Name: La recolección y preparación de Drosophila Los embriones de registro electrofisiológico y otros procedimientos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-20T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Aprende a recolectar y disecar embriones de Drosophila para registrar la neuromusculatura mediante electrofisiología. Este método permite estudiar el desarrollo neuromuscular temprano en mutantes que no eclosionan.

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Parte 1: Equipos y Suministros <ol><li> Un microscopio de disección se requiere una buena disección de embriones, se sugiere la ampliación de 40X, 25X, con los ojos las piezas para aumentar al máximo aumento. </li><li> Pinzas finas (número 5) se requieren para la selección manual de los embriones y devitellinization de embriones. </li><li> Equipo para realizar y modificar las finas agujas de vidrio es necesario. Tira de vidrio se requieren agujas para la disección. Preferimos vidrio sólido para la disección (duran más), pero la norma de paredes gruesas tubo de vidrio (diámetro externo 1-1,5 mm) funciona tan bien. Algunas personas utilizan agujas muy finas de tungsteno, electrólisis de la nitidez deseada en un baño de NaOH 1 M con una batería de 10 + autotransformador Amp. Afiladas agujas de disección de tungsteno tienen la ventaja de que son relativamente resistentes y de larga duración. Agujas de vidrio hueco (similar a la forma de parches electrodos pinza) están conectados a un tubo de plástico y se utiliza durante la disección de succión y expulsión de solución salina, así como la entrega controlada de la cola. Una variedad de extractores de vidrio están disponibles para la fabricación de agujas de cristal. Programada por ordenador extractores puede ser programado para tirar de una variedad de formas y tamaños. El Brown-Flaming modelos (Sutter Instrument Co.) son ampliamente favorecidos. Un microscopio compuesto (20-40X objetivo) debe estar disponible para inspeccionar y modificar los electrodos antes de su uso. </li><li> Dos tipos de soluciones se utilizan comúnmente para baño de los tejidos embrionarios durante la disección: 1) &quot;estándar&quot; (Jan y Jan, 1976a) o &quot;norma modificada&quot; (Broadie, 2000) salinas, en base a soluciones de uso común para la grabación en otros sistemas de invertebrados , y 2) &quot;hemolinfa-like&quot; (HL) Salines (Stewart et al 1994), un compromiso entre la solución salina normal y las concentraciones iónicas medidas en la hemolinfa de Drosophila. Cabe señalar que ninguna de estas salinas de reproducir fielmente la composición química de la hemolinfa en vivo (Broadie, 2000). Salino estándar contiene (en mM): 135 NaCl, 5 KCl, 4 MgCl 2, 1,8 CaCl 2, 72 sacarosa, 5 TES, pH 7,2. Los experimentadores también puede considerar salina preparada comercialmente de insectos (por ejemplo, los medios de comunicación de insectos de Schneider), que no es apta para registro electrofisiológico pero lo más probable para proteger la salud de los tejidos expuestos. </li></ol> Parte 2: La estadificación de embriones y la disección <ol><li> Para la recolección de huevos óptima, mantener jóvenes (&lt;7 días), varones sanos y las moscas hembras (20-40) en fresco por la que se ollas durante 2-3 días. Por la que se ollas comunes constan de 100 vasos de plástico ml (Tri-Pour) perforada para proporcionar la circulación de aire adecuada, cubriendo una placa de agar de 60 mm. Placas de agar contienen jugo de manzana o de uva endurecido con agar. Existen varias recetas, pero un ejemplo es el siguiente: 700 ml de agua, 25 a 30 gramos de agar, 300 ml de jugo concentrado (uva o manzana), 0,5 g de metilparabeno (p-hydroxymethylbenzoate), y el azúcar 30 g. Autoclave el agua y el agar, y por separado hervir el p-hydroxymethylbenzoate con el azúcar y el jugo. Mezcle el jugo de agar y soluciones de forma rápida y verter en placas de 60 mm, la eliminación de las burbujas. </li><li> Antes de la recolección de huevos, las moscas se alimentan de pasta de levadura (7 gramos de levadura de panadería en 9 ml de agua se almacenan a 4 ° C) en las placas nuevas, cambiar por lo menos dos veces al día durante al menos dos días. El día 3, una buena olla debe producir 100-200 huevos por hora. Mejor puesta de huevos se observa en una olla mantenido a su lado con el agar en la placa de rayado. Muchos embriones se establecerán en o junto a los arañazos. </li><li> Para recoger un gran número de embriones, la transferencia de los embriones con cuidado de la placa de agar en una cesta con un pincel. Una cesta se puede hacer con un tubo de centrífuga de 15 ó 50 ml. Cortar la parte inferior dejando la superficie lo suficiente para atrapar a una pantalla (70 micras de malla) entre la tapa y la parte superior del tubo. Enjuague los embriones con dH 2 0 y poner en una placa de Petri de agua dulce 50% al 100% de lejía para eliminar el corion externo. Por otra parte, los huevos pueden ser recogidos por separado utilizando unas pinzas finas, y dechorionated mediante la colocación de forma manual en una gota de lejía. De-chorionation puede tardar desde 30 segundos a 2 minutos (lejía fresca es mucho más rápido), y deben ser controlados bajo el microscopio de disección. La eliminación del corion expone la membrana brillante, transparente vitelino. Huevos dechorionated debe enjuagarse brevemente, o se colocan en una solución salina, como el cloro destruye rápidamente los tejidos devitellinized. </li><li> Es fundamental para la etapa cuidadosamente los embriones a la edad deseada de desarrollo. La Drosophila definido las fases embrionarias (1-17; Campos-Ortega y Hartenstein, 1985) no son útiles, como todo el desarrollo neuromuscular funcional ocurre en 16 etapas finales o de la etapa 17. Por lo tanto, los embriones son protagonizadas por hora de desarrollo a 25 ° C en una incubadora humidificada, en horas después de la fecundación o, más comúnmente, después de la puesta de huevos (AEL). En estas condiciones, la embriogénesis dura 21 + / - 1 hora a 25 ° C. </li><li> Los huevos procedentes de un tiempo de huevo laicos (1-2 hrs) que estén debidamente años están al lado de vista de los criterios morfológicos. Después de un prolongado lavado en dH 2 O, los huevos dechorionated se colocan en una placa de cultivo de plástico (en dH 2 O) para su visualización. Puesta en escena correcta se puede confirmar con criterios morfológicos utilizando la luz reflejada con un microscopio de disección (Campos-Ortega y Hartenstein, 1985). Madura la última etapa de embriones (22-24h AEL) al borde de la eclosión son generalmente reconocidos por la segmentación de la cutícula y la tráquea infladas. Los embriones también pueden ser genotipo utilizando equilibradores de las buenas prácticas agrarias y un microscopio de disección de fluorescencia con los filtros adecuados. </li><li> Para la disección, embriones y dechorionated etapas de desarrollo están sujetos (lado dorsal hacia arriba) en un cubreobjetos en una gota de solución salina (véase el paso 1.5). Los embriones se extraen de la membrana vitelina por punción de la membrana cerca del extremo anterior o posterior, con una micropipeta de vidrio o una aguja de tungsteno, y luego suavemente liberar al embrión de la membrana. En preparación para la disección, el embrión debe ser colocado en el portaobjetos con la superficie hasta dorsal (parte dorsal hasta la disección se exponga el sistema nervioso ventral y neuromusculatura para los experimentos. Sin embargo, el embrión, obviamente, se puede colocar en otras maneras de facilitar el acceso a otros tejidos.) </li><li> Embriones prematuros (&lt;16 h AEL) se conectan directamente a limpiar el cristal o de vidrio recubierto con polilisina (poli-L-lisina bromhidrato; Broadie y Bate, 1993a, b). Mayores embriones (&gt; 16 hrs AEL), tras la formación de la cutícula, deben ser pegados, lo ideal es que Sylgard recubiertos (Dow Corning) cubreobjetos. Un agua de polimerización pegamento de cianoacrilato quirúrgico o veterinario se utiliza (Broadie y Bate, 1993c, d). El pegamento se entrega a través de una pipeta de vidrio pequeño electrodo (10-20 punta micrómetro de diámetro interior) conectada a un tubo de goma con el flujo de cola controlado por la presión de la boca. Se debe tener cuidado durante el parto de cola, como el pegamento se polimeriza rápidamente en contacto con la solución salina. Tenga en cuenta también que pegar no se puede realizar en una solución salina sin o bajas concentraciones de iones divalentes, como el pegamento requiere iones divalentes para polimerizar. Pequeñas cantidades de pegamento se utilizó por primera vez para sujetar firmemente la cabeza y la cola. </li><li> Una vez que los extremos del embrión se pegan a los cubreobjetos, se hace una incisión a lo largo de la línea media dorsal con un electrodo de vidrio o una aguja de tungsteno afilada. Esto es más fácil con cuidado perforando la línea de incisión antes de hacer el corte final. Los lados de la incisión se adjuntarán a los cubreobjetos con más cola, para extender suavemente el piso embrión. Los órganos internos, incluyendo los intestinos, los órganos de la grasa y, opcionalmente, la tráquea se retirar mediante aspiración con una pipeta de vidrio conectado a un tubo de goma (Broadie y Bate 1993a-c). El embrión debe adjuntar planos de la cubreobjetos, la epidermis hacia abajo con el ventral del sistema nervioso central, nervios periféricos y músculos somáticos expuestos para la experimentación. </li></ol>

Clasificación precisa de los embriones es crítica debido a la rápida maduración de las propiedades funcionales en el transcurso de tiempo de tan sólo varias horas. Varios problemas complican la puesta en escena. En primer lugar, la mayoría de los investigadores utilizan huevo tiempo pone a los embriones de etapa, pero el tiempo de puesta de huevos puede variar enormemente de un animal a otro en diferentes condiciones (Broadie et al. 1992). En particular, las mujeres con una dieta limitada tienden a retener los huevos fe...

<table><tbody><tr><td>Cajas para recolección de embriones</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-100 (para placa de 60 mm; disponibles otros tamaños)</td><td>Las cajas también pueden fabricarse en el laboratorio utilizando vasos de tres bocas perforados, como se muestra en el video</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>Disponible en varias compañías</td><td>El adhesivo quirúrgico se adhiere mejor a cubreobjetos recubiertos con Sylgard</td></tr><tr><td>Tubo de vidrio fino, diámetro externo de 1,0-1,5 mm</td><td>Varios</td><td></td><td>Para estirarlo y formar agujas de vidrio finas para disección y tubos para la aplicación de adhesivo</td></tr><tr><td>Tubo de plástico, para conectar al pipeta de vidrio para succión bucal y aplicación de adhesivo</td><td>Tygon</td><td></td><td>El diámetro interno del tubo debe coincidir con el diámetro externo del vidrio.</td></tr></tbody></table>

la recolección y preparación de drosophila los embriones de registro electrofisiológico y otros procedimientos

Harvesting and Preparing Drosophila Embryos for Electrophysiological Recording and Other Procedures

Drosophila es un modelo genético de primera para el estudio de ambos el desarrollo embrionario y funcional neurociencia. Tradicionalmente, estos campos son muy aislados unos de otros, con historias en gran medida independiente y la comunidad científica. Sin embargo, la relación entre estos campos por lo general diferentes programas de desarrollo es la base de adquisición de las propiedades funcionales de señalización eléctrica y la diferenciación de las sinapsis químicas funcional durante las fases finales de la formación de circuitos neuronales. Esta interfaz es una zona muy importante para la investigación. En Drosophila, estas fases de desarrollo funcional se producen durante un período de &lt;8 horas (a 25 ° C) durante el último tercio de la embriogénesis. Este período de desarrollo tardío fue considerado durante mucho tiempo difíciles de investigación debido a la deposición de una cutícula dura, epidérmico impermeable. Un avance avance fue la aplicación de agua de polimerización pegamento quirúrgico que puede aplicarse localmente a la cutícula para permitir la disección controlada de la última etapa de embriones. Con una incisión longitudinal dorsal, el embrión puede ser en plano, dejando al descubierto el cordón nervioso ventral y la musculatura de la pared del cuerpo para la investigación experimental. Este sistema ha sido muy utilizada para aislar y caracterizar mutantes genéticos que impiden la formación de sinapsis embrionario, por lo que revelan los mecanismos moleculares que regulan la especificación y diferenciación de las sinapsis y conexiones sinápticas propiedades funcionales de señalización.

Esta técnica expone al neuromusculatura Drosophila embrionarias para inmunohistoquímica o de registro electrofisiológico. Es útil para el estudio de los primeros eventos en el desarrollo neuromuscular o la realización de electrofisiología en los mutantes que no pueden eclosionar.

La recolección y preparación de Drosophila Los embriones de registro electrofisiológico y otros procedimientos

Drosophila es un modelo genético primordial para el estudio tanto del desarrollo embrionario como de la neurociencia funcional. Tradicionalmente, estos campos son bastante...

Para realizar grabaciones electrofisiológicas en embriones de drosófila, primero deben cosecharse, alinearse y diseccionarse; una disección controlada es posible gracias a un adhesivo quirúrgico polimerizable en agua, que estabiliza los embriones sobre láminas de cubierta. Luego se eliminan los órganos internos de los embriones estabilizados para exponer el sistema nervioso central ventral, los nervios periféricos y la musculatura somática. Hola, soy Dave Featherstone del Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad de Illinois en Chicago.Hola, soy Ton del Laboratorio de Dave Featherstone en el Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad de Illinois en Chicago. Hoy les mostraremos cómo recolectar y diseccionar manualmente embriones de fase tardía de Joof. Utilizamos este procedimiento general en el laboratorio para prepararnos para pruebas electrofisiológicas del desarrollo y funcionamiento del sistema neuromuscular de Joof, las cuales les mostraré en otra presentación próxima de JoVE.Así que comencemos. Este protocolo comienza con la recolección de embriones, un procedimiento común utilizado en una variedad de experimentos de joof, que ahora revisaremos. Establezca una mezcla de 20 a 40 moscas jóvenes machos y hembras en un recipiente de puesta.Manténgalos en una cámara humedecida a 25 grados Celsius. Para estimar con precisión la etapa de desarrollo del embrión, la temperatura y la humedad deben ser constantes. Aunque existen recipientes comerciales para puesta, estos pueden construirse a partir de vasos de plástico perforados de 100 ml que encajan sobre placas de agar de 60 milímetros.La receta del sacabocado de manzana se puede encontrar en el protocolo escrito. Las perforaciones en el vaso de precipitados pueden realizarse con una sonda calentada y deben ser más pequeñas que las moscas adultas. Los medios se suplementan con una dosis de pasta de levadura, lo que estimulará a las hembras a poner muchos huevos; mezcle la levadura con agua hasta obtener una consistencia similar a la de la mantequilla de maní, y luego extiéndala sobre los medios con una espátula.Cambie la placa dos veces al día, sacudiendo las moscas de la placa. Ahora puedo colocar una placa nueva y devolverla al incubador. Pero mientras tanto, podría verificar cuántos huevos se han puesto aquí para el tercer día.Un buen potro debe producir entre 100 y 200 huevos por hora, con la mayor producción de huevos entre el amanecer y la mañana avanzada. Para facilitar la recolección, realice rayones o marcas con un cincel en el tornillo sinfín de la placa de recolección; la mayoría de los huevos se pondrán dentro o junto a los rayones en este procedimiento. Se permite que las moscas pongan huevos durante una a dos horas, de modo que se puedan recolectar embriones en estadios tardíos, aunque este periodo variará según el experimento.Los métodos de recolección de embriones también variarán según la cantidad de embriones necesarios para el experimento. Para la disección y la electrofisiología, se necesitan relativamente pocos embriones, en cuyo caso pueden recogerse suavemente de las placas con pinzas finas. Para eliminar el corion externo, enjuague los embriones con agua destilada y colóquelos en un recipiente que contenga lejía fresca al 50-100%, monitoreando los embriones bajo un microscopio de disección.Después de 30 a 120 segundos, el corión se disolverá, exponiendo la membrana vital brillante y transparente. Dado que el lejía puede destruir rápidamente los tejidos vitales, los huevos desclorinados deben enjuagarse brevemente o colocarse en solución salina. Coloque los huevos desclorinados en una placa de cultivo de plástico que contenga agua destilada.En este momento, se pueden genotipar visualmente mediante la detección de marcadores GFP con un microscopio de disección de fluorescencia y los filtros adecuados; tras separar los embriones de interés, continúe con la disección. Dado que los embriones son demasiado pequeños para usar alfileres de disección, se requiere una preparación avanzada. Los embriones más viejos con cutículas desarrolladas deben pegarse a cubreobjetos recubiertos con sogar utilizando pegamento quirúrgico o veterinario de cianoacrilato, también conocido como histo aal.El azul funciona bien porque se polimeriza al entrar en contacto con una solución que contiene iones divalentes. Comience la disección transfiriendo un embrión de interés a una laminilla recubierta con forma de puro bajo una gota de solución salina, con su lado dorsal hacia arriba. Retire la membrana vitelina realizando una pequeña incisión en la membrana con una micropipeta de vidrio o una aguja de tungsteno.Luego, libere suavemente el embrión de la membrana. Los embriones en estadios tempranos se adherirán directamente al vidrio limpio o al vidrio recubierto con poli-L-lisina. Para embriones más desarrollados, adhiera los portaobjetos recubiertos con sardina mediante la aplicación de pegamento quirúrgico a través de una pipeta de vidrio pequeña conectada a un tubo de goma.El flujo del pegamento se controla con la boca. Utilice pequeñas cantidades de pegamento para fijar firmemente la cabeza y la cola. Hágalo con cuidado porque el pegamento se mezcla rápidamente en la solución salina.Para diseccionar el embrión estabilizado, perfore suavemente una línea a lo largo de la línea media dorsal con un electrodo de vidrio o una aguja de tungsteno afilada. Con la misma herramienta, realice una incisión cortando a través de las perforaciones. Es fundamental que la aguja de disección siempre se mantenga en un ángulo poco profundo para evitar dañar la musculatura neuroventral.A continuación, retire los órganos internos utilizando succión suave con la boca desde una pipeta de vidrio conectada a un tubo de goma. Extienda el embrión de forma plana usando más pegamento para fijar los bordes de la incisión sobre la cubreobjetivo. Una vez que todos los órganos internos han sido eliminados mediante succión, se exponen el sistema nervioso central ventral, los nervios periféricos y la musculatura somática para su experimentación.En este momento, el embrión está listo para realizar grabaciones electrofisiológicas o puede fijarse para inmunohistoquímica y microscopía posterior mediante técnicas convencionales. Acabamos de mostrarle cómo aislar y diseccionar embriones desde estadios más avanzados hasta embriones más blandos. La aplicación de adhesivo quirúrgico y la disección de los embriones resultarán frustrantes al principio, pero no existen trucos secretos.Es necesario desarrollar las habilidades motoras finas mediante la práctica durante varias semanas, pero gradualmente aumentará el porcentaje de disecciones exitosas. Por favor, consulte nuestro otro video de geo, que detalla las configuraciones de grabación de células musculares y neuronas motoras. Eso es todo.Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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