Extracción de ADN de 0,22 M Filtros Sterivex y centrifugación de densidad de cloruro de cesio Gradient

Hola, soy Jody del laboratorio, Steven Hallam en el Departamento de Microbiología en inmunología de la Universidad de Columbia Británica. Hoy os mostraremos un procedimiento para extraer ADN genómico, concentrado de muestras de agua de mar en filtros STX de 0,2 micras y una purificación de este ADN mediante una centrifugación en gradiente de densidad de cloruro de cesio. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para obtener ADN ambiental que nos permita estudiar la estructura, la diversidad y el metabolismo de la comunidad microbiana en ambientes marinos.

Así que comencemos. Comienza este protocolo descongelando sobre hielo, la agitación de los filtros X que previamente has concentrado con biomasa planctónica, tratada con lisis, tampón y congelada para simplificar. Aquí describimos el procedimiento para procesar un filtro individual.

En la práctica, recomendamos procesar 15 o menos filtros a la vez. Una vez que el filtro se haya descongelado, comience la primera de dos incubaciones. Uno para liñar las células y eliminar el ARN y otro para descomponer las proteínas.

Para la primera incubación, agregue 100 microlitros de lisozima y 20 microlitros RN a al filtro. Vuelva a sellar el filtro con perfume y déjelo girar a 37 grados centígrados durante una hora. Para la siguiente incubación, agregue 100 microlitros de protein ace KN 100 microlitros 20%SDS al filtro.

Vuelva a sellar el filtro con perfil y déjelo girar una o dos horas más. Esta vez a 55 grados. Use una jeringa de cinco cc para transferir el lisado del filtro Stax a un tubo de halcón de 15 mililitros.

Enjuague el filtro con un mililitro de tampón de lisis y agregue el líquido de enjuague al lisado en su tubo falcon. Ahora que has lisado y digerido tus células, estás listo para extraer su ADN. El siguiente paso es utilizar el método del cloroformo fenol para extraer el ADN de su lisado.

Agregue un volumen igual de aproximadamente tres mililitros de fenol cloroformo, alcohol isoamílico al vórtice del tubo de lisado. Durante 10 segundos para mezclar bien, gire el tubo a 2, 500 veces G durante cinco minutos. Durante la centrifugación, la mezcla de lisado de fenol y cloroformo debe separarse en dos capas.

Una capa orgánica en la parte inferior que contiene el fenol cloroformo y las proteínas de su muestra. Y una capa acuosa, generalmente en la parte superior, que consiste en su ADN, agua y otras moléculas más hidrofílicas. Transfiera la capa acuosa que contiene su ADN a un nuevo tubo Falcon de 15 mililitros A este tubo, agregue un volumen igual de un vórtice de mezcla de cloroformo y alcohol isoamílico durante 10 segundos.

Este paso elimina cualquier fenol restante de la muestra de ADN. Gírelo 2.500 veces G durante cinco minutos o hasta que la capa acuosa esté clara. Transfiera la capa acuosa a un nuevo tubo de halcón etiquetado y agregue un mililitro de TE a PH ocho.

Ahora tienes tu extracto de ADN. El siguiente paso es lavar y concentrar la muestra de ADN en un tubo ultracentrífugo Amazon de 15 mililitros. Transfiera su muestra de ADN al compartimiento del filtro de anon.

Los tubos theon Ultra tube consisten en un filtro que retiene moléculas a un peso molecular especificado o por encima de él, el tato y un tubo para atrapar el flujo a través del filtrado. En este caso, el filtro retiene el espín de su ADN a 3.500 veces G durante 10 minutos. Verifique que haya menos de un mililitro de líquido retenido en el filtro Amon.

Si queda más reten Tate, rellene el filtro con TE y vuelva a centrifugar. Retire el flujo a través o filtre a otro tubo de halcón y guárdelo en la nevera hasta que haya confirmado su producto final en un gel, agregue dos mililitros de tampón TE al filtro Amazon y gire a 3, 500 veces G durante seis minutos. Retire el filtrado como antes.

Lave el ADN dos veces más con TE para un total de tres lavados, guardando el filtrado cada vez para el último centrifugado de lavado hasta que queden de 200 a 500 microlitros de Tate en el filtro Amon. Anote el volumen final y transfiéralo a un tubo einor de 1,5 mililitros etiquetado. Haga una alícuota de 70 microlitros del ADN concentrado lavado para usarlo como material de trabajo.

Almacene el material de trabajo a menos 20 grados centígrados. Congela el resto del ADN a menos 80 grados centígrados. Verifique la concentración de ADN y la calidad de su producto final colocando sus muestras en un gel junto al ADN.

Las escaleras, que sirven como estándares de tamaño e intensidad, configuran un gel de AROS al 0,8% más bromuro de aterio para funcionar durante la noche. En los primeros carriles de carga de escaleras con bandas de varios pesos moleculares y concentraciones, recomendamos el siguiente patrón de carga. En los dos primeros carriles, cargue 10 microlitros de un kilobyte más escalera en los siguientes tres carriles, cargue dos microlitros, cinco microlitros y 10 microlitros respectivamente de 50 nanogramos por microlitro Lambda H tres escalera.

Por último, cargue cinco microlitros por carril de muestra de extracto de ADN. Haga funcionar el gel a 15 voltios durante aproximadamente 16 horas. Fotografíe el gel utilizando el sistema de documentación de gel UV para determinar el rango de peso molecular de su ADN y su concentración.

Compare las bandas de muestra con las bandas de la escalera. El ADN de buena calidad tendrá un alto peso molecular y mostrará poca evidencia de cizallamiento o degradación. Si la calidad del ADN es buena y la cantidad es suficiente, proceda a purificar el ADN realizando un gradiente de cloruro de cesio.

Primera etiqueta de centrifugación, un tubo de centrífuga para cada muestra a cada tubo de centrífuga, agregue 160 miligramos de cloruro de cesio y 178 microlitros de ADN genómico. Cubra el tubo con un pequeño trozo de perfil e invierta suavemente el tubo de 10 a 20 veces para mezclar los componentes. No mezcle mediante pipeteo, ya que puede causar el cizallamiento del ADN.

A continuación, añada 10 microlitros de bromuro AUM al tubo y vuelva a mezclar. Asegúrese de que los tubos estén bien equilibrados antes de la centrifugación y que las diferencias de peso entre los tubos sean inferiores a un miligramo. Coloque los tubos en el rotor de ultracentrífuga con unas tijeras de pinza.

A continuación, cierre la tapa del rotor y coloque el rotor dentro de la ultracentrífuga cerca. La aspiradora de puerta ultracentrífuga se aplicará tan pronto como cierre la puerta. Funciona durante la noche durante un total de 18 horas a 100.000 RPM a 20 grados centígrados.

Cuando se complete la centrifugación, saque los tubos del rotor con unas tijeras de pinza y colóquelos en la rejilla. Lleve los tubos al transiluminador de luz azul, póngase las gafas de filtro ámbar. A continuación, encienda la luz azul y observe su banda de ADN utilizando una jeringa y aguja estéril de un cc.

Retire la banda de ADN y luego colóquela en un tubo de einor de 1,5 mililitros para ayudar a recuperar la mayor parte del ADN atrapado en el espacio muerto de la jeringa. Enjuague la jeringa con 100 microlitros y agregue la solución de enjuague al tubo. Prepare un tubo con 100 microlitros de tampón por muestra para evitar la contaminación cruzada.

Para eliminar el bromuro AUM del ADN, agregue un volumen igual de butanol saturado de agua al tubo. Invierta los tubos suavemente, centrifugue de 10 a 20 veces a 10, 000 RPM durante un minuto y deseche la capa superior. Repita el lavado unas tres o cuatro veces más hasta que el color del butanol sea transparente.

Coloque cuatro mililitros de TE en el tubo de ultracentrífuga de ancón y agregue la solución de ADN de la centrífuga superior a 3, 500 veces G a temperatura ambiente hasta que el volumen de ADN se reduzca a aproximadamente 100 a 500 microlitros y deseche el flujo a través. Agregue dos mililitros TE al filtro Amazon y centrifugue a 3.500 veces G durante seis minutos. Repita dos veces para un total de tres lavados con te concentrado hasta un volumen final de 50 a 100 microlitros mediante centrifugación adicional según sea necesario.

Y transfiera la solución de ADN en el filtro a un nuevo tubo de einor de 1,5 mililitros. Agregue 40 microlitros al filtro y pipetee hacia arriba y hacia abajo a lo largo de ambas membranas del filtro para lavar cualquier resto de ADN. Agregue esta solución al tubo de ADN concentrado.

Coloque una unidad de filtro MicroCon YM 30 en un tubo MicroCon y prelave el MicroCon agregando 200 microlitros de agua de autoclave y centrifugando a 10,000 RPM durante siete minutos. Añada la solución de ADN al MicroCon prelavado para concentrar aún más la centrífuga de ADN a 5.000 a 10.000 veces G durante uno a tres minutos. Verifique la cantidad de líquido en el filtro y repita la centrifugación hasta que la cantidad de líquido en el filtro se reduzca a aproximadamente 50 microlitros.

Coloque la unidad de filtro boca abajo en un nuevo tubo MicroCon y centrifugue a 1000 veces G durante tres minutos. La cantidad ideal de solución concentrada es de 50 a 60 microlitros. Transfiera su muestra de ADN a un nuevo tubo de einor de 1,5 mililitros.

Mida la concentración de ADN en un NanoDrop y compruebe la calidad máxima. Un gráfico de absorbancias para ADN limpio debe tener un pico claro de 260 nanómetros. Congela el resto del ADN a 80 grados centígrados negativos.

Cuando este protocolo se realiza correctamente, debería ver una imagen de gel similar a la figura uno, la concentración real de ADN de los extractos variará según la fuente de la muestra. Cuando este protocolo se realiza correctamente, debería ver claramente una banda de ADN en el centro del tubo. Al igual que en la figura dos, acabamos de mostrar cómo extraer ADN genómico de filtros sterex y purificarlo utilizando un gradiente de densidad de cloruro de cesio.

Al realizar este procedimiento, es importante verificar antes de comenzar que tiene todos los reactivos y artículos fungibles necesarios. Y en segundo lugar, planifique al menos tres días completos para tener tiempo suficiente para completar el procedimiento con cuidado. Así que eso es todo.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.