Name: Registro electrofisiológico en el Drosophila Embrión (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Aprende a realizar registros electrofisiológicos en embriones de Drosophila para estudiar propiedades eléctricas de músculos y neuronas en desarrollo. Este método permite caracterizar la sinaptogénesis funcional en distintas sinapsis del sistema nervioso.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Registro electrofisiológico de embriones de Drosophila requiere de la manipulación manual y la disección. La salud de la preparación y la calidad como consecuencia de las grabaciones, depende de un ser capaz de preparar de forma rápida y ordenada de los tejidos frágiles embrionarias para la grabación, y luego ejecutar el experimento. Experimentadores debe dominar tanto la disección de embriones y la electrofisiología de patch clamp antes de tratar de hacer frente a ambos a la vez. L...

registro electrofisiológico en el drosophila embrión

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophila es un modelo genético de primera para el estudio de ambos el desarrollo embrionario y funcional neurociencia. Tradicionalmente, estos campos son muy aislados unos de otros, con historias en gran medida independiente y la comunidad científica. Sin embargo, la relación entre estos campos por lo general diferentes programas de desarrollo es la base de adquisición de las propiedades funcionales de señalización eléctrica y la diferenciación de las sinapsis químicas funcional durante las fases finales de la formación de circuitos neuronales. Esta interfaz es una zona muy importante para la investigación. En Drosophila, estas fases de desarrollo funcional se producen durante un período de &lt;8 horas (a 25 ° C) durante el último tercio de la embriogénesis. Este período de desarrollo tardío fue considerado durante mucho tiempo difíciles de investigación debido a la deposición de una cutícula dura, epidérmico impermeable. Un avance avance fue la aplicación de agua de polimerización pegamento quirúrgico que puede aplicarse localmente a la cutícula para permitir la disección controlada de la última etapa de embriones. Con una incisión longitudinal dorsal, el embrión puede ser en plano, dejando al descubierto el cordón nervioso ventral y la musculatura de la pared del cuerpo para la investigación experimental. Plenario de células patch-clamp técnicas se pueden utilizar para grabar en las neuronas de forma individual de identificación y los músculos somáticos. Estas configuraciones de grabación se han utilizado para realizar un seguimiento de la aparición y maduración de las corrientes iónicas y la propagación del potencial de acción, tanto en las neuronas y los músculos. Mutantes genéticos que afectan a estas propiedades eléctricas se han caracterizado para revelar la composición molecular de los canales iónicos y complejos de señalización asociados, y para empezar la exploración de los mecanismos moleculares de la diferenciación funcional. Se prestará especial atención ha sido el montaje de las conexiones sinápticas, tanto en el sistema nervioso central y la periferia. El glutamatérgica unión neuromuscular (UNM) es más accesible a una combinación de imágenes ópticas y de registro electrofisiológico. Un electrodo de succión de vidrio se utiliza para estimular el nervio periférico, con la excitación de unión actual (EJC) las grabaciones realizadas en la tensión de los enganches del músculo. Esta configuración de la grabación se ha utilizado para trazar la diferenciación funcional de la sinapsis, y realizar un seguimiento de la aparición y maduración de las propiedades de liberación de glutamato presináptica. Además, las propiedades postsinápticos se puede probar de forma independiente a través de iontoforesis o la aplicación de presión de glutamato directamente a la superficie del músculo, para medir la aparición y maduración de los campos receptores de glutamato. Por lo tanto, ambos elementos pre y postsinápticos se puede controlar por separado o en combinación durante la sinaptogénesis embrionarias. Este sistema ha sido muy utilizada para aislar y caracterizar mutantes genéticos que impiden la formación de sinapsis embrionario, por lo que revelan los mecanismos moleculares que regulan la especificación y diferenciación de las sinapsis y conexiones sinápticas propiedades funcionales de señalización.

Registros electrofisiológicos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriones permite realizar análisis musculares y de las propiedades eléctricas de neuronas, así como la caracterización funcional de la sinaptogénesis en la unión neuromuscular y glutamatérgicas centrales colinérgicas y las sinapsis GABAérgicas.

Registro electrofisiológico en el Drosophila Embrión

Drosophila es un modelo genético fundamental para el estudio tanto del desarrollo embrionario como de la neurociencia funcional. Tradicionalmente, estos campos son bastante...

Se pueden obtener grabaciones electrofisiológicas de músculos y neuronas motoras a partir de la pared corporal de un embrión de oph adecuadamente preparado. Es posible grabar fácilmente de las células completas de los músculos 6, 7, 12 o 13, y se pueden medir corrientes de amplitud miniatura robustas tras lograr un sello de gigaohmios para grabar de la unión neuromuscular. Se puede utilizar un electrodo de succión para aspirar un nervio motor cerca del punto de salida del SNC y aplicar estimulación pre-sináptica mientras se miden las corrientes en toda la célula en el músculo post-sináptico.Alternativamente, se puede usar una pipeta para administrar neurotransmisores excitadores cerca del electrodo de registro mediante iontoforesis o eyección por presión. Hola, soy Ton del Laboratorio de Dave en el Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad de Illinois en Chicago. Hoy les mostraré cómo registrar electrofisiológicamente la unión neuro-muscular del embrión en estadio de salate y las neuronas centrales.Estos procedimientos que estamos utilizando para estudiar la función y el desarrollo del sistema neuromuscular de joof. Estas técnicas fueron desarrolladas originalmente por Kendall Brody. Pasaron luego a David Fit Stone y después a mí; hoy se los transmitiré a ustedes.Este procedimiento requiere que los embriones sean debidamente recolectados y diseccionados con anticipación. Para ver cómo se lleva a cabo esto, consulte la publicación acompañante de JoVE por Brody Featherstone y Chen. Las grabaciones electrofisiológicas de músculos y neuronas embrionarias de Jossa utilizan técnicas estándar de registro de parche en célula completa. Primero, el embrión diseccionado se coloca en una pequeña cámara de registro de plexiglás.El área de grabación de la fisiología está aislada eléctricamente mediante una jaula de Faraday y colocada sobre una mesa amortiguada contra vibraciones. La cámara se observa con luz transmitida utilizando un microscopio compuesto invertido con óptica KY y un objetivo de inmersión en agua de 40 x con larga distancia de trabajo. Las grabaciones objetivas se realizan típicamente por debajo de la temperatura ambiente, ya que resulta cada vez más difícil realizar el registro con microelectrodos de oclusión en músculos oculomotores a medida que aumenta la temperatura.El electrodo de registro debe tener una resistencia final de cinco a 10 megaohmios y debe pulirse térmicamente hasta un diámetro interno de aproximadamente un micrómetro. En la punta, los electrodos de registro se rellenan en sentido retrógrado con una solución fisiológica que contiene cloruro de potasio y sacarosa. Un alambre de plata clorurada a tierra se coloca en el baño que contiene solución salina estándar, la cual también se utiliza en la disección de embriones.Las señales se amplifican utilizando un amplificador de parche con clamp, se filtran y se almacenan digitalmente para su posterior análisis. Se puede utilizar cualquier sistema adecuado para experimentos de parche con clamp, como este equipo y software de Axon. Instrumentos celulares de tres tejidos diferentes en el sistema nervioso embrionario ahora pueden ser estimulados y registrados a partir de las neuronas musculares en la JM y neuronas motoras centrales.Con esta preparación del embrión, se puede registrar cualquier músculo embrionario en la mayoría de los experimentos. Enfóquese en el grupo de cuatro músculos longitudinales ventrales 6, 7, 12 y 13, particularmente en el músculo 6 en el abdomen anterior, de A2 a A3, para registrar los músculos dorsales. El embrión debe pegarse con el lado dorsal hacia abajo y disecarse a lo largo de la línea media ventral en embriones jóvenes.No se necesita tratamiento enzimático antes de la grabación muscular. Sin embargo, en embriones posteriores con cutículas desarrolladas, también se desarrolla una vaina muscular antes de la grabación mediante parche. Esta vaina debe eliminarse mediante inmersión breve en colagenasa.La mayoría de las grabaciones se realizan en la configuración de registro de célula íntegra, que se logra fácilmente a partir del estado de célula unida mediante una ligera succión o una descarga eléctrica. Eso es un impulso. Es una estimulación eléctrica, ya sabes, para romper la membrana celular.En un registro de célula completa, las resistencias de sello en el músculo suelen ser superiores a un gigaohmio; las corrientes de célula completa generalmente se obtienen en menos de tres minutos tras la formación del sello. La resistencia aumenta notablemente en la mayoría de los casos y las células pueden desarrollar una mayor fuga. Para realizar el registro mediante parche, los embriones deben tener al menos 14 horas de edad, ya que en etapas de desarrollo más tempranas no es posible.El acoplamiento eléctrico extenso entre los miotubos hará que el bloqueo de voltaje sea inexacto para realizar grabaciones con electrodo de parche en fibras musculares. Los potenciales de retención típicos oscilan entre -60 y -80 milivoltios, y se pueden utilizar métodos de bloqueo de voltaje y bloqueo de corriente. Grabaciones exitosas de célula completa a -60 milivoltios van acompañadas de corrientes sinápticas espontáneas robustas que varían desde unos pocos hasta varios cientos de picoamperios, como las mostradas aquí.Se pueden evocar corrientes grandes de la JMn estimulando el nervio motor con electrodos de succión. Estos pueden extraerse de una variedad de electrodos de vidrio rellenos de fibra y deben pulirse con llama para lograr la configuración deseada, utilizando succión suave para introducir en la pipeta un pequeño segmento del nervio motor segmentario apropiado cerca del punto de salida del SNC. Para formar un sello hermético, la estimulación breve funciona mejor con una intensidad determinada experimentalmente, generalmente entre uno y cinco voltios. Se logra una estimulación confiable ajustando la intensidad del estímulo uno o dos voltios por encima del umbral determinado experimentalmente.Los receptores de glutamato en la sinapsis postsináptica pueden activarse aplicando el neurotransmisor glutamato; moléculas cargadas como el glutamato pueden administrarse a la JNM mediante iontoforesis. Se utilizan pipetas de alta resistencia para mapear los receptores y pipetas de menor resistencia para estimar la respuesta total de los receptores de glutamato. Las pipetas iontoforéticas se cargan con una solución de L-glutamato 100 milimolar.Para liberar el L-glutamato, utilice un pulso breve de corriente negativa con una pequeña corriente positiva de respaldo para prevenir fugas. El glutamato o cualquier molécula no cargada también pueden administrarse a la JM mediante eyección por presión. Para la eyección por presión, use glutamato de uno a dos milimolares y aplique una fuerza hacia afuera de cinco a 10 PSI al pipeta, utilizando un pico spritzer.La corriente de la JM evocada por la estimulación nerviosa o la aplicación de glutamato a menos 60 milivoltios suele ser de 1500 a 2000 picoamperios. Muchas neuronas embrionarias pueden identificarse individualmente según la posición del soma y la morfología de las proyecciones. La mayoría de los registros experimentales se han centrado en un grupo de cinco neuronas dorsales superficiales dentro del cordón nervioso ventral embrionario.Para realizar el registro en estas neuronas, la vaina del neuroma del cordón nervioso ventral debe eliminarse mediante un tratamiento focal breve con proteasa; los cuerpos celulares se desvainan aplicando del 0,5 al 1 % de proteasa en el medio de registro, utilizando una pipeta de parche de gran diámetro para aspirar el material de la vaina hacia la pipeta que contiene la proteasa. Puede utilizarse una succión suave con la boca para introducir y extraer repetidamente la vaina dentro y fuera de la pipeta. Después de uno o dos minutos, la vaina se romperá.Las células ahora están expuestas para el registro de parche total en células enteras. Este paradigma de registro no requiere que la salina sea circulada o calentada. La salina externa para el registro en esta preparación es diferente de la utilizada en el registro desde músculos.La pipeta de registro puede cargarse con amarillo de Lucifer para visualizar posteriormente la posición y la morfología de la célula registrada. Aquí se muestra una neurona motora central que ha incorporado amarillo de Lucifer y que se ha visualizado mediante microscopía de fluorescencia. Se realizan registros en configuración de voltaje en todo el citoplasma a potenciales de mantenimiento de menos 60 milivoltios a 18 grados Celsius.También son posibles las grabaciones en régimen de corriente constante. Las neuronas pueden estimularse con neurotransmisores, como acetilcolina o GABA. Estos se aplican en el soma celular mediante iontoforesis o eyección por presión, tal como se hace al grabar de NJS.Una vez que se ha establecido una conexión de célula íntegra, primero se observan corrientes espontáneas. Este es un minuto de datos brutos obtenidos del músculo longitudinal ventral embrionario seis, fijado en -60 milivoltios mediante el método de parche en ausencia de estimulación. Una preparación saludable muestra típicamente una intensa actividad sináptica espontánea representada aquí por las numerosas desviaciones de la corriente hacia abajo.Aquí hay datos del mismo músculo con estimulación aplicada mediante una pipeta de succión sobre el nervio motor que inerva a ese músculo. Esto produjo múltiples desviaciones descendentes de la corriente que representan corrientes joncionales evocadas o e jcs. Estos son datos del mismo músculo estimulado mediante glutamato de un milimolar aplicado mediante eyección por presión.El glutamato abre los receptores, lo que provoca grandes desviaciones hacia abajo. En la corriente actual se muestran dos trazas que representan dos aplicaciones sucesivas de glutamato. Acabo de mostrarle cómo realizar registros electrofisiológicos a partir de embriones de geo soft en etapa tardía; el registro electrofisiológico utiliza generalmente técnicas estándar de "patch clamp", que no podemos describir aquí en profundidad.En ideal, cualquier persona que desee realizar grabaciones a partir de sus embriones blandos ya habrá aprendido la técnica del registro de parche utilizando una preparación más sencilla. Eso es todo. Gracias por ver y buena suerte con sus experimentos minutos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video muestra el procedimiento para el aislamiento de los cerebros de los adultos Drosophila todo en la preparación para la grabación de las neuronas individuales utilizando la tecnología estándar de células enteras. Incluye imágenes de las células GFP etiquetados y las neuronas visto durante la grabación.

Las grabaciones de células enteras del cerebro del adulto de Drosophila

A continuación se describen los métodos electrofisiológicos para la medición de la transmisión sináptica en la unión neuromuscular de larvas de Drosophila. Liberación evocada se inicia artificialmente mediante la estimulación de los axones de la neurona motora, y la transmisión a través de la UNM se puede medir por la respuesta postsináptica evocado en el músculo.

Los métodos electrofisiológicos para la grabación de los potenciales sinápticos de la UNM de larvas de Drosophila

Esta técnica expone al neuromusculatura Drosophila embrionarias para inmunohistoquímica o de registro electrofisiológico. Es útil para el estudio de los primeros eventos en el desarrollo neuromuscular o la realización de electrofisiología en los mutantes que no pueden eclosionar.

La recolección y preparación de Drosophila Los embriones de registro electrofisiológico y otros procedimientos

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