Name: Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-14T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Aprende a teñir proteínas en geles de poliacrilamida con Coomassie G-250 sin disolventes orgánicos ni ácido acético. Este protocolo simplificado permite visualizar bandas proteicas en un minuto con resultados claros y reproducibles.

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Nos gustaría agradecer la asistencia técnica de Inés Racke.

Parte 1: Preparación de la solución de tinción CBB <ol><li> 60-80 mg de CBB G-250 se disuelven en 1 litro de agua bidestilada por agitación durante 2-4 horas. Por último, 3 ml de HCl concentrado, se añade a la solución de color azul oscuro con agitación durante un minuto y se almacena en la oscuridad para su uso posterior. La solución se puede almacenar durante varias semanas hasta varios meses sin perder su eficacia manchas. </li><li> HCl concentrado debe ser manejado con el cuidado habitual und usada bajo una campana de humos. La solución final será aproximadamente a pH 2, por lo que se debe utilizar guantes y cualquier contacto con la piel debe ser evitado. </li></ol> Parte 2: SDS-PAGE <ol><li> Alícuotas apropiadas de muestras de proteínas se mezclan con tampón de carga a una concentración final de tampón de carga 1x. Usamos tampón de carga 2x 125mm Tris/H3PO4 (pH 7,5 a 25 ° C), 2 mM EDTA, SDS al 4%, DTT 200 mM, azul de bromofenol 0,02% y el 50% de glicerol. Otros tampones de carga para SDS-PAGE se puede usar también. </li><li> Las muestras de proteínas se calientan durante unos 5 minutos antes de la carga. Mientras tanto, la cámara de electroforesis en gel se prepara para la carrera. Usamos NuPAGE prefabricados 12.04% © Bis-Tris geles (Invitrogen) en un SureLock XCell ® Mini-Cell (Invitrogen), con economía de mercado-buffer como el funcionamiento de amortiguación, pero cualquier otro gel y el sistema de electroforesis se puede utilizar también. </li><li> Las muestras de proteínas se cargan en el gel y la electroforesis en una duración de 50 minutos a 220V. </li></ol> Parte 3: La tinción del gel <ol><li> El gel cassette está desmontada y el gel en una caja para los pasos posteriores de lavado. </li><li> Cerca de 100 ml de agua bidestilada se añade el gel y se calienta en el microondas durante 30 segundos. Calefacción debe detenerse antes de la ebullición se produce. La caja con el gel se coloca en un agitador durante 3-5 min. y este paso de lavado se repite dos veces con agua fresca. </li><li> Suficiente solución de tinción CBB se añade a cubrir el gel en la caja y la caja se calienta en el microondas durante 10 segundos. sin hervir. La caja con el gel se coloca en un agitador para el acabado de la tinción. Ya después de 1 minuto, las bandas de proteínas se puede observar, después de 15-30 min. la tinción es lo suficientemente fuerte como en la mayoría de los casos. </li><li> La solución colorante se escurre y 50-100 ml de agua bidestilada, se añade con el fin de destain aún más la luz de fondo azul del gel en un agitador. El agua puede ser sustituida por agua dulce para la decoloración más si es necesario. </li><li> El gel puede ser escaneado, fotografiado o secas para almacenamiento a largo plazo </li></ol> Parte 4: Resultados del representante: Ver fig. 1 para un gel teñido correctamente siguiendo el procedimiento descrito. Ver fig. 2 para un gel que no se ha lavado el tiempo suficiente antes de la tinción y coloración residual SDS inhibe eficiente. Tenga en cuenta que los carriles marcador (*) contienen la misma cantidad de proteínas marcadoras. <img src="/files/ftp_upload/1350/Fig1.png" alt="" /> Fig. 1: Representante manchadas gel después de cargar las muestras de una purificación de proteínas (*: marcador de peso molecular). <img src="/files/ftp_upload/1350/Fig2.png" alt="" /> Fig. 2: CBB gel de colores que no se ha lavado el tiempo suficiente antes de la tinción CBB. Las bandas de proteínas aparecen más débiles (nótese que el carril * marcador contiene la misma cantidad de proteínas como en la fig. 1).

<ol><li>Process for fast visualization of protein. US patent. , 6319720 (B1) (2001).</li>
<li>Solution for fast visualization of protein. US patent. , 2001046709 (A1) (2001).</li>
</ol>

No hay conflicto de intereses. El procedimiento descrito anteriormente fue publicado originalmente en la solicitud de patente por EM Wondrak (ver ref.).

<ul><li> Los pasos de lavado son fundamentales para la tinción eficiente de las proteínas. Una reducción del tiempo de lavado por debajo de 2 min o disminución del volumen de agua (&lt;50 ml) puede dar lugar a bandas de proteínas pálido azul, muy probablemente debido a una mayor cantidad de residuos SDS en el gel. </li><li> Si las proteínas van a ser analizados por espectrometría de masas, los pasos de calentamiento en el horno de microondas debe ser omitido, el tiempo para el lavado del gel extendido a unos 10 minutos en cada paso y el tiempo ...

<table><tbody><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td><td>AppliChem</td><td>A3480</td><td>se podría utilizar igualmente cualquier otro CBB G-250</td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico concentrado</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tinción de las proteínas en geles con coomassie g-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

En los protocolos clásicos de proteínas tinción con Coomassie Brilliant Blue (CBB), las soluciones con un alto contenido de disolventes orgánicos tóxicos e inflamables (metanol, etanol o 2-propanol) y ácido acético se utilizan para la fijación, tinción y decoloración de las proteínas en un gel de SDS después -PAGE. Para acelerar el procedimiento, el calentamiento de la solución de tinción en el horno de microondas por un corto período de tiempo se utiliza con frecuencia. Esto usualmente resulta en la evaporación de metanol tóxicos o peligrosos, etanol o 2-propanol y un fuerte olor a ácido acético en el laboratorio que deben evitarse por motivos de seguridad. En un protocolo publicado originalmente en dos solicitudes de patente por EM Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), una composición alternativa de la solución de tinción se describe en la que no solvente orgánico o ácido se utiliza. El CBB se disuelve en agua bidestilada (60-80mg de CBB G-250 por litro) y 35 mM HCl se agrega como el único compuesto otros en la solución de tinción. El CBB staning del gel se realiza después de SDS-PAGE y minuciosamente del gel en agua bidestilada. Al calentar el gel durante el lavado y la tinción de pasos, el proceso puede terminar más rápido y no compunds tóxicos o peligrosos se evapora. La tinción de las proteínas ocurre ya dentro de 1 minuto después de calentar el gel en solución de tinción y se desarrolla completamente después de 15-30 minutos con un fondo azul que es un poco desteñido por completo por el lavado prolongado del gel teñido con agua bidestilada, sin afectar a la proteína manchado bandas.

Un protocolo corto para la tinción de proteínas con Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 en geles de poliacrilamida se describe sin el uso de disolventes orgánicos o en ácido acético como en los procedimientos clásicas de tinción con CBB.

Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

En los protocolos clásicos de tinción de proteínas mediante Coomassie Brilliant Blue (CBB), las soluciones con altas concentraciones de solventes orgánicos tóxicos e inflamables...

Para comenzar este procedimiento, se disuelve Kumasi Brilliant Blue o CBG dos 50 en un litro de agua bidestilada agitando durante dos a cuatro horas. Posteriormente, se añade ácido clorhídrico a la solución de color azul oscuro agitando durante otro minuto, y la solución se almacena en la oscuridad para su uso posterior. Tras la preparación de la muestra proteica y la electroforesis en STS, se desarma la cubeta de gel y se coloca el gel en una caja para realizar tres pasos sucesivos de lavado con agua bidestilada.Después del tercer paso de lavado, el agua se reemplaza con suficiente solución de tinción con CBB para cubrir el gel en la caja. La caja se calienta en el microondas durante 10 segundos, y luego se coloca la caja con el gel sobre un agitador. Para completar la tinción, las bandas proteicas pueden observarse después de un minuto.Hola, soy Amri Lawrence del centro de expresión y purificación de proteínas de Emberin Heidelberg. Hoy les mostraremos un protocolo para teñir proteínas con azul brillante de Coomassie G-250 en geles de cloruro. A diferencia de los métodos clásicos de tinción, nuestro protocolo no utiliza disolventes orgánicos ni ácido acético.Utilizamos este protocolo para analizar nuestras proteínas después de cada paso de purificación. Así que comencemos. Para preparar la solución de tinción con CBB, se disuelven 60 a 80 miligramos de CBB en un litro de agua bidestilada agitando durante dos a cuatro horas.Después de que el CBV se disuelva, transfiera la solución a una campana extractora. Dentro de la campana extractora, agregue cuidadosamente tres mililitros de ácido clorhídrico concentrado a la solución de color azul oscuro. Durante la agitación, que debe realizarse durante un minuto, se deben usar guantes, ya que la solución final tendrá un pH de dos.Una vez preparada la solución, se almacena en la oscuridad para su uso posterior. La solución puede conservarse durante semanas o hasta varios meses sin perder su eficacia de tinción. Para preparar muestras de proteínas para electroforesis en SDS, se mezclan alícuotas adecuadas de las muestras de proteína con tampón de carga hasta alcanzar una concentración final de un x tampón de carga; luego se calientan las muestras de proteína durante aproximadamente cinco minutos antes de cargarlas.Mientras las muestras se están calentando, se prepara la cámara de electroforesis en gel para la corrida. Utilizamos geles precocidos en una celda mini con tampón MES como tampón de corrida. Sin embargo, se puede usar cualquier otro gel y sistema de electroforesis.Las muestras de proteína calentadas se cargan luego en el gel y se electroforesan durante 50 minutos a 220 voltios. Cuando la electroforesis SDS está completa, se desarma el casete del gel y el gel se coloca en una caja con 100 mililitros de agua bidestilada. Para los pasos subsiguientes de lavado, la caja se calienta en el horno de microondas durante 30 segundos.Debe detenerse el calentamiento antes de que comience la ebullición. Después de calentar en el microondas, coloque la caja con el gel sobre un agitador durante tres a cinco minutos y repita este paso de lavado dos veces con agua fresca. Tras los tres lavados con agua, se añade solución reveladora de CBB para cubrir completamente el gel en la caja y se calienta la caja en el microondas durante 10 segundos sin que llegue a hervir.Después de eso, la caja con el gel se coloca en un agitador para completar la tinción. Las bandas proteicas pueden observarse después de un minuto y entre 15 y 30 minutos. La tinción generalmente es lo suficientemente intensa.Se vierte la solución de tinción y se añaden de 50 a 100 mililitros de agua bidestilada. Con el fin de reducir aún más el fondo azul claro del gel, se puede reemplazar el agua por agua fresca en un agitador para continuar el desentintado. Si es necesario, ahora se puede escanear, fotografiar o secar el gel para su almacenamiento a largo plazo.Un gel que se haya teñido siguiendo este procedimiento debería tener este aspecto. En este gel, las bandas proteicas están bien teñidas y claramente visibles, mientras que el fondo es despreciable.La primera banda indicada por el asterisco contiene marcadores de peso molecular. En contraste, un gel que no se lavó suficientemente antes de la tinción tendrá este aspecto. En este gel, los pasos de lavado fueron demasiado cortos, por lo que las bandas proteicas no se tiñeron adecuadamente. Obsérvese que la banda indicada por el asterisk contiene las mismas cantidades de proteína de los marcadores de peso molecular que en un gel anterior, pero muestra una tinción menos eficiente.Acabamos de mostrarle cómo teñir proteínas con azul brillante coomassie en geles de poliamida sin necesidad de utilizar disolventes orgánicos tóxicos o inflamables. Al llevar a cabo este procedimiento, es importante recordar que los pasos de lavado son fundamentales para una tinción eficiente de las proteínas. Eso es todo.Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Investigación

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Biología

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Aprende a teñir proteínas en geles de poliacrilamida con Coomassie G-250 sin disolventes orgánicos ni ácido acético. Este protocolo simplificado permite visualizar bandas proteicas en un minuto con resultados claros y reproducibles.

Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

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