo calcio y perfúndala durante 25 a 30 minutos, permitiendo así la eliminación del exceso de colorante tras completarse la carga y el lavado de las células bipolares. Estamos listos para comenzar el registro mediante parche y la imagenología mediante T-I-R-F-M. Una vez finalizado el lavado, cambie los porta-electrodos para evitar la contaminación de su pipeta de parche con el colorante.Coloque el terminal axónico en el centro del campo de visión. Llene una pipeta de registro con siete microlitros de solución interna. Tóquela para eliminar las burbujas de aire.Recubra con cera dental fundida y luego colóquela en el micromanipulador. Invierta la pipeta, encienda la presión y baje lentamente la pipeta sobre el preparado. Verifique la resistencia de la pipeta y realice las correcciones necesarias.A continuación, con el sistema de superfusión ajustado a la solución reguladora de Ringer, cree un sello gigaohmio entre la pipeta y la célula tocando ligeramente la punta del electrodo contra el cuerpo celular. Con la presión sobre la pipeta desactivada, aplique suavemente presión negativa al electrodo mientras está sellado. Seleccione el modo de célula completa en el amplificador y ajuste el potencial de mantenimiento de la célula a menos 60 milivoltios.Ahora utilice un software de imagen para seleccionar una región de interés que incluya todo el terminal axónico. Apague la luz de campo claro y exponga brevemente el terminal al láser de 488 nanómetros. Encuentre el plano focal adecuado para la imagen TIRF.A continuación, acceda a la célula utilizando el comando de choque del amplificador mientras aplica una presión ligeramente negativa a la pipeta; corrija la capacitancia celular y la resistencia en serie. Luego, aplique el protocolo de voltaje mientras realiza imágenes del movimiento de las vesículas sinápticas. Espere al menos 40 segundos entre cada ensayo para permitir la recuperación.Primero, seleccionamos una célula bipolar en microscopía de campo claro. Luego, aumentamos el zoom y cargamos su terminal axónico con el colorante fluorescente. Tras un lavado de 30 minutos, el terminal cargado puede ser observado mediante microscopía junto con el movimiento de vesículas glutamatérgicas fluorescentes.Aquí introducimos un péptido que se une al ojo de riñón mediante la pipeta de registro, lo que nos permite observar la posición de las cintas sinápticas cuando se imagina con un láser de 561 nanómetros. Luego despolarizamos las células e imaginamos el movimiento de las vesículas con el láser de 488 nanómetros. Acabamos de mostrar cómo disociar placas y cargar células bipolares retinianas con un colorante fluorescente, así como realizar parche, fijar estos neuronas e imaginarlos simultáneamente mediante microscopía TURF.Al realizar este procedimiento, es importante no exponer demasiado las células al láser. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

A continuación se describe un protocolo para la preparación de agar-incrustados trozos de retina que son adecuados para la electrofisiología y la Ca2 + imágenes. Este método permite estudiar la cinta del tipo de sinapsis en la retina utilizando microcircuitos directa patch-clamp grabaciones de una sola terminales nerviosas presinápticas.

Patch-clamp mediciones de capacitancia y Ca 2 + Imágenes en las terminaciones nerviosas individuales en rebanadas de retina

La compartimentación de las proteínas, ya sea dentro de la membrana plasmática o en lugares intracelulares es un mecanismo de regulación que pueden influir mucho en los resultados de señalización, por lo que, para comprender la señalización es importante estudiar el comportamiento espacial y temporal de las proteínas implicadas. Se describe aquí un sistema de microscopía TIRF base para estudiar la transducción de señal en las células T, pero es ampliamente aplicable.

Una técnica de microscopía TIRF en tiempo real, imágenes simultáneas de la TCR y sus proteínas asociadas de señalización

Fuente: Daniele, F., et. al TIRFM y sondas GFP sensibles al pH para evaluar la dinámica de las vesículas de neurotransmisores en células de neuroblastoma SH-SY5Y: imágenes celulares y análisis de datos. J. vis. exp. (2015). Este video muestra la obtención de imágenes de células de neuroblastoma humano utilizando un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) para visualizar vesículas sinápticas marcadas con fluoróforos. Las células se enfocan primero en modo de...

Obtención de imágenes celulares mediante microscopía de fluorescencia de reflexión interna total

Fuente: Winkle, C. C., et al. Utilización de metodologías combinadas para definir el papel de la administración de membrana plasmática durante la ramificación de axones y la morfogénesis neuronal. J. Vis. Exp. (2016)Este video demuestra la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) para visualizar eventos exocíticos en neuronas corticales. Un marcador de proteína fluorescente verde (GFP) sensible al pH emite fluorescencia tras la fusión de vesículas, con excitación selectiva...

Microscopía de fluorescencia de reflexión interna total para la visualización de eventos exocíticos 

Basado en polarización reflexión interna total microscopía de fluorescencia (pTIRFM) permite la detección en tiempo real de la dinámica de la membrana celular. En este artículo se describe la implementación del pTIRFM para el estudio de la remodelación de la membrana durante la exocitosis regulada. La técnica es generalizable a otros procesos en biología celular que directa o indirectamente implican cambios en la forma de la membrana.

Imaging membrana plasmática Deformaciones Con pTIRFM

Endocitosis mediada por clatrina, un proceso rápido y altamente dinámico internaliza muchas proteínas, incluidos los receptores de señalización. El protocolo descrito aquí visualiza directamente la cinética de los eventos endocíticos individuales. Esto es esencial para comprender cómo los miembros centrales de la maquinaria endocítica se coordinan entre sí y cómo la carga de proteínas influye en este proceso.

Visualización de endocitosis mediada por clatrina de G receptores acoplados a proteínas en la Resolución Individual de eventos a través de TIRF de Microscopía

Este artículo proporciona un método para investigar la dinámica de las vesículas de neurotransmisores en células de neuroblastoma, utilizando una construcción de sinaptobrevina2-pHluorin y Microscopía de Fluorescencia de Reflexión Interna Total. También se reporta la estrategia desarrollada para el procesamiento de imágenes y análisis de datos.

TIRFM y GFP-sondas sensibles al pH para Evaluar neurotransmisor Vesícula Dinámica en células SH-SY5Y neuroblastoma: imágenes de células y análisis de datos

Aquí detallamos un método para obtener imágenes de células vivas de exocitosis regulada. Este método utiliza FITC-los dextranos, que se acumulan en orgánulos relacionados con los lisosomas, como reportero. Este sencillo método permite también distinguir entre los diferentes modos de exocitosis regulada en las células que son difíciles de manipular genéticamente.

Proyección de imagen de FITC-dextrano como reportero para exocitosis regulada

La imagen in vivo es una herramienta poderosa para el estudio de la biología en la salud y la enfermedad. Este protocolo describe imágenes transpupilares de la retina del ratón con un microscopio estándar de dos fotones. También demuestra diferentes métodos de imagen in vivo para etiquetar fluorescentemente múltiples cohortes celulares de la retina.

Imágenes transpupilares de dos fotones in vivo de la retina del ratón

Este trabajo presenta una preparación alternativa de retina de montaje plano en la que la eliminación de los cuerpos de las células fotorreceptoras permite una difusión más rápida de los anticuerpos y un mejor acceso de la pipeta de parche a las neuronas internas de la retina para experimentos de inmunohistoquímica, hibridación in situ y electrofisiología.

Retina dividida como una preparación mejorada de montaje plano para estudiar las neuronas de la capa nuclear interna en la retina de vertebrados

Este artículo demuestra un método para visualizar y cuantificar la motilidad y el contacto de la microglía con puntos postsinápticos en la retina mediante microscopía confocal de disco giratorio.

Imágenes en vivo y caracterización de la dinámica de la microglía e interacciones con sinapsis en retina murina enferma

Aprende a visualizar la exocitosis de vesículas sinápticas en células bipolares de retina de pez dorado mediante microscopía TIRF. Este método permite estudiar los mecanismos de liberación de neurotransmisores en tiempo real.

Imágenes de exocitosis en las células bipolares de retina con microscopía TIRF

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