La electroporación in vivo en el útero y el ex de la expresión génica en células de ratón ganglionares retinianas

En el útero, la electroporación de la retina comienza con una incisión abdominal en un dique anestesiado de 13,5 a 14,5 etapas para exponer la cadena embrionaria. El ADN se inyecta en una retina por embrión y las cabezas se electroporan, lo que hace que el ADN sea absorbido por los progenitores de RGC. En E 18.5 los embriones se perfunden y GFP positivos.

La retina y las proyecciones visuales se analizan para la electroporación retiniana X vivo. Las cabezas E 13,5 a 14,5 se fijan con el lado dorsal hacia arriba en una placa y el ADN se inyecta en la región dorsal periférica de ambas retinas, seguido de electroporación. La retina completa se cultiva durante 40 horas, seguida de la colocación en placas de explantes de retina positivos para GFP para ensayos de cultivo in vitro.

Hola, soy Tim Petros del laboratorio de la Dra. Carol Mason en el Departamento de Patología y Biología Celular y Neurociencia de la Universidad de Columbia. Hoy le mostraremos cómo introducir genes en la retina espejo embrionaria mediante la utilización de electroporación retiniana in utero y ex vivo. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar cómo la manipulación de la expresión génica y las células ganglionares de la retina altera su vía de proyección, específicamente en el quiasma óptico.

Bien, comencemos. Antes de intentar la electroporación de la retina en el útero, es esencial una preparación adecuada. Consulte nuestro protocolo escrito para obtener información detallada sobre la preparación de la esterilización anestésica de herramientas e instrumentos, la preparación de las soluciones de ADN para inyección y las soluciones antimicóticas antibióticas para después de la cirugía, la preparación del área quirúrgica y el calentamiento de las soluciones adecuadas.

Las micropipetas de punta fina deben prepararse antes de la cirugía con un extractor de microelectrodos. Rompa la punta para hacer un punto en ángulo para la electroporación en el útero Primero inyecte 0,15 mililitros de la mezcla anestésica interperitoneal en un dique de etapa E 13.5 a E 14.5. Deben pasar de tres a siete minutos hasta que el dique esté completamente bajo anestesia para probar si el ratón está anestesiado.

Pellizque la pata trasera y compruebe si hay falta de respuesta durante el intervalo en el que el animal sucumbe a la anestesia. Corta un pequeño trozo y pipetea cinco microlitros de la solución de ADN en el parámetro. Doble un émbolo de alambre metálico en un ángulo de 90 grados e insértelo en una micropipeta tirada con el émbolo y aspire la solución de ADN en la micropipeta.

Ahora exponer quirúrgicamente los embriones de ratón. Consulte el protocolo JoVE de Wal Inus et al para conocer la técnica adecuada. Ahora estamos listos para la electroporación.

El primer paso es orientar la retina correctamente. Luego inyectaremos ADN en la retina y luego haremos electro desfile de la cabeza. Bien, comencemos.

Bien, el primer paso es orientar la retina para que quede hacia arriba como esta. A continuación, con la micropipeta, perforaremos la pared amniótica e idealmente inyectaremos el ADN directamente en la retina. Una vez que haya perforado la pared uterina, presionará el émbolo, que expulsará el ADN a la retina y tirará hacia atrás del émbolo.

Como tal, una vez que haya inyectado el ADN, debería ver que el tinte verde llena el líquido amniótico y también la retina. Bien, ahora que hemos hecho la inyección, estamos listos para la electroporación. Así que para electro orar, vamos a colocar las paletas de electroporación alrededor del embrión con la paleta positiva adyacente a la retina que fue electro desfilada.

Y cuando esté listo, un pie depresivo remará y eso entregará corriente al embrión. Se ven burbujas que se forman en la paleta de carga negativa de la bandeja y eso demuestra que la electroporación fue un éxito. Y repetirá este paso para todos los embriones inyectados.

Así es como se electro el ADN en una retina embrionaria. Puedes repetir este procedimiento hasta tantos embriones como desees. Hay que tener en cuenta que cuantos más embriones se electromuestren, más posibilidades hay de que la madre aborte los embriones.

Después de electro exhibir los embriones, use sus dedos para masajear la cadena embrionaria de regreso a la madre una vez que los embriones estén de regreso. Vierta unos dos mililitros de la solución antibiótica antimicótica en la cavidad abdominal. Utilice el hemostático y las pinzas para suturar el peritoneo, comenzando con un nudo doble en la parte anterior de la incisión y continúe en un patrón de sutura simple y continuo hasta la parte posterior de la incisión.

Use el lazo final para atar la sutura y recortar el exceso de sutura. Finalmente, grapa la incisión para cerrarla. Para hacer esto, levante la piel en la porción anterior de la incisión con pinzas romas.

Tenga cuidado de separar la piel del peritoneo. A continuación, coloque los dientes de la grapadora alrededor de la piel y para presionar la grapadora, continúe grapando la incisión cerrada hasta el extremo posterior, lo que generalmente requiere de cinco a siete grapas. Una vez terminado de grapar, limpie la herida alrededor de las grapas con una almohadilla con alcohol.

Deje que la madre se recupere en la almohadilla térmica y luego colóquela en una jaula nueva. Cuando comienza a temblar y darse la vuelta, generalmente tarda entre 15 y 90 minutos en despertarse para minimizar el dolor y la incomodidad. Las madres reciben buprenorfina al despertar y en momentos posteriores.

Si las molestias continúan impidiendo la deshidratación, inyecte el dique con un mililitro de solución salina por vía subcutánea aproximadamente de dos a cuatro horas después de la cirugía. Después de 24 horas después de la cirugía, la madre debe recuperar el comportamiento normal y beber y comer regularmente. Recolectaremos la retina electroporada en E 18.5 para su análisis.

Alternativamente, puede dejar que la madre dé a luz y extraiga la retina a edades postnatales para analizarla a edades posteriores. Después de anestesiar al animal, use unas tijeras para cortar la piel y el peritoneo debajo de las grapas. Para exponer la cavidad abdominal y los cuernos uterinos, extraiga un embrión electroporado y sujete el embrión a través de las extremidades hasta una placa de disección con el lado ventral hacia arriba, corte a través de la piel abdominal y el peritoneo y corte a través de las porciones laterales de la caja torácica para exponer el corazón.

A continuación, perfore el ventrículo izquierdo con la aguja de perfusión y corte la aurícula derecha con las microtijeras. Ahora inicie la perfusión y deje que el PFA fluya durante unos 60 a 90 segundos. Si se hace correctamente, la sangre debe salir de la aurícula derecha y el embrión debe volverse pálido.

Una vez finalizada la perfusión, decapitar el embrión y recoger cabezas en 4%PF en un vial cónico de 15 mililitros. Repita este procedimiento para todos los embriones electroporados y todas las madres. Una vez finalizada la recolección de todos los embriones, sacrificar la madre por luxación cervical.

Mantenga las cabezas en 4% PFA durante la noche a cuatro grados centígrados y luego lávelas en PBS durante varios días después de lavarlas con PBS, ahora está listo para examinar la retina para una expresión exitosa de GFP. Primero clava la cabeza en una placa de disección con una retina hacia arriba y sumergida en PBS. Retire la piel alrededor de la retina para revelar el epitelio pigmentario de la retina o EPR con una aguja de calibre 26 y medio.

Punción de la retina ventral en la unión del EPR del cristalino. A continuación, inserte un borde de las microtijeras en este orificio y haga una incisión vertical a través de la retina ventral hasta el disco óptico. Esto te permitirá orientar la retina cuando te la saques.

Separe el EPR de la retina agarrando el EPR en la incisión ventral con un par de fórceps. Y use otro par de pinzas para despegar el EPR de la retina, específicamente en la unión del cristalino del EPR donde el EPR está firmemente unido. Después de retirar el EPR, sujete el cristalino con pinzas y tire hacia arriba y hacia atrás.

Para extraer el cristalino, extraiga con cuidado la retina colocando pinzas debajo de la retina y pellizque la cabeza del nervio óptico para liberar la retina. Finalmente transfiere la retina a un PBS relleno. Bueno, asegúrese de llevar un registro de qué retina proviene, qué cabezas repita estos pasos para la retina contralateral y para todos los demás embriones electroporados, use un microscopio de disección fluorescente para escanear toda la retina en busca de retina GFP positiva, lo que indicaría que la electroporación fue exitosa en este embrión y esta retina y el cerebro correspondiente se pueden procesar para un análisis posterior.

El procedimiento de electroporación retiniana ex vivo requiere varios pasos preparatorios adicionales que son distintos de la electroporación en el útero. Consulte el protocolo escrito para obtener información detallada sobre la preparación y oxigenación del medio libre de suero y la preparación de placas de cultivo y ensayos fronterizos. Después de anestesiar al animal, se abre la cavidad abdominal como se demostró anteriormente y se retira toda la cadena embrionaria y se coloca en D-M-E-M-F 12 sobre hielo.

A continuación, se debe aplicar la eutanasia a la madre mediante la luxación cervical. Use tijeras para cortar a través de la pared uterina, luego retire los embriones del saco amniótico y recoja en D-M-E-M-F 12 y mantenga en hielo los embriones decapitados y manténgalos en DMEA medio en cuerpos de hielo se pueden descartar. A continuación, utilice una pipeta bucal o una pipeta de émbolo y llene una micropipeta con la cantidad deseada de solución de ADN.

A continuación, transfiera uno. Dirígete a un plato de disección con PBS y sujeta la cabeza con alfileres con el lado dorsal hacia arriba. Pase al osciloscopio de disección para las inyecciones.

Bien, ahora estamos listos para electro parlotear. Voy a inyectar el ADN en la parte dorsal periférica de ambas retinas y luego electro golpear la cabeza. Bien, aquí voy.

El primer paso es extirpar la piel por encima de la retina. Para ello, utilizaremos las pinzas justo para despegar la piel. Ahora podemos ver la porción dorsal de ambas retinas.

A continuación, voy a inyectar ADN justo debajo de la capa de epitelio pigmentario de la retina en ambas retinas. Para ello, voy a sujetar el electrodo en una posición casi horizontal y perforar el EPR en la parte dorsal más periférica de la retina. Deberías ver que el tinte verde llena el espacio de la retina y se filtra hacia la solución de PBS.

Bien, ahora es el momento de la electroporación. Primero se desengancha la cabeza. Ahora vamos a electro depredar las paletas y queremos que la paleta positiva esté en el lado ventral de la cabeza.

Así que colocaremos la cabeza dentro de las paletas con la pala positiva en la superficie ventral y aplicaremos presión para mantener la pala firme así. Y ahora vamos a desfilar electro. Puedes ver las burbujas que se forman en la paleta y en la parte superior de la cabeza.

Y eso es todo. Ahora moveremos la cabeza a un plato con mediana. Eso es todo para la electroporación retiniana ex vivo.

Repita este procedimiento para tantos embriones y condiciones de ADN como desee. Ahora nos vamos a preparar para cultivar la retina. Después de completar todas las preparaciones eléctricas, agregue aproximadamente 1,5 mililitros de solución SFM oxigenada a un plato de cuatro pocillos y manténgalo en hielo.

Inyecte un pocillo por cada solución de ADN diferente. A continuación, transfiera uno electroporado. Diríjase a una placa de disección con D-M-E-M-F 12 con una retina hacia arriba en la retina ventral o en el lado opuesto a la región objetivo.

Use pinzas finas para pellizcar y rasgar un orificio en el EPR. Use este orificio como punto de partida para despegar el EPR de alrededor de la retina. No corte ni dañe el ojo, ya que esto hará que la retina colapse sobre sí misma durante la incubación.

Después de retirar el EPR, use fórceps para sacar la retina pellizcando el nervio óptico en la base de la retina y deje intacto el cristalino. Transfiera la retina al SFM oxigenado en el plato de cuatro pocillos. Dirígete y repite la extracción de la retina para el ojo contralateral.

Complete este paso para todas las cabezas electroporadas e incube la retina en el SFM oxigenado a 37 grados centígrados durante 40 a 48 horas. Después de la incubación de la retina completa, transfiera la retina de un pocillo de SFM oxigenado a una tapa de placa de Petri con D-M-E-M-F 12. Usando un telescopio de disección fluorescente, elija una retina y visualice la porción de retina que expresa GFP positiva.

A continuación, con un microbisturí y unas pinzas, diseccione y deseche la parte de la retina no GFP positiva de modo que solo quede un trozo de retina GFP positivo. Es útil cambiar continuamente entre la luz fluorescente y la luz regular durante toda la disección. Para seleccionar específicamente la retina GFP positiva, transfiera la parte de retina GFP positiva a un pocillo con G-M-E-M-F 12.

Repita este paso para toda la retina de una sola vez. Bueno, para cada condición de ADN, use una nueva placa de Petri y un medio D-M-E-M-F 12 para diseccionar estos pedazos de retina GFP positivos en un plan de retina más pequeño para la placa. Utilice un endoscopio de disección para cortar el trozo grande de retina GFP positivo en un fragmento más pequeño con un microbisturí. El plano debe ser de unos 200 a 300 micrómetros de largo y ancho.

Un trozo de retina GFP positivo debería producir alrededor de cuatro a 10 explan de retina GFP positivo Recoja todo el explan en un pozo con D-M-E-M-F 12. Repita este paso para todas las regiones retinianas positivas para GFP que se recolecten. Después de preparar todo el extracto de retina positivo para GFP, agregue 250 microlitros de SFM frío más 0,4% de metilcelulosa a las placas de cultivo recubiertas de laminado.

A continuación, transfiera de cuatro a ocho explanes positivos de GFP a la placa de cultivo y use las pinzas para organizar suavemente el explan X en un polígono con explan x ubicado a medio camino entre el centro y el borde del plato. Determine qué lado del plano X es la capa RGC. Esto se puede hacer buscando cristales de RPE, que a veces pueden permanecer unidos a la capa externa de la retina, lo que indica que el lado opuesto es la capa RGC.

El lado del RGC también suele tener algunos residuos celulares que pueden ayudar en la explicación adecuada con la capa del RGC hacia abajo. Use pinzas para presionar firmemente el centro del explan, de modo que se adhiera al deslizamiento de la cubierta de vidrio en la base de la placa de cultivo. Después de colocar todo el plan X en una placa de cultivo, transfiéralo a una incubadora a 37 grados centígrados.

Los explantes de Retinal X muestran un crecimiento abundante de los axones después de 24 horas y se pueden utilizar para numerosos ensayos in vitro, luego se fijan con 4% de PFA durante 30 minutos. Y tinción inmunológica para el ensayo de frontera. Transfiera el explan positivo 4G FP a una placa que se haya preparado para el ensayo fronterizo.

Coloque los explantes X en una línea recta que se aproxime al borde fluorescente con su sustrato de interés. Bajo un microscopio de disección fluorescente, use pinzas para colocar una placa en el EXPLAN de modo que estén a unos 50 a 150 micrómetros del borde fluorescente. Alternando entre los dos canales fluorescentes para visualizar el modelo verde y el borde rojo.

A continuación, incube las placas a 37 grados centígrados durante 24 horas, dejando tiempo suficiente para que los axones de RGC lleguen al sustrato del borde. A continuación, se puede fijar X explan en PFA al 4% durante 30 minutos, seguido de una tinción inmunológica. Electroporación retiniana intrauterina.

Las monturas de orificios de retina se pueden preparar para visualizar GFP R GC positivos en la retina y semi intactos. Los sistemas visuales pueden prepararse para visualizar los axones positivos de GFP en todo el nervio óptico, el quiasma óptico y el tracto óptico. Alternativamente, se pueden realizar cortes criogénicos frontales a través de la retina y la vía RGC para visualizar y analizar los cuerpos de células RGC GFP positivas en la retina y los axones en el quiasma y el tracto del nervio óptico.

Todos los axones de la retina se visualizan con tinción de neurofilamentos. Además, en el útero, la electroporación se puede utilizar para estudiar la orientación de los axones de RGC en el núcleo de generación lateral LGN mediante la recolección de crías en P 4 a P 10. En P, ocho axones GFP positivos son visibles en el LGN con el canal rojo CTB LOR 5 94 inyectado en la retina ipsilateral y el canal azul CT bor 6 47 en la retina contralateral para marcar toda la proyección de RGC después de la electroporación ex vivo y la colocación de placas de los implantes de retina.

Un subconjunto de axones RGC RGFP positivos y se pueden visualizar claramente tanto a menor como a mayor potencia, como se ve en las imágenes superior e inferior respectivamente. La respuesta de los axones positivos de GFP se puede analizar mediante el recubrimiento XS adyacente a los bordes de varios sustratos que se muestran aquí en azul. Acabamos de mostrarle cómo introducir genes en la retina embrionaria mediante la utilización de electroporación retiniana in utero y ex vivo.

Si bien hemos centrado nuestro análisis en la guía axonal del quiasma óptico, esta técnica podría ser beneficiosa para aquellos que estudian la diferenciación de RGC, la morfología dendrítica y las propiedades electrofisiológicas de las células ganglionares de la retina. Al realizar este procedimiento, es importante recordar minimizar el daño a la retina al inyectar el ADN y mantener siempre los embriones hidratados con PBS durante todo el experimento. Así que eso es todo.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.