Name: Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-14T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Aprende a teñir proteínas en geles de poliacrilamida con Coomassie G-250 sin disolventes orgánicos ni ácido acético. Este protocolo simplificado permite visualizar bandas proteicas en un minuto con resultados claros y reproducibles.

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Nos gustaría agradecer la asistencia técnica de Inés Racke.

Parte 1: Preparación de la solución de tinción CBB <ol><li> 60-80 mg de CBB G-250 se disuelven en 1 litro de agua bidestilada por agitación durante 2-4 horas. Por último, 3 ml de HCl concentrado, se añade a la solución de color azul oscuro con agitación durante un minuto y se almacena en la oscuridad para su uso posterior. La solución se puede almacenar durante varias semanas hasta varios meses sin perder su eficacia manchas. </li><li> HCl concentrado debe ser manejado con el cuidado habitual und usada bajo una campana de humos. La solución final será aproximadamente a pH 2, por lo que se debe utilizar guantes y cualquier contacto con la piel debe ser evitado. </li></ol> Parte 2: SDS-PAGE <ol><li> Alícuotas apropiadas de muestras de proteínas se mezclan con tampón de carga a una concentración final de tampón de carga 1x. Usamos tampón de carga 2x 125mm Tris/H3PO4 (pH 7,5 a 25 ° C), 2 mM EDTA, SDS al 4%, DTT 200 mM, azul de bromofenol 0,02% y el 50% de glicerol. Otros tampones de carga para SDS-PAGE se puede usar también. </li><li> Las muestras de proteínas se calientan durante unos 5 minutos antes de la carga. Mientras tanto, la cámara de electroforesis en gel se prepara para la carrera. Usamos NuPAGE prefabricados 12.04% © Bis-Tris geles (Invitrogen) en un SureLock XCell ® Mini-Cell (Invitrogen), con economía de mercado-buffer como el funcionamiento de amortiguación, pero cualquier otro gel y el sistema de electroforesis se puede utilizar también. </li><li> Las muestras de proteínas se cargan en el gel y la electroforesis en una duración de 50 minutos a 220V. </li></ol> Parte 3: La tinción del gel <ol><li> El gel cassette está desmontada y el gel en una caja para los pasos posteriores de lavado. </li><li> Cerca de 100 ml de agua bidestilada se añade el gel y se calienta en el microondas durante 30 segundos. Calefacción debe detenerse antes de la ebullición se produce. La caja con el gel se coloca en un agitador durante 3-5 min. y este paso de lavado se repite dos veces con agua fresca. </li><li> Suficiente solución de tinción CBB se añade a cubrir el gel en la caja y la caja se calienta en el microondas durante 10 segundos. sin hervir. La caja con el gel se coloca en un agitador para el acabado de la tinción. Ya después de 1 minuto, las bandas de proteínas se puede observar, después de 15-30 min. la tinción es lo suficientemente fuerte como en la mayoría de los casos. </li><li> La solución colorante se escurre y 50-100 ml de agua bidestilada, se añade con el fin de destain aún más la luz de fondo azul del gel en un agitador. El agua puede ser sustituida por agua dulce para la decoloración más si es necesario. </li><li> El gel puede ser escaneado, fotografiado o secas para almacenamiento a largo plazo </li></ol> Parte 4: Resultados del representante: Ver fig. 1 para un gel teñido correctamente siguiendo el procedimiento descrito. Ver fig. 2 para un gel que no se ha lavado el tiempo suficiente antes de la tinción y coloración residual SDS inhibe eficiente. Tenga en cuenta que los carriles marcador (*) contienen la misma cantidad de proteínas marcadoras. <img src="/files/ftp_upload/1350/Fig1.png" alt="" /> Fig. 1: Representante manchadas gel después de cargar las muestras de una purificación de proteínas (*: marcador de peso molecular). <img src="/files/ftp_upload/1350/Fig2.png" alt="" /> Fig. 2: CBB gel de colores que no se ha lavado el tiempo suficiente antes de la tinción CBB. Las bandas de proteínas aparecen más débiles (nótese que el carril * marcador contiene la misma cantidad de proteínas como en la fig. 1).

<ol><li>Process for fast visualization of protein. US patent. , 6319720 (B1) (2001).</li>
<li>Solution for fast visualization of protein. US patent. , 2001046709 (A1) (2001).</li>
</ol>

No hay conflicto de intereses. El procedimiento descrito anteriormente fue publicado originalmente en la solicitud de patente por EM Wondrak (ver ref.).

<ul><li> Los pasos de lavado son fundamentales para la tinción eficiente de las proteínas. Una reducción del tiempo de lavado por debajo de 2 min o disminución del volumen de agua (&lt;50 ml) puede dar lugar a bandas de proteínas pálido azul, muy probablemente debido a una mayor cantidad de residuos SDS en el gel. </li><li> Si las proteínas van a ser analizados por espectrometría de masas, los pasos de calentamiento en el horno de microondas debe ser omitido, el tiempo para el lavado del gel extendido a unos 10 minutos en cada paso y el tiempo ...

<table><tbody><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td><td>AppliChem</td><td>A3480</td><td>se podría utilizar igualmente cualquier otro CBB G-250</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico concentrado</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tinción de las proteínas en geles con coomassie g-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

En los protocolos clásicos de proteínas tinción con Coomassie Brilliant Blue (CBB), las soluciones con un alto contenido de disolventes orgánicos tóxicos e inflamables (metanol, etanol o 2-propanol) y ácido acético se utilizan para la fijación, tinción y decoloración de las proteínas en un gel de SDS después -PAGE. Para acelerar el procedimiento, el calentamiento de la solución de tinción en el horno de microondas por un corto período de tiempo se utiliza con frecuencia. Esto usualmente resulta en la evaporación de metanol tóxicos o peligrosos, etanol o 2-propanol y un fuerte olor a ácido acético en el laboratorio que deben evitarse por motivos de seguridad. En un protocolo publicado originalmente en dos solicitudes de patente por EM Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), una composición alternativa de la solución de tinción se describe en la que no solvente orgánico o ácido se utiliza. El CBB se disuelve en agua bidestilada (60-80mg de CBB G-250 por litro) y 35 mM HCl se agrega como el único compuesto otros en la solución de tinción. El CBB staning del gel se realiza después de SDS-PAGE y minuciosamente del gel en agua bidestilada. Al calentar el gel durante el lavado y la tinción de pasos, el proceso puede terminar más rápido y no compunds tóxicos o peligrosos se evapora. La tinción de las proteínas ocurre ya dentro de 1 minuto después de calentar el gel en solución de tinción y se desarrolla completamente después de 15-30 minutos con un fondo azul que es un poco desteñido por completo por el lavado prolongado del gel teñido con agua bidestilada, sin afectar a la proteína manchado bandas.

Un protocolo corto para la tinción de proteínas con Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 en geles de poliacrilamida se describe sin el uso de disolventes orgánicos o en ácido acético como en los procedimientos clásicas de tinción con CBB.

Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

En los protocolos clásicos de tinción de proteínas mediante Coomassie Brilliant Blue (CBB), las soluciones con altas concentraciones de solventes orgánicos tóxicos e inflamables...

Para comenzar este procedimiento, se disuelve Kumasi Brilliant Blue o CBG dos 50 en un litro de agua bidestilada agitando durante dos a cuatro horas. Posteriormente, se añade ácido clorhídrico a la solución de color azul oscuro agitando durante otro minuto, y la solución se almacena en la oscuridad para su uso posterior. Tras la preparación de la muestra proteica y la electroforesis en STS, se desarma la cubeta de gel y se coloca el gel en una caja para realizar tres pasos sucesivos de lavado con agua bidestilada.Después del tercer paso de lavado, el agua se reemplaza con suficiente solución de tinción con CBB para cubrir el gel en la caja. La caja se calienta en el microondas durante 10 segundos, y luego se coloca la caja con el gel sobre un agitador. Para completar la tinción, las bandas proteicas pueden observarse después de un minuto.Hola, soy Amri Lawrence del centro de expresión y purificación de proteínas de Emberin Heidelberg. Hoy les mostraremos un protocolo para teñir proteínas con azul brillante de Coomassie G-250 en geles de cloruro. A diferencia de los métodos clásicos de tinción, nuestro protocolo no utiliza disolventes orgánicos ni ácido acético.Utilizamos este proto

staining-proteins-gels-with-coomassie-g-250-without-organic-solvent

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Después de la separación por métodos de electroforesis, las proteínas en un gel puede ser detectado por varios métodos de tinción. Tinción de las proteínas con azul de Coomassie, tinción de plata, naranja SYPRO, Ruby SYPRO se muestran en este video.

Tinción de proteínas en geles de

Este vídeo se popularizar un Coomassie coloidal G-250 protocolo de tinción de acuerdo con...

Rápido y sensible coloidal Coomassie G-250 La tinción de proteínas en geles de poliacrilamida

Usando glicosidasas específicas para eliminar los azúcares de las glicoproteínas seguido de SDS-PAGE es un método útil para detectar las modificaciones de glicanos de las muestras de proteínas y es una buena opción para los estudios de glicobiología inicial. Siguientes cambios deglicosilación pueden ser detectados como cambios en la movilidad en gel o por tinción con glicano reactivos sensibles.

Identificación y caracterización de la glicosilación de proteínas específicas de uso de endo-y exoglicosidasas

En este video, demostramos un procedimiento para la tinción combinada de azul alcián y plata de fragmentos de oligosacáridos de glicosaminoglicanos sulfatados. Esta técnica de tinción combinada amplifica significativamente las bandas de polímeros de glicosaminoglicanos de diferentes longitudes en geles de poliacrilamida.

Tinción de plata de glicosaminoglicanos sulfatados: un método de tinción para la visualización de glicosaminoglicanos sulfatados en geles de poliacrilamida

Con el fin de explorar exhaustivamente la diversidad de glicanos ligados a O, se aplica un nuevo procedimiento para la eliminación de β reductor en gel, combinado con permetilación y un método rápido de partición de fase, al análisis de glicanos ligados a O liberados directamente de glicoproteínas resueltas por SDS-PAGE y susceptibles de análisis glicómico posterior por espectrometría de masas.

Mejora En-gel β-eliminación para ligada al O y exhaustiva sulfo-glycomics reductoras de Espectrometría de Masas

Aquí, presentamos una electroforesis en gel bidimensional (2DE) acoplada con espectrometría de masas (MS) para separar e identificar adenoma pituitario humano tejido proteoma, que presenta un patrón de 2DE buena y reproducible. Muchas proteínas se observan en cada punto de 2DE al analizar el proteoma del complejo del cáncer con el uso de MS de alta sensibilidad.

Electroforesis en Gel bidimensional juntada con métodos de espectrometría de masas para el análisis del proteoma de tejido humano Adenoma pituitario

La arquitectura de complejos de la proteína es esencial para su función. Combinando varias técnicas de espectrometría de masa probado poderoso para el estudio de su montaje. Ofrecemos protocolos de reticulación química y espectrometría de masas nativa y mostrar cómo estas técnicas complementarias ayudan a dilucidar la arquitectura de los conjuntos de multi-subunidades de proteína.

La combinación de reticulación química y espectrometría de masas de complejos de proteína intacta para el estudio de la arquitectura de multi-subunidades proteína asambleas

Aquí, describimos un protocolo detallado que un fluorescente nuevo coloración técnica para la detección de la proteína total en geles de poliacrilamida. El protocolo utiliza una sonda de encendido plata de iones específicos de fluorescencia que detecta Ag+-complejos de proteínas y elimina ciertas limitaciones de manchas plata cromogénicos tradicionales.

Tinción fluorescente de plata de proteínas en geles de poliacrilamida

Este protocolo se centra en la identificación de proteínas que se unen a fosfatos de inositol o fosfoinosítidos. Utiliza cromatografía de afinidad con fosfatos de inositol biotinylados o fosfoinositidos que se inmovilizan a través de estreptavidina a agarosa o cuentas magnéticas. Las proteínas de unión de fosfato de inositol o fosfoinositida se identifican por la hincha occidental o espectrometría de masas.

Identificación de fosfato de inositol o proteínas que interactúan con fosfoinositida por cromatografía de afinidad acoplada a Western Blot o espectrometría de masas

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Este protocolo describe una técnica para el análisis de supercomplejos respiratorios cuando solo se dispone de pequeñas cantidades de muestras.

Aislamiento de mitocondrias para el análisis de supercomplejos mitocondriales a partir de muestras de pequeños tejidos y cultivos celulares 

Aprende a teñir proteínas en geles de poliacrilamida con Coomassie G-250 sin disolventes orgánicos ni ácido acético. Este protocolo simplificado permite visualizar bandas proteicas en un minuto con resultados claros y reproducibles.

Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

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