Name: La electroporación in vivo en el útero y el ex de la expresión génica en células de ratón ganglionares retinianas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 25 min 6 s
Description: Aprende a manipular la expresión génica en células ganglionares retinianas de ratón mediante electroporación in utero y ex vivo. Estas técnicas permiten estudiar el desarrollo retiniano y las propiedades funcionales de las CGR.

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Agradecemos al Dr. Richard Vallee y Shrestha Brikha para ayudar con el en el útero y técnicas ex vivo la retina de la electroporación, respectivamente, y el Dr. T. Sakurai a los comentarios de este protocolo. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones F31 NS051008 (TJP), la Fondation pour la Recherche Medicale, y el Human Frontier Science Program (AR) y EY12736 R01 (CM).

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Eye+Retina+and+the+Visual+Systems+of+the+Mouse%22">Eye Retina and the Visual Systems of the Mouse</a>. Chalupa, L. M., Williams, R. W. , MIT Press. Cambridge. (2008).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).</li>
<li>Ishikawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+GDNF+gene+transfer+into+axotomized+retinal+ganglion+cells+using+in+vivo+electroporation+with+a+contact+lens-type+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode.</a> Gene Ther. 12, 289-298 (2005).</li>
<li>Donovan, S. L., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+square+wave+electroporation+of+retinal+explant+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures.</a> Nat Protoc. 1, 2710-2718 (2006).</li>
<li>Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+into+mouse+retinal+ganglion+cells+by+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation.</a> BMC Dev Biol. 7, 103-10 (2007).</li>
<li>Petros, T. J., Shrestha, B. R., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+sufficiency+of+EphB1+in+driving+the+ipsilateral+retinal+projection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Specificity and sufficiency of EphB1 in driving the ipsilateral retinal projection.</a> J Neurosci. 29, 3463-3474 (2009).</li>
</ol>

En este video, que han demostrado las técnicas de electroporación, tanto en el útero y ex vivo, para la entrega de genes en embriones murinos CGR. En el útero de la electroporación retina proporciona un mecanismo para la manipulación de la expresión génica en CGR y visualizar sus proyecciones de axones in vivo. Permitiendo que los embriones para sobrevivir después del nacimiento permite el examen de estas buenas prácticas agrarias + proyecciones RGC en su objetivo, el núcleo geniculado lateral (LGN). Ex electroporación in vivo retina proporciona una capacidad de más controlado para las regiones objetivo específico de la retina para su uso con los ensayos in vitro. La combinación in vivo e in vitro en los análisis derivados de estas técnicas permite la caracterización rigurosa del desarrollo RGC axón y las proyecciones en un subconjunto de la CGR en un segundo plano por lo demás normal. Mientras que nuestra manifestación se centra en la RGC para guía de axones en el quiasma óptico, tanto en el útero y ex vivo electroporations retina podría ser beneficioso para el estudio de cómo las perturbaciones en la diferenciación de efecto de la expresión génica RGC, morfología dendrítica, propiedades electrofisiológicas, la formación de sinapsis y la adecuada focalización en las zonas de terminación como el LGN y colliculus superior.

<table><tbody><tr><td>Electroporador cuadrado BTX ECM 830 (con pedal)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>450052</td><td></td></tr><tr><td>Electrodos de pinzas redondas</td><td>Nepa Gene</td><td>CUY650-5 o CUY650-7</td><td></td></tr><tr><td>Suturas de seda</td><td>Henry Schein</td><td>101-2636</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetas de vidrio con émbolos</td><td>Drummond Scientific</td><td>5-000-1001-X10</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-antimicótico</td><td>Invitrogen</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Medio DMEM/F12</td><td>GIBCO, por Life Technologies</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina de suero bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806-5G</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento ITS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-1884</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Metilcelulosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0512</td><td></td></tr><tr><td>Placas con pocillo de fondo de vidrio</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-ornitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr></tbody></table>

la electroporación in vivo en el útero y el ex de la expresión génica en células de ratón ganglionares retinianas

In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells

La retina y su neurona de salida única, la de las células ganglionares retinianas (CGR), constituyen un modelo excelente para estudiar las cuestiones biológicas como la diferenciación celular, para guía de axones, la organización retinotópica y la formación de sinapsis [1]. Un inconveniente es la imposibilidad de manipular de manera eficiente y segura la expresión génica en la CGR en vivo, especialmente en el acceso de otro modo las vías visuales murino. Los ratones transgénicos se puede utilizar para manipular la expresión génica, pero este enfoque es a menudo costoso, consume mucho tiempo, y puede producir efectos secundarios no deseados. En pollo, en la electroporación in ovo se utiliza para manipular la expresión génica en la CGR para el examen de la retina y el desarrollo de RGC. Aunque las técnicas de electroporación similares se han desarrollado en las crías de ratón recién nacido [2], las ratas adultas [3], y la retina embrionaria murino in vitro [4], ninguna de estas estrategias permiten la caracterización completa de desarrollo RGC axón y las proyecciones en vivo. Con este fin, hemos desarrollado dos aplicaciones de electroporación, una en el útero y los otros ex vivo, para actuar específicamente sobre embriones murinos CGR [5, 6]. Con la electroporación en el útero de retina, que puede regular a la baja misexpress o genes específicos en CGR y seguir sus proyecciones axón a través de las vías visuales en vivo, lo que permite el examen de las decisiones de orientación a objetivos intermedios, tales como el quiasma óptico, o en regiones específicas, como la núcleo geniculado lateral. Perturbar la expresión génica en un subconjunto de la CGR en un fondo de tipo salvaje de lo contrario facilita el entendimiento de la función de genes a lo largo de la vía de la retina. Además, hemos desarrollado una técnica de compañía para el análisis de crecimiento de los axones CGR in vitro. Nos electroporar embrionarias cabezas ex vivo, recoger e incubar toda la retina, a continuación, preparar explantes de estos días retinas más tarde. Explantes de retina se pueden utilizar en una variedad de ensayos in vitro con el fin de examinar la respuesta de la electroporación axones de CGR a las señales de orientación u otros factores. En suma, este conjunto de técnicas de mejora nuestra capacidad de misexpress o regular a la baja en los genes CGR y en gran medida debería ayudar a los estudios que examinan el desarrollo y las proyecciones RGC axón.

Aquí se presentan dos técnicas para manipular la expresión génica en las células ganglionares de la retina murina (CGR) por<em&gt; En el útero</em&gt; Y<em&gt; Ex vivo</em&gt; Electroporación. Estas técnicas permiten una para examinar cómo las alteraciones en la expresión de genes afectan el desarrollo del RGC, para guía de axones y las propiedades funcionales.

La electroporación in vivo en el útero y el ex de la expresión génica en células de ratón ganglionares retinianas

La retina y su única neurona de salida, la célula ganglionar retinal (CGR), constituyen un modelo excelente para examinar cuestiones biológicas tales como la célula...

En el útero, la electroforesis retiniana comienza con una incisión abdominal en una hembra anestesiada en estadio E 13.5 a 14.5 para exponer la cadena embrionaria. Se inyecta ADN en una retina por embrión y se realiza la electroforesis en las cabezas, provocando que los precursores de las células ganglionares de la retina (RGC) incorporen el ADN. En el estadio E 18.5, los embriones se perfunden y presentan GFP positivo.Se analizan la retina y las proyecciones visuales para la electro poración retinal ex vivo. Las cabezas de E 13,5 a 14,5 se fijan con la cara dorsal hacia arriba en un recipiente y se inyecta ADN en la región dorsal periférica de ambas retinas, seguido de electro poración. Las retinas completas se cultivan durante 40 horas, seguido del aislamiento de explantes retinianos positivos para GFP para ensayos de cultivo in vitro.Hola, soy Tim Petros del laboratorio de la Dra. Carol Mason, del Departamento de Patología y Biología Celular y Neurociencia de la Universidad de Columbia. Hoy les mostraré cómo introducir genes en la retina embrionaria en espejo mediante la electroforesis retiniana in utero y ex vivo. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar cómo la manipulación de la expresión génica en las células ganglionares de la retina altera su trayecto de proyección, específicamente en el quiasma óptico.De acuerdo, comencemos. Antes de intentar la electroporación retiniana in utero, es esencial una preparación adecuada. Consulte nuestro protocolo escrito para obtener información detallada sobre la preparación de la anestesia, la esterilización de herramientas e instrumentos, la preparación de las soluciones de ADN para inyección y de las soluciones antibióticas antimicóticas para usar después de la cirugía, el acondicionamiento del área quirúrgica y el calentamiento de las soluciones adecuadas.Las micropipetas de punta fina deben prepararse previamente a la cirugía utilizando un extractor de microelectrodos. Rompa la punta para obtener un punto en ángulo destinado a la electroforesis intrauterina. Primero inyecte 0,15 mililitros de la mezcla anestésica por vía intraperitoneal en una hembra en estadio E 13,5 a E 14,5. Deben transcurrir entre tres y siete minutos hasta que la hembra esté completamente anestesiada; para comprobar si el ratón está anestesiado, realice una prueba de reflejos.Pinche la pata trasera y verifique la ausencia de respuesta durante el intervalo en que el animal está cayendo en anestesia. Corte un trozo pequeño y pipetee cinco microlitros de la solución de ADN sobre el param. Doble un émbolo de alambre metálico en un ángulo de 90 grados e insértelo en una micropipeta estirada; utilice el émbolo para aspirar la solución de ADN dentro de la micropipeta.Ahora exponga quirúrgicamente los embriones de ratón. Consulte el protocolo de JoVE de Wal Inus et al. para la técnica adecuada. Ahora estamos listos para la electroforesis.El primer paso consiste en orientar adecuadamente la retina. A continuación, inyectaremos ADN en la retina y luego electroestimularemos la cabeza. Bien, comencemos.Vale, el primer paso consiste en orientar la retina de manera que quede mirando hacia arriba, como esta. A continuación, con la micropipeta, atravesaremos la pared amniótica e idealmente inyectaremos el ADN directamente en la retina. Una vez que haya atravesado la pared uterina, presionará el émbolo, lo que expulsará el ADN dentro de la retina, y luego retirará el émbolo.Como tal, una vez que haya inyectado el ADN, debería observar el tinte verde llenando el líquido amniótico y también la retina. Bien, ahora que hemos realizado la inyección, estamos listos para la electroforesis. Para realizar la electroforesis, colocaremos las paletas de electroforesis alrededor del embrión, con la paleta positiva adyacente a la retina que fue electroforizada.Y cuando esté listo, un pedal de pie depresor que entregará corriente al embrión. Verá burbujas formándose en la paleta del pedal con carga negativa, lo que indica que la electroforesis fue exitosa. Repita este paso para todos los embriones inyectados.Así es como se electropora ADN en una retina embrionaria. Puede repetir este procedimiento en tantos embriones como desee. Tenga en cuenta que cuantos más embriones electroporte, mayor será la probabilidad de que la madre aborte los embriones.Después de electroestimular los embriones, use los dedos para masajear la cadena embrionaria de vuelta dentro de la hembra una vez que los embriones hayan sido reintroducidos. Vierta aproximadamente dos mililitros de la solución antibiótico antimicótica en la cavidad abdominal. Utilice el hemostato y la pinza para suturar el peritoneo, comenzando con un nudo doble en la porción anterior de la incisión y continuando con un patrón de sutura continua simple hacia la porción posterior de la incisión.Utilice el último lazo para asegurar la sutura y corte el exceso de sutura. Finalmente, cierre la incisión con grapas. Para hacerlo, levante la piel en la porción anterior de la incisión con pinzas romas.Tenga cuidado de separar la piel del peritoneo. A continuación, coloque los dientes del grapador alrededor de la piel y presione el grapador; continúe grapando la incisión hasta el extremo posterior, lo cual generalmente requiere de cinco a siete grapas. Una vez finalizado, limpie la herida alrededor de las grapas con una torunda de alcohol.Deje que la hembra se recupere sobre la almohadilla calefactora y luego colóquela en una jaula nueva. Cuando comience a temblar y girarse, por lo general tarda entre 15 y 90 minutos en despertar para minimizar el dolor y la incomodidad. Las madres reciben buprenorfina al despertar y en momentos posteriores.Si la incomodidad continúa impidiendo la deshidratación, inyecte a la hembra un mililitro de solución salina por vía subcutánea aproximadamente entre dos y cuatro horas después de la cirugía. Después de 24 horas posteriores a la cirugía, la hembra debería recuperar un comportamiento normal y estar bebiendo y comiendo regularmente. Recogeremos la retina electro porada en E 18.5 para su análisis.Alternativamente, puede permitir que la hembra dé a luz y obtener la retina en edades posnatales para su análisis en etapas posteriores. Después de anestesiar al animal, use tijeras para cortar la piel y el peritoneo debajo de las grapas. Para exponer la cavidad abdominal y los cuernos uterinos, retire un embrión electroporado y sujételo por las extremidades a un recipiente de disección con la cara ventral hacia arriba; corte la piel abdominal y el peritoneo, y luego corte las porciones laterales de la caja torácica para exponer el corazón.A continuación, atraviese el ventrículo izquierdo con la aguja de perfusión y corte la aurícula derecha con las tijeras microquirúrgicas. Inicie ahora la perfusión y permita que el PFA fluya durante aproximadamente 60 a 90 segundos. Si se realiza correctamente, la sangre debería salir por la aurícula derecha y el embrión debería palidecer.Una vez finalizada la perfusión, seccione la cabeza del embrión y recolecte las cabezas en PF al 4 % en un vial cónico de 15 mililitros. Repita este procedimiento para todos los embriones electroporados y todas las hembras preñadas. Una vez finalizada la recolección de todos los embriones, sacrifique a la hembra mediante dislocación cervical.Mantenga las cabezas en PFA al 4% durante la noche a cuatro grados Celsius y luego lávelas en PBS durante varios días; tras el lavado con PBS, ya está listo para examinar la retina y verificar una expresión exitosa de GFP. Primero sujete la cabeza en un platillo de disección con la retina hacia arriba y sumergida en PBS. Retire la piel alrededor de la retina para exponer el epitelio pigmentario retiniano o RPE utilizando una aguja de calibre 26 y medio.Punzar la retina ventral en la unión del cristalino con el epitelio pigmentario retiniano (RPE). A continuación, insertar un extremo de las microtijeras en este orificio y realizar una incisión vertical a través de la retina ventral hasta el disco óptico. Esto le permitirá orientar la retina cuando la extraiga.Separar el epitelio pigmentario de la retina (RPE) de la retina agarrando el RPE en la incisión ventral con un par de pinzas. Y utilizar otro par de pinzas para desprender el RPE de la retina, específicamente en la unión entre el RPE y el cristalino, donde el RPE está firmemente adherido. Después de retirar el RPE, agarrar el cristalino con pinzas y tirar hacia arriba y hacia afuera.Para eliminar el cristalino, retire cuidadosamente la retina colocando una pinza debajo de la retina y pellizcando el disco óptico para liberarla. Finalmente, transfiera la retina a un pocillo lleno de PBS. Asegúrese de llevar un registro de qué retina provino de qué embrión. Repita estos pasos para la retina contralateral y para todos los demás embriones electroporados. Utilice un microscopio estereoscópico fluorescente para examinar todas las retinas en busca de retinas GFP positivas, lo que indicaría que la electroporación fue exitosa en este embrión, y estas retinas y el cerebro correspondiente pueden procesarse para análisis posteriores.El procedimiento de electroforesis retiniana ex vivo requiere varios pasos preparatorios adicionales que son distintos de la electroforesis in utero. Consulte el protocolo escrito para obtener información detallada sobre la preparación y oxigenación del medio sin suero y la preparación de las placas de cultivo y los ensayos de borde. Después de anestesiar al animal, se abre la cavidad abdominal como se ha demostrado previamente y se extrae toda la cadena embrionaria, colocándola en D-M-E-M-F 12 sobre hielo.A continuación, la hembra debe ser sometida a eutanasia mediante dislocación cervical. Utilice tijeras para cortar la pared uterina, luego extraiga los embriones del saco amniótico y recójalos en D-M-E-M-F 12, manteniéndolos en hielo. Decapite los embriones y guárdelos en medio DMEA sobre hielo; los cuerpos pueden descartarse. A continuación, utilice una pipeta de boca o una pipeta con émbolo y llene una micropipeta con la cantidad deseada de solución de ADN.Luego transfiera uno. Lleve la cabeza a una placa de disección con PBS y sujete la cabeza con la cara dorsal hacia arriba. Pase al microscopio de disección para las inyecciones.Vale, ahora estamos listos para realizar la electro poración. Voy a inyectar el ADN en la región dorsal periférica de ambas retinas y luego electro poraré la cabeza. Bien, allá voy.El primer paso consiste en retirar la piel situada por encima de la retina. Para ello, utilizaremos la pinza para desprender cuidadosamente la piel. Ahora podemos ver la porción dorsal de ambas retinas.A continuación, voy a inyectar ADN justo debajo de la capa del epitelio pigmentario retiniano en ambas retinas. Para ello, sostendré el electrodo en una posición casi horizontal y atravesaré el EPR en la parte dorsal más periférica de la retina. Debería observar cómo el colorante verde llena el espacio retiniano y se filtra hacia la solución de PBS.Vale, ahora es el momento de la electropermeabilización. Primero desclavan la cabeza. Ahora vamos a aplicar la electropermeabilización con las paletas, y queremos que la paleta positiva esté en el lado ventral de la cabeza.Así que colocaremos la cabeza dentro de las paletas con la paleta positiva sobre la superficie ventral y aplicaremos presión para mantener la paleta estable, así. Y ahora realizaremos la electroestimulación. Pueden observarse burbujas formándose en la paleta y en la parte superior de la cabeza.Y eso es todo. Ahora moveremos la cabeza a un recipiente con medio. Así finaliza la electroforesis retiniana ex vivo.Repita este procedimiento con tantos embriones y condiciones de ADN como desee. Ahora vamos a prepararnos para cultivar la retina. Después de completar todas las preparaciones electro, agregue aproximadamente 1.5 mililitros de solución SFM oxigenada a un plato de cuatro pocillos y manténgala en hielo.Tenga un pocillo para cada solución de ADN diferente inyectada. A continuación, transfiera un electro porado. Diríjase a una placa de disección con D-M-E-M-F 12 con una retina orientada hacia arriba, ya sea la retina ventral o el lado opuesto a la región diana.Utilice pinzas finas para pellizcar y rasgar un orificio en el epitelio pigmentario de la retina (RPE). Use este orificio como punto de partida para desprender el RPE alrededor de la retina. No corte ni dañe el ojo, ya que esto provocaría que la retina colapsara sobre sí misma durante la incubación.Después de retirar el epitelio pigmentario de la retina (RPE), use pinzas para extraer la retina presionando el nervio óptico en la base de la retina; deje el cristalino intacto. Transfiera la retina al medio SFM oxigenado en el platillo de cuatro pocillos e inviértala. Pase al otro ojo y repita la extracción de la retina en el ojo contralateral.Realice este paso para todas las cabezas electroporadas e incube la retina en el medio libre de suero oxigenado a 37 grados Celsius durante 40 a 48 horas. Después de la incubación de la retina completa, transfiera la retina de un pocillo de medio libre de suero oxigenado a la tapa de una placa de Petri con D-M-E-M-F 12. Utilizando un microscopio estereoscópico de fluorescencia, seleccione una retina y visualice la porción de la retina que expresa GFP positivamente.A continuación, utilizando un escalpelo microscópico y pinzas, diseccionar y descartar la porción de retina no positiva para GFP, de modo que solo quede un fragmento de retina positivo para GFP. Es útil alternar continuamente entre luz fluorescente y luz normal durante toda la disección. Para seleccionar específicamente la retina positiva para GFP, transferir el fragmento de retina positivo para GFP a un pocillo con G-M-E-M-F 12.Repita este paso para todas las retinas de un pocillo; para cada condición de ADN, utilice una nueva placa de Petri y medio D-M-E-M-F 12 para diseccionar estos fragmentos de retina GFP positivos en explantes retinianos más pequeños para su siembra. Utilice un microscopio de disección para cortar el fragmento grande de retina GFP positivo en explantes más pequeños con un escalpelo microquirúrgico. Los explantes deben tener aproximadamente entre 200 y 300 micrómetros de longitud y anchura.Un fragmento positivo para GFP de retina debería producir aproximadamente de cuatro a diez explantes retinianos positivos para GFP. Recolecte todos los explantes en un pocillo con D-M-E-M-F 12. Repita este paso para todas las regiones retinianas positivas para GFP que se hayan obtenido. Después de preparar todos los explantes retinianos positivos para GFP, agregue 250 microlitros de SFM frío más 0,4 % de metilcelulosa a placas de cultivo recubiertas con laminina.A continuación, transfiera de cuatro a ocho explantes GFP positivos al recipiente de cultivo y use la pinza para acomodar suavemente los explantes X en un polígono, colocando los explantes X a mitad de camino entre el centro y el borde del recipiente. Determine qué lado de los explantes X corresponde a la capa de células ganglionares de la retina (RGC). Esto puede hacerse buscando cristales de epitelio pigmentario de la retina (RPE), que a veces permanecen adheridos a la capa retiniana externa, lo que indica que el lado opuesto es la capa RGC.El lado de las CRR también suele tener algunos restos celulares que pueden ayudar a colocar correctamente la capa de CRR hacia abajo. Utilice pinzas para presionar firmemente el centro del explante a fin de que se adhiera al cubreobjetos de vidrio en la base de la placa de cultivo. Después de sembrar todos los X explantes en una placa de cultivo, transfiera esta a un incubador a 37 grados Celsius.Los explantes de retina X muestran un crecimiento abundante de axones tras 24 horas y pueden utilizarse para numerosos ensayos in vitro, luego se fijan con PFA al 4% durante 30 minutos. Y se tiñen inmunológicamente para el ensayo de límite. Transfiera el explante positivo para FP 4G a un platillo que haya sido preparado para el ensayo de límite.Coloque los explantes X en una línea recta que se aproxime al borde fluorescente con su sustrato de interés. Bajo un microscopio estereoscópico fluorescente, use pinzas para colocar los EXPLAN de manera que queden a unos 50-150 micrómetros del borde fluorescente. Alterne entre los dos canales fluorescentes para visualizar el explante verde y el borde rojo.A continuación, incubar las placas a 37 grados Celsius durante 24 horas, permitiendo tiempo suficiente para que los axones de las células ganglionares de la retina (RGC) alcancen el sustrato límite. Luego, X explan se puede fijar en PFA al 4% durante 30 minutos, seguido de tinción inmunohistoquímica. Tras la electrotransferencia retiniana in utero.Se pueden preparar montajes con perforaciones en la retina para visualizar las CRR GFP positivas en la retina y en sistemas visuales semintactos. Los sistemas visuales se pueden preparar para visualizar los axones GFP positivos a lo largo del nervio óptico, el quiasma óptico y el tracto óptico. Alternativamente, se pueden realizar cortes criostáticos frontales a través de la retina y la vía de las CRR para visualizar y analizar los cuerpos celulares de las CRR GFP positivas en la retina, así como los axones en el nervio óptico, el quiasma y el tracto.Todos los axones retinianos se visualizan mediante tinción de neurofilamentos. Además, la electroforesis in utero puede utilizarse para estudiar la proyección axonal de las células ganglionares de la retina (RGC) en el núcleo geniculado lateral (LGN) mediante la recolección de crías entre los días postnatales cuatro y diez. En el día postnatal ocho, los axones positivos para GFP son visibles en el LGN, con CTB LOR 5 94 en el canal rojo inyectado en la retina ipsilateral y CT bor 6 47 en el canal azul inyectado en la retina contralateral, para etiquetar toda la proyección de las RGC tras la electroforesis ex vivo y el cultivo de implantes retinianos.Un subconjunto de axones de CRR positivos para RGFP puede visualizarse claramente tanto con aumento bajo como alto, como se observa en las imágenes superior e inferior, respectivamente. La respuesta de los axones positivos para GFP puede analizarse sembrando XS adyacentes a los bordes de diversos sustratos mostrados aquí en azul. Acabamos de mostrarle cómo introducir genes en la retina embrionaria mediante la electroporación retiniana in utero y ex vivo.Aunque hemos centrado nuestro análisis en la guía axonal del quiasma óptico, esta técnica podría ser beneficiosa para quienes estudian la diferenciación de las CCR, la morfología dendrítica y las propiedades electrofisiológicas de las células ganglionares de la retina. Al realizar este procedimiento, es importante recordar minimizar el daño a la retina al inyectar el ADN y mantener siempre los embriones hidratados con PBS durante todo el experimento. Eso es todo.Gracias por ver el video y buena suerte con sus experimentos.

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Aprende a manipular la expresión génica en células ganglionares retinianas de ratón mediante electroporación in utero y ex vivo. Estas técnicas permiten estudiar el desarrollo retiniano y las propiedades funcionales de las CGR.

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