Name: Imágenes de células vivas de la F-actina Dynamics a través de Microscopía Fluorescente Speckle (FSM) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-05T19:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 16 s
Description: Aprende a realizar microinyección de actina marcada en células vivas para estudiar la dinámica del citoesqueleto mediante microscopía de motas fluorescentes. Este método permite obtener mediciones cuantitativas de velocidad y cinética de renovación proteica en tiempo real.

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El desarrollo de qFSM es financiado por el NIH subvención GM06230 U01.

Sección 1: La obtención de la etiqueta fluorescente para actina FSM Materiales necesarios: purificada actina, fluoróforo (Alexa, X-rodamina recomendado). G-buffer, ultracentrífuga <ol><li> Un componente clave para la adquisición de buenas películas FSM exige el correcto etiquetado de actina (u otras proteínas del citoesqueleto), con el fluoróforo de su elección. Se recomienda el uso de fluoróforos Alexa (488, 568 longitudes de onda) y X-rodamina derivados de éster de succinimidilo que se dirigen a los residuos de lisina expuestos en la superficie de la actina. </li><li> Al elegir su fluoróforo y su longitud de onda apropiada, asegúrese de que la configuración de su microscopio tiene los filtros adecuados (excitación y de emisión) e iluminadores (arco de mercurio de la lámpara y / o láser) para dar cabida a la etiqueta fluorescente. Se recomienda seleccionar las longitudes de onda de la naranja para longitudes de onda roja (560-630 nm) para minimizar los efectos de la auto-fluorescencia y foto-daño y para garantizar su compatibilidad con las buenas prácticas agrarias-conjugados. </li><li> Actina pura se puede extraer de los tejidos musculares que pertenecen a la rata o el pollo, pero requiere de un procedimiento de extracción de polvo larga del músculo acetona. Polvo de acetona muscular puede ser adquirido de Invitrogen. El procedimiento de etiquetado no se discute en este protocolo, pero se puede encontrar aquí [1] </li><li> Alternativamente, usted puede comprar etiquetados proteínas actina del citoesqueleto incluyendo varios proveedores Inc., e Invitrogen. Los servicios personalizados de etiquetado también están disponibles a través de Invitrogen. Purificada, no etiquetados actina (actina músculo y no musculares) se pueden adquirir en Citoesqueleto Inc. </li><li> Ya sea que decida comprar o preparar su propia etiqueta de actina, que quieren asegurarse de que la relación entre el etiquetado es de alrededor de 0,3 a 0,7 colorantes por monómero de actina. Demasiado alto ratio de etiquetado puede afectar la cinética de rotación (y la unión a proteínas asociadas) de los filamentos de actina, mientras que una proporción muy baja de etiquetado dará lugar a los pobres que buscan manchas (baja señal a ruido) y puede causar problemas de microinyección (ver más abajo). Este es un factor crítico para conseguir un buen speckle imágenes. </li><li> Antes de su almacenamiento a largo plazo, la solución de actina etiqueta debe ser aclarada por girar a 75.000 - 80.000 g durante 20 minutos a 4 grados centígrados. Actina etiquetados deben ser almacenados en una solución de G-buffer y se mantiene -80 grados Celsius. Preparar alícuotas de 2 uL es muy recomendable para reducir los efectos perjudiciales de los ciclos de congelación-descongelación (conduce a agregados insolubles). Abstenerse de exponer la solución de actina etiquetados a la luz directa (se photobleaching de fluoróforos). Recomendamos el uso de tubos de microcentrífuga opaco para el almacenamiento a largo plazo. </li></ol> Sección 2: Preparación de las células y la microinyección de actina etiquetados Materiales necesarios: agujas de microinyección, microjeringa, microloaders, los medios de comunicación precalentado celular, buffer de inyección, un cubo de hielo, un microscopio (anillo de fase, el objetivo de contraste de fase 40x, transjector, extractor de aguja, micromanipulador) <ol><li> Muchos tipos de células son susceptibles de FSM, pero conseguir un buen speckle imágenes está directamente relacionada con el éxito del procedimiento de microinyección. Al seleccionar las células de Estados Federados de Micronesia, las células deben ser grandes (&gt; 50 um de diámetro), se extendió cuando se siembran y se adhiere a sustratos naturales (de plástico o cajas de cultivo de tejidos). También ayuda si el citosol de la célula ocupa un área mayor que su núcleo. Los criterios antes mencionados asegurar que las células son susceptibles a la microinyección. El éxito de las líneas celulares candidatos incluyen (pero no limitados a) PtK1 [2,3], las células tritón de pulmón [4], y las neuronas Aplysia [3]. </li><li> Las células deben ser chapada en cubreobjetos de vidrio cuadrados (22 x 22 mm;. No 1-1/2) que han sido lavados con ácido. Recubrimiento del sustrato norma se puede aplicar a la cubreobjetos y no afectará a la microinyección. </li><li> La correcta selección de las agujas de microinyección depende del tamaño de la abertura de la punta. Por lo general, los tamaños de agujero puede muy en tamaño de 0,5 um a tan grande como 3 um. Sin embargo, se recomienda que la inyección de actina requiere un tamaño de abertura óptimo entre 0,5 y 1 um. Si los problemas de obstrucción se encuentran constantemente, mayor tamaño de los agujeros con capacidad para el suministro de monómero no deseados, así como los filamentos de actina polimerizada. Agujas de microinyección se pueden comprar a través de varios proveedores, incluidos los sistemas Eppendorf que hacen que las agujas Femtotip microinyección. Alternativamente, si un extractor de aguja comercial está disponible, los tubos de cristal de microinyección se puede comprar a partir de Sutter, y sacó a la especificación. Para los principiantes, se recomienda tener 10 a 20 agujas se puso la mano antes de iniciar el procedimiento de inyección. </li><li> &#39;Concentración de inyección&#39; Ideal (concentración final de actina cargado en la aguja) de la actina es de entre 0,5 a 1,0 ug / ul sobre la base de una relación de etiquetado del 40% de medio de contraste para monómeros de actina. Menor proporción de etiquetado de la actina puede ser compensada mediante la inyección en concentraciones más altas (3.1 ug / ul). Sin embargo, la frecuencia de la obstrucción de la agujaser mayor. Esto puede reducirse en parte mediante el uso de agujas con grandes aberturas. Concentración de la actina puede ser diluido mediante la adición de tampón helado de la inyección. Helada ddH2O también puede ser utilizado para diluir para inyección rápida. En este punto, todas las soluciones de trabajo deben mantenerse en hielo. </li><li> De carga desde 0,5 hasta 1,0 l de la solución de actina con una microjeringa (de vía estrecha - Hamilton), o, alternativamente, mediante el uso de una punta de pipeta microloader. </li><li> Cuidadosamente dispensar la solución de actina, con cuidado la liberación de la solución. Las burbujas se debe evitar, pero se puede quitar fácilmente por ocupar el exceso de líquido que rodea la burbuja. </li><li> Asegúrese de que la solución de actina se apoya completamente en la punta de la aguja. El exceso de solución en cualquier lugar a lo largo de los capilares de la aguja puede interrumpir el flujo de inyección. </li><li> Ahora, con cuidado ponga la aguja, evitando el contacto con la punta de la aguja, al titular de la inyección. Coloque el soporte de forma que la aguja que hace un ángulo de 35 a 50 a la base de la platina del microscopio. Ángulos más bajos son los preferidos. </li><li> Baje la punta de la aguja hasta que apenas rompe la superficie de los medios de comunicación de baño de las células. </li><li> Ahora la posición de la punta de la aguja (sin bajar) para que se apoye directamente sobre el centro del objetivo. Si la punta de la aguja se alinea con el objetivo, debería ver un halo brillante a través del ocular. Este es el final de la punta de la aguja. Que se mueve lentamente al lado a lado la aguja (usando el manipulador) puede ayudar a localizar mejor el halo. </li><li> Ajuste el z-se centran en el microscopio hasta que sus células están a la vista. Ahora, baje lentamente la punta hasta que el halo se contrae gradualmente hasta que finalmente convergen en la punta de la aguja - se necesita para controlar el foco (z-posición) al mismo tiempo. Una característica adicional que buscar es el eje de la aguja, que proyectará sombras lineales. La reducción de la aguja poco a poco definir el eje de la aguja. Cuando se hace correctamente el extremo de la aguja y las células deben ser ambos a la vista. Ligero ajuste del anillo de fase puede ser necesaria para mejorar el contraste. </li><li> Al navegar, asegurar la punta de la aguja es muy superior a las células para evitar que se rompa la punta de la aguja. </li><li> Al seleccionar las células que se inyectan, las células con bordes libres debe estar mirando hacia la punta de la aguja. Esto asegurará que la disminución de la pendiente de la célula (del punto más grueso, donde reside el núcleo, la parte más delgada del borde de ataque) se reunirá con la punta de la aguja, en lugar de correr paralela a ella. </li><li> La presión de la aguja debe ser fijado en 0,3 a 0,8 psi. La constante presión aplicada se traducirá en un flujo constante de la solución de actina. </li><li> Después de decidir sobre una célula de inyectar, la posición de la aguja de modo que la punta está al lado del núcleo (región perinuclear, la parte más gruesa de la célula donde el núcleo no se encuentra justo debajo). </li><li> Baje lentamente, y reajustar la posición de la aguja hasta que la punta es deprimente de la membrana, ahora progresivamente menor hasta que la punta de la aguja ha perforado la membrana. Si la aguja ha traspasado completamente la membrana, la célula será más brillante, tan pronto como usted ve esta diferencia levantar la aguja hasta que ya no es tocar la célula. La perforación actual y el proceso de inyección se llevará 0,5 a 2 segundos. </li><li> Cuando se hace correctamente, la forma de la célula aparece sin cambios, mientras que la inyección demasiado dará lugar a la retracción rápida del borde de la celda y en algunos casos, usted verá realmente la célula explotar. </li><li> Si usted no ve cambios en la célula cuando la microinyección (no más brillante), la punta de la aguja puede ser cerrado. Usted puede probar esto presionando la &quot;limpia&quot; botón si está disponible en transjector. Si está abierto, esto aumentará significativamente el flujo de la presión constante que se puede ver a través de los oculares - que aparecerá como olas y los escombros cerca se puede ver la dispersión. </li><li> Si la punta de la aguja está cerrada, puede optar por insertar una aguja de microinyección nuevo o intentar romper la punta de la aguja con cuidado bajar la aguja hasta la punta de la aguja presiona contra el portaobjetos de vidrio, lo que provoca el final de la punta de romper. La zona de rotura no debe ser más que un ª 1 / 5 de la zona de la punta de la aguja (la parte de la aguja que comienza a converger a un punto). </li><li> Continuar con la inyección, el gasto de no más de 20 - 45 minutos para cada sesión de microinyección (dependerá del tipo de célula). Como regla general, se recomiendan sesiones más cortas para minimizar el estrés en las células. </li><li> Después de terminar la microinyección, cambiar los medios de comunicación celular en el plato mediante la adición de nuevos medios de comunicación precalentado. A continuación, permiten a las células para recuperarse durante 30 minutos en una incubadora antes de exponer. Esto también permitirá a los filamentos de actina a integrarse en la red del citoesqueleto existentes. </li></ol> Sección 3: Montaje de la Cámara de imágenes Materiales necesarios: Cinta de cubre objetos, de doble cara, q-tips, pinzas, valap, kim limpiar, oxyrase, los medios de comunicación de imagen, hoja de afeitar, p200 piPette, etanol puro <ol><li> Empiece por precalentar los medios de comunicación de imagen y descongelar una alícuota de 15 uL de Oxyrase. Asegúrese de proteger la oxyrase fotosensibles de la luz. La adición de oxyrase reducirá en gran medida los efectos de photobleaching. </li><li> Precalentar el valap, mediante el establecimiento de la temperatura de la placa caliente a baja. No sobrecalentar / quemar la valap de que perderá su eficacia como un sellador. </li><li> Limpie un cubreobjetos con un Kimwipe rociado con etanol puro para limpiar y eliminar los desechos pequeños. </li><li> Pila de dos longitudes de igual tamaño (2,5 cm de largo) de cinta de doble cara en la parte superior de cada uno, con una superficie plana y limpia como una plataforma. Pulse cualquier burbuja de aire atrapada para crear un plano completamente plana. </li><li> Usando una hoja de afeitar, cortar dos tiras de recta a lo largo del eje longitudinal, de manera que cada tira mide 0,5 cm de ancho. </li><li> Con unas pinzas, coloque cada tira contra el borde largo de su cubreobjetos de modo que las dos tiras de cinta crea un vacío en el centro de su cubre objetos. Presione suavemente en la cinta para sellar bien con el vidrio. Las tiras de cinta actúan como espaciadores entre el cubre objetos y cubreobjetos los. </li><li> Asegúrese de que el valap esté completamente licuado antes de comenzar el siguiente paso. </li><li> Recuperar sus medios de comunicación imágenes de precalentado, añadiendo 15 ul de oxyrase de cada 500 uL de los medios de comunicación. </li><li> Kimwipes veces en forma de triángulos para crear tres bordes duros. Esto será utilizado para crear una superficie seca de la cinta para pegar en. </li><li> Recuperar las células de la incubadora. Con unas pinzas, agarre una esquina del cubreobjetos. Rápidamente coloque el cubreobjetos en una Kimwipe (lado célula es hacia arriba, sin tocar el tejido), y el uso de la Kimwipe doblado para limpiar dos lados opuestos del cubreobjetos para crear una superficie semi-seca (en la superficie, donde su descanso las células). </li><li> Con unas pinzas, agarre una esquina del cubreobjetos y se coloca sobre el cubreobjetos de modo que las superficies secas están alineados con las dos tiras de cinta. Observe que ahora tiene dos lados cerrados y dos ranuras abiertas. Poco a poco pipeta 200 uL de la solución de imagen, los medios de comunicación oxyrase cerca de una abertura. Es importante destacar que no queden burbujas de aire debe ser introducido. La solución debe ser aspirado en la cámara de nuevo reunidos por las fuerzas de capilaridad, sumergiendo sus células en una solución. </li><li> Usando un toque Q-tip las cuatro esquinas de su cubreobjetos con valap fundido para fijar y estabilizar rápidamente el portaobjetos. Se dará cuenta de que se seque el valap instante (en cuestión de segundos a temperatura ambiente). </li><li> Ahora comienzo con los lados abiertos (sin cinta lateral), había una delgada franja de valap usando un Q-tip y simula un accidente cerebrovascular el cepillado. Repita para el lado cerrado. Poco a poco construir el escudo de valap, reforzando así el sello mediante la repetición de las etapas de recubrimiento. El valap debe limitarse a los bordes, dejando el centro del cubreobjetos claro. </li><li> Limpie suavemente la parte central del cubreobjetos con un Q-tip con ddH2O de extraer cualquier soporte residual, siendo consciente de no aplastar las células. Repita el paso de limpieza con etanol puro. </li><li> Ahora tendrá una cámara de imágenes completamente cerrado optimizado para speckle imágenes. Tener una caja completamente sellada para evitar que su fluoróforos de forma rápida photobleaching. </li></ol> Sección 4: las células de imagen Materiales necesarios: microscopio invertido de campo amplio, lámpara mecury, los filtros adecuados, enfriado cámara CCD con 6,7 micron píxeles, apertura numérica, de inmersión en aceite los objetivos del plan-Apocromático (60X a 100X, fase o CID). Vibraciones mesa. Software de imágenes. <ol><li> Precaliente la platina del microscopio a 37 grados. Coloque la cámara de imágenes recién terminado, y esperar 10-15 minutos para que la temperatura se estabilice antes de exponer. </li><li> Empezar por centrarse en las células de campo brillante, y luego encontrar las células inyectadas por alternar la configuración correcta de fluorescencia. Trate de minimizar el tiempo de exposición de fluorescencia para reducir photobleaching. </li><li> Verificar si hay células que se han inyectado saludable bordes de ataque curvado. Más de inyección de las células (despiece) se caracteriza por los bordes dentados y se retractó, asemejándose a numerosos filopodios - evitar la imagen de estas células. </li><li> Ajustes de adquisición dependerá del tipo de célula, la calidad de la actina etiquetados, y los componentes del microscopio. Sin embargo, los ajustes de exposición no debe ser mayor de 2 segundos, y el intervalo de tiempo entre los fotogramas se debe establecer entre 5 y 10 segundos. Tiempo típico de una serie de tiempo (por celda imágenes) puede variar entre 10 a 30 minutos, y está limitado por los efectos de photobleaching. Ajustes de ganancia de la cámara se puede girar hacia arriba para aumentar la relación señal-ruido. </li><li> Ideal speckle características debe tener cada uno de manchas separadas por ~ 2 speckle diámetros para los próximos vecinos de manchas. Esto garantiza óptima de muestreo espacial y temporal de la estructura de la actina. Para las células epiteliales, la red de actina moteada aparece homogéneo, con puntos uniformemente separados. Las líneas celulares que contienen fibras de densidad estrés o lamellipodiase distinguen, sino que tendrá un aspecto de puntos / moteado. Ajustes de la exposición se debe ajustar para obtener las mejores imágenes moteado. </li><li> El exceso de microinyección de células tendrán manchas densas que no parecen ser discretos. Fibras de estrés y lamellipodia la perderá su aspecto de puntos. </li><li> Menores de microinyección de células aparecerá muy oscura a través del ocular, que contiene manchas que están muy alejados (&gt; 10 motas de separación) y que aparecen dispersos al azar. Fibras de estrés y lamellipodia en estas células se distinguen. </li><li> Clave para obtener &quot;buenas&quot; películas speckle es mantener la atención. Esto es particularmente importante para los análisis posteriores de la participación de manchas de flujo y las mediciones de volumen de negocio. Por lo tanto la calidad del análisis cuantitativo dependerá de bloqueo en el centro de la duración del lapso de tiempo. Esto puede ser especialmente difícil si el plano de la imagen es muy delgada. Otros factores que dependen de la estabilidad del sistema de microscopio, en particular la vivienda escenario y la cámara de imágenes. Basado en el contraste de enfoque se puede utilizar si las longitudes de la imagen de intervalo son suficientes para dar cabida a esta función. Otras opciones incluyen la compra de un infrarrojo cercano sistema basado enfoque que proporciona fiable en tiempo real los ajustes de enfoque. Usted puede encontrar estas ofertas de Nikon, Olympus y ASI. </li></ol> Sección 5: Análisis qFSM Esta sección no se discute en detalle, pero la información sobre el software de análisis se puede encontrar aquí [5]. Peticiones de descarga de software se pueden realizar en nuestro sitio web (lccb.scripps.edu). Temas tratados: <ul><li> El ruido de calibración </li><li> Moteado de detección </li><li> El seguimiento mediante una aproximación mixta de la imagen basada en la correlación de seguimiento del movimiento grueso de las áreas de manchas y el seguimiento de una sola partícula del movimiento detallado de manchas individuales. </li><li> Cálculo de la asamblea de polímero y las tasas de desmontaje de las fluctuaciones de intensidad durante la aparición de manchas y eventos desaparición. </li></ul>

<ol><li>Waterman-Storer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+speckle+microscopy+%28FSM%29+of+microtubules+and+actin+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent speckle microscopy (FSM) of microtubules and actin in living cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4, Unit 4.10-Unit 4.10 (2002).</li>
<li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+actin+networks+drive+the+protrusion+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells.</a> Science. 305, 1782-1786 (2004).</li>
<li>Zhang, X. F., Schaefer, A. W., Burnette, D. T., Schoonderwoert, V. T., Forscher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-dependent+contractile+responses+in+the+neuronal+growth+cone+are+independent+of+classical+peripheral+retrograde+actin+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rho-dependent contractile responses in the neuronal growth cone are independent of classical peripheral retrograde actin flow.</a> Neuron. 40, 931-944 (2003).</li>
<li>Salmon, W. C., Adams, M. C., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-wavelength+fluorescent+speckle+microscopy+reveals+coupling+of+microtubule+and+actin+movements+in+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-wavelength fluorescent speckle microscopy reveals coupling of microtubule and actin movements in migrating cells.</a> J Cell Biol. 158, 31-37 (2002).</li>
<li>Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeleton+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 361-387 (2006).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Varios factores clave son cruciales para el éxito de la obtención de imágenes de manchas, manchas por bueno comenzar y terminar con la calidad de la actina marcados con fluorescencia. Una proporción alta de etiquetado de tinte a la actina monómero, en torno a 0,4 a 0,7 se asegurará de que van a aparecer manchas brillantes y discreto, mientras que la proteína marcada en sí debe ser soluble y libre de los agregados. Igualmente importante es el procedimiento de microinyección. Para asegurar la homeostasis celular normal (y...

Inyección de tampón (IB) 50 mM de glutamato de potasio 0,5 M MgCl2 (Anexo 2a) Almacenar hasta 2 años a -20 ° C &nbsp; G-buffer 2 mM Tris ⋅ Cl, pH 8.0 (Anexo 2a) 0.2 mM CaCl2 (Anexo 2a) Añadir justo antes del uso: 0,2 mM ATP (ver receta a 100 mM) 0,5 mM 2-mercaptoetanol Almacenar hasta 1 día a 4 ° C

imágenes de células vivas de la f-actina dynamics a través de microscopía fluorescente speckle (fsm)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

En este protocolo se describe el uso de fluorescentes Speckle Microscopía (FSM) para capturar imágenes de alta resolución de la dinámica de actina en las células PtK1. Una ventaja única del FSM es su capacidad para captar el movimiento y la cinética de rotación (armado / desarmado) de la red de F-actina en las células vivas. Esta técnica es particularmente útil en la obtención de mediciones cuantitativas de la dinámica de actina F-cuando se combina con el software de visión por computador (qFSM). Se describe la selección, la microinyección y la visualización de las sondas fluorescentes de actina en las células vivas. Es importante destacar que procedimientos similares se aplican a la visualización de las otras asambleas macomolecular. FSM ha sido demostrada para los microtúbulos, filamentos intermedios y los complejos de adhesión.

Selección, la microinyección, y las imágenes de fluorescencia marcado con F-actina a través de microscopía de fluorescencia moteado (FSM).

Imágenes de células vivas de la F-actina Dynamics a través de Microscopía Fluorescente Speckle (FSM)

En este protocolo describimos el uso de la microscopía de moteado fluorescente (FSM, por sus siglas en inglés) para capturar imágenes de alta resolución de la dinámica de la actina en células PtK1. Un aspecto único...

La microscopía de manchas fluorescentes se utiliza para investigar la dinámica de diversas proteínas del citoesqueleto en células vivas. Cuando se utiliza correctamente, es posible realizar mediciones cuantitativas de la velocidad y la cinética de renovación de las proteínas del citoesqueleto. Comenzamos este procedimiento mediante la microinyección de un pequeño volumen de actina marcada con fluorescencia en células vivas.Luego ensamblamos la cámara de imagen para reducir los efectos del fotoblanqueamiento. Primero, se colocan dos trozos de cinta adhesiva doble cara a ambos lados del portaobjetos donde reposará la cubreobjetos con las células. Luego, el medio de imagen se pipetea dentro de la cámara dispensando el medio cerca de una de las ranuras abiertas.Por último, los cuatro lados se sellan con valet. Hola, mi nombre es James Lim y del laboratorio de Galden's Deucer del Departamento de Biología Celular del Instituto de Investigación Scripps. Hoy les mostraremos un procedimiento sobre microscopía de manchas fluorescentes.Utilizamos este procedimiento para investigar la dinámica de la actina en células epiteliales migratorias. Comencemos. Un componente clave para obtener buenas películas de microscopía de manchas fluorescentes es la marcación adecuada de la actina. Con el fluoróforo de su elección, recomendamos usar fluoróforos de Alexa y X rodina cin, derivados de ésteres medios que se dirigen a los residuos de lisina expuestos en la superficie de la actina.Es importante que la relación de marcado sea alta, alrededor de 0,3 a 0,7 colorantes por monómero de actina, para asegurar que las manchas aparezcan brillantes y definidas antes del almacenamiento prolongado. Clarifique la solución de actina marcada mediante centrifugación a 75.000-80.000 ×g durante 20 minutos a cuatro grados Celsius. La actina marcada debe almacenarse en solución tampón G a menos 80 grados Celsius.Prepare alícuotas de dos microlitros para evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación, lo que puede provocar la formación de agregados insolubles. Para evitar el blanqueo por luz de los florales cuatro, no exponga la solución de actina marcada a la luz directa durante períodos prolongados y utilice tubos opacos de microcentrífuga para el almacenamiento a largo plazo. Las células para microinyección sobre cubreobjetos cuadrados de vidrio lavados con ácido.Se puede aplicar un recubrimiento estándar de sustrato sobre el cubreobjetos sin que afecte la microinyección. Almacene las células a 37 grados mientras se prepara la actina, con el fin de seleccionar células adecuadas para la microinyección. Para la FSM, considere estos criterios.Las células deben ser grandes, con un diámetro mayor a 50 micrómetros, deben aplanarse al ser sembradas y adherirse naturalmente a los sustratos. También es útil que el sitio aislado de la célula ocupe un área mayor que la de su núcleo. Algunas líneas celulares adecuadas incluyen PTK one, células de pulmón de tritón y neuronas AIA.En esta demostración, inyectaremos células epiteliales PTK. La selección correcta de las agujas de microinyección depende del tamaño de la abertura de la punta. Por lo general, los tamaños de orificio pueden variar desde 0,5 micrómetros hasta tres micrómetros.Recomendamos un tamaño de apertura óptimo entre 0,5 y un micrómetro. Para la inyección de Acton, las micropipetas pueden comprarse o fabricarse. Si se dispone de un micropipeteador comercial, recomendamos tener entre 10 y 20 micropipetas preparadas antes de comenzar el procedimiento de inyección.El siguiente paso consiste en diluir la actonina marcada con tampón de inyección frío con hielo. Mantenga todas las soluciones de trabajo sobre hielo. La concentración ideal para la inyección, que es la concentración final de actonina cargada en la aguja, está entre 0,5 y 1 microgramo por microlitro.Basándose en una proporción de marcado del 40% de D respecto a la carga de monómero de actina, cargue de 0,5 a un microlitro de la solución diluida de actina. Utilizando una aguja de jeringa micrométrica, distribuya cuidadosamente la solución de actina. Intente evitar las burbujas.Si hay burbujas, se pueden eliminar fácilmente aspirando los líquidos excesivos que rodean la burbuja. Asegúrese de que la solución Acton esté completamente asentada en la punta de la aguja. No debe haber solución en exceso en ninguna parte del capilar de la aguja, ya que podría interrumpir el flujo de inyección.La aguja cargada ya está lista para ser fijada al portaagujas para la microinyección. Retire sus células del incubador y coloque el cubreobjetos sobre la platina del microscopio. Para comenzar el procedimiento de microinyección, lleve la aguja cargada al microscopio.Coloque cuidadosamente la aguja evitando el contacto con la punta de la aguja en el soporte del inyector. Posicione el soporte de manera que la aguja forme un ángulo de 35 a 50 grados con respecto a la base de la platina del microscopio. Baje la punta de la aguja hasta que apenas rompa la superficie del medio de baño.Ahora coloque las células de modo que la punta de la aguja quede directamente encima del centro del objetivo. Si la punta de la aguja está alineada con el objetivo, debería ver un halo brillante a través del ocular. Esta es la punta final de la aguja.Mover lentamente la aguja de un lado a otro puede ayudar a localizar mejor el halo. Al manipular, asegúrese de que la punta de la aguja esté bien por encima de sus células. Para evitar romper la punta de la aguja, ajuste el enfoque Z. del microscopio hasta que sus células estén claramente visibles.Luego, baje lentamente la punta de la aguja mientras controla el enfoque hasta que el halo se contraiga gradualmente y finalmente converja en la punta de la aguja. También puede observar el vástago de la aguja, que proyectará sombras lineales. Al bajar la aguja, el vástago se definirá progresivamente.Puede ser necesario realizar ajustes leves del anillo de fase para mejorar el contraste; tanto la punta de la aguja como sus células deben estar ahora claramente visibles. Al seleccionar las células para la inyección, las células con bordes libres deben orientarse hacia la punta de la aguja. Esto garantizará que la pendiente descendente de la célula, desde el punto más grueso donde se encuentra el núcleo hasta el punto más delgado del borde delantero, encuentre la punta de la aguja en lugar de correr paralela a ella.Establezca la presión de la aguja entre 0,3 y 0,8 PSI. La presión constante aplicada provocará un flujo continuo de la solución de actina. Cuando haya seleccionado una célula para inyectar, coloque la aguja de modo que la punta quede junto al núcleo de la célula; bájela lentamente y reajuste la posición de la aguja hasta que la punta se hunda ligeramente.La membrana baja gradualmente la aguja hasta que su punta haya atravesado la membrana. Si la aguja ha atravesado completamente la membrana, la célula parecerá más brillante. Tan pronto como observe este cambio, eleve la aguja hasta que ya no esté tocando la célula.El proceso real de perforación e inyección tomará de 0,5 a dos segundos. Cuando se realiza correctamente, la forma de la célula parecerá inalterada. Para minimizar el estrés en las células, no dedique más de 20 a 45 minutos a cada sesión de microinyección.A veces puede que no observe cambios en la célula al inyectar y la célula no se vuelve más brillante. Esto indica que la punta de la aguja podría estar obstruida. Puede comprobarlo pulsando el botón de limpieza, si está disponible en su inyector de trans.Si la punta de la aguja está abierta, esto aumentará significativamente el flujo de presión constante, lo cual puede observarse como ondulaciones y dispersión de los restos cercanos. Si la punta de la aguja está cerrada, puede insertar una nueva aguja de microinyección o intentar romper la punta de la aguja bajándola suavemente hasta que esta presione contra la laminilla de vidrio, haciendo que el extremo más fino de la punta se rompa.El área de rotura no debe superar un quinto del área del extremo de la aguja, es decir, la porción de la aguja que comienza a converger hacia un punto cuando finaliza la microinyección. Cambie el medio celular del recipiente por medio fresco precalentado para eliminar cualquier residuo fluorescente. Tras cambiar el medio, deje que las células se recuperen durante 30 minutos en un incubador a 37 grados antes de la adquisición de imágenes.Esto también permitirá que la actina se integre a la red existente del citoesqueleto mientras las células se recuperan en el incubador; comience a armar la cámara de imagen. Primero, precaliente el medio de imagen en un baño de agua a 37 grados. A continuación, descongele un alícuota de 15 microlitros de oxa erase a temperatura ambiente.La adición de RA al medio más adelante reducirá en gran medida los efectos del fotoblanqueo. Mantener el borrador de oxa envuelto en papel de aluminio garantizará que el compuesto fotosensible esté protegido de la luz. Precaliente el sellador VAP en una placa calefactora ajustada a una temperatura baja; no sobrecaliente ni queme el VAP, ya que perdería su eficacia como sellador.Limpie un portaobjetos microscópico con una toallita Kim empapada en etanol puro para limpiarlo y eliminar pequeños residuos. Apile dos trozos de cinta adhesiva de doble cara de igual tamaño, de 2,5 centímetros de largo, uno encima del otro utilizando una superficie plana y limpia, como otro portaobjetos microscópico. Como plataforma, expulse cualquier burbuja de aire atrapada para crear un plano completamente plano.A continuación, utilice una cuchilla de afeitar para cortar dos tiras rectas a lo largo del eje longitudinal de la cinta, de modo que cada tira mida 0,5 centímetros de ancho. Con pinzas, coloque cada tira a lo largo de los bordes largos de su portaobjetos, de forma que las dos tiras de cinta creen una separación en el centro del portaobjetos. Presione suavemente sobre la cinta para lograr un buen sellado con el vidrio.Estas tiras de cinta actuarán como espaciadores entre la microplaca y la cubierta. Verifique la válvula para asegurarse de que se haya licuado completamente. Antes de comenzar el siguiente paso, recupere su medio de imagen precalentado.Añada 15 microlitros de rayos oxígeno a cada 500 microlitros de medio. Doble una toallita química en forma de triángulo para crear tres bordes firmes. Esto se utilizará posteriormente para limpiar la cubierta.Retire las células del incubador utilizando pinzas. Sujete rápidamente una esquina del cubreobjetos. Coloque el cubreobjetos sobre una toalla de papel con el lado de las células hacia arriba y sin tocar el tejido, y utilice la toalla de papel doblada para limpiar dos lados opuestos del cubreobjetos y crear una superficie semiseca.Luego, tome una esquina del cubreobjetos con pinzas y coloque el cubreobjetos sobre la portaobjetos de modo que las superficies secas queden alineadas con las dos tiras de cinta. Observe que ahora tiene dos lados cerrados y dos aberturas. Pipetee lentamente 200 microlitros de su solución de medio de imagenología RA cerca de una de las aberturas.Es importante no introducir burbujas de aire. La solución debe ser absorbida hacia la cámara recién ensamblada por fuerzas capilares, sumergiendo así completamente las células en la solución. Con un bastoncillo de algodón, toque las cuatro esquinas de la cubreobjetos con vap fundido para fijar y estabilizar rápidamente la cubreobjetos.Notará que el VAP se seca en cuestión de segundos a temperatura ambiente. Luego, comenzando por los lados cerrados, coloque una tira delgada de VAP utilizando el hisopo y simulando un movimiento de cepillado. Repita el procedimiento para los lados abiertos.Construya lentamente la capa de VAP, reforzando el sellado mediante la repetición de los pasos de recubrimiento. El VAP debe quedar confinado a los bordes, dejando la parte central del cubreobjetos limpia. Una vez sellados los bordes del cubreobjetos, limpie suavemente la porción central del cubreobjetos utilizando un hisopo con H2O DD para eliminar cualquier medio residual.Tenga cuidado de no aplastar las células. Repita este paso de limpieza con etanol puro. Ahora tiene una cámara de imagen completamente sellada optimizada para la imagen de manchas fluorescentes.Tener un recinto completamente sellado evitará que sus flores se fotodegraden rápidamente. Las células en la cámara completamente cerrada ya están listas para la obtención de imágenes. Utilizamos un microscopio invertido de campo amplio con una lámpara de mercurio, iluminador epifluorescente, filtros adecuados y objetivo plan de inmersión en aceite.Las imágenes obtenidas con objetivos apocromáticos se capturan con una cámara CCD refrigerada con píxeles de 6,7 micrones y un software de adquisición de imágenes. Precaliente la platina del microscopio a 37 grados. Coloque la cámara de imagen y espere entre 10 y 15 minutos para que la temperatura se estabilice antes de realizar la adquisición.Una vez que la temperatura se haya estabilizado, enfoque sus células en campo claro y luego localice sus células inyectadas alternando a la configuración fluorescente adecuada. Intente minimizar el tiempo de exposición a la fluorescencia para reducir el fotoblanqueo. Busque células inyectadas que presenten bordes delanteros sanos y curvos.Las células sobreinyectadas se caracterizarán por bordes retraídos y dentados que se asemejan a numerosos filopodios. No realice imágenes de estas células. La configuración de adquisición dependerá del tipo de célula, de la calidad de la actina marcada y de los componentes del microscopio.Sin embargo, la configuración de exposición no debe ser mayor de dos segundos y el intervalo de tiempo entre cuadros debe establecerse entre cinco y diez segundos. La ganancia de la cámara puede aumentarse para mejorar la relación señal-ruido. Las características ideales del moteado deben presentar cada mote separado aproximadamente por dos diámetros de mote del mote vecino más próximo.Para las células epiteliales, la red de actina moteada parecerá homogénea, con manchas distribuidas uniformemente. Los ajustes de exposición deben modificarse para obtener las mejores imágenes moteadas.La clave para obtener buenas películas de moteado es mantener el enfoque. Esto es particularmente importante para el análisis posterior que involucra mediciones de flujo y renovación del moteado. Por lo tanto, la calidad del análisis cuantitativo dependerá de fijar el enfoque durante toda la duración del lapso de tiempo.Se detallan varias estrategias para mantener el enfoque en el texto; para esta demostración se utilizará el sistema de enfoque perfecto de Nikon. A continuación se presentan varios ejemplos de células microinyectadas. El panel izquierdo muestra una célula submicroinyectada con una imagen de puntos de baja concentración.El panel central muestra una célula sobremicroinyectada con una imagen de moteado de concentración demasiado alta, y el panel derecho muestra una célula inyectada de forma óptima. Para la microscopía de moteado fluorescente con una buena imagen de moteado. Acabamos de mostrarle cómo microinyectar actina marcada con fluorescencia en células epiteliales para la microscopía de moteado fluorescente.Al realizar este procedimiento, es extremadamente importante recordar que la calidad de la actina marcada, así como la técnica de microinyección, determinarán la calidad general de sus imágenes de puntos. Eso es todo y mucha suerte con sus experimentos.

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