Name: Extracción de ADN de 0,22 M Filtros Sterivex y centrifugación de densidad de cloruro de cesio Gradient (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-18T05:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 14 s
Description: Aprende a extraer ADN genómico de alto peso molecular de biomasa planctónica marina usando filtros Sterivex y purificación con gradiente de cloruro de cesio. Este protocolo optimizado permite estudios de diversidad microbiana ambiental.

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Nos gustaría agradecer a la Fundación Canadiense para la Innovación, el British Columbia Fondo de Desarrollo de conocimientos y el Nacional de Ciencias e Ingeniería de Investigación (NSERC) de Canadá para apoyar los estudios en curso en las regiones de bajo nivel de oxígeno de las aguas oceánicas costeras y abiertas. JJW fue apoyado por becas de NSERC y DAW fue apoyado por becas de NSERC, Killam y la Fundación Centro TULA financiado por la diversidad microbiana y la evolución. SL fue apoyada por el Centro TULA financiado por la Fundación para la Diversidad microbiana y evolución.

Nota: Todos los reactivos utilizados en este protocolo que se distribuyan de las existencias de laboratorio que trabajan en pequeñas poblaciones-esto es muy importante para evitar la contaminación cruzada de muestras de ADN y la contaminación de las reservas de laboratorio. Además, al pipetear, asegúrese de cambiar las puntas de la pipeta para cada adición para evitar la contaminación cruzada. Primera parte: lisis celular y la digestión <ol><li> Comience este protocolo por el deshielo de los filtros que contienen Sterivex biomasa planctónica previamente concentrada en el hielo. Para simplificar, aquí se describe el procedimiento para la tramitación de un filtro individual. En la práctica, se recomienda el procesamiento de 16 o menos filtros a la vez. </li><li> Una vez que el filtro se ha derretido, comenzará el primero de dos incubaciones: una para lisar las células y eliminar el ARN, y uno para romper las proteínas. Para la primera incubación, añadir 100 l de lisozima (125 mg en 1000 l TE) y 20 ml RNasa A (10 mg / ml) en el filtro. Cerrar de nuevo el filtro con Parafilm y se deja de girar en el horno de hibridación a 37 ° C durante 1 hora. </li><li> Para la incubación siguiente, añadir 100 l de proteinasa K y 100 l 20% de SDS al filtro. Cerrar de nuevo con Parafilm y se deja de girar una o dos horas más en el horno de hibridación, esta vez a 55 ° C. </li><li> Con una jeringa de 5 cc, la transferencia del lisado del filtro Sterivex en un tubo Falcon de 15 ml. Enjuagar el filtro con una solución amortiguadora de lisis ml y agregar el líquido de enjuague para el lisado en su tubo Falcon con la jeringa de 5 cc. Ahora que ha lisan y digieren las células, usted está listo para extraer su ADN. </li></ol> Segunda parte: La extracción de ADN <ol><li> El siguiente paso es utilizar el método de fenol-cloroformo para extraer el ADN de su lisado. Añadir un volumen igual (alrededor de 3 ml) de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (IAA) en el tubo de lisado, asegurándose de que cambie la punta de la pipeta para cada Además de evitar la contaminación cruzada. Vortex durante 10 segundos para mezclar bien. </li><li> Girar el tubo a 2.500 g durante 5 minutos, asegurándose de que la centrífuga se equilibra. Durante la centrifugación, la mezcla de fenol-cloroformo-lisado se separan en dos capas: una capa orgánica que contiene el fenol cloroformo, y las proteínas de la muestra, en la parte inferior y una capa acuosa, que consiste en su ADN, el agua y otros moléculas más hidrófilas, en la parte superior. </li><li> La transferencia de la capa acuosa (que contiene el ADN) en un nuevo tubo de 15 ml Falcon. Tenga cuidado de no tocar la interfaz con la punta de la pipeta (siempre dejar una pequeña cantidad de la capa acuosa detrás). </li><li> Con este nuevo tubo, añadir un volumen equivalente (aprox. 3 ml) de cloroformo: IAA, asegurándose de que cambie la punta de la pipeta para cada Además de evitar la contaminación cruzada. Vortex durante 10 segundos. Este paso ayuda a eliminar cualquier resto de fenol a partir de su muestra de ADN. </li><li> Giran a 2500 g por 5 minutos o hasta que la capa acuosa es clara. Transferencia de fase acuosa en un nuevo tubo, llamado Falcon, y añadir 1 ml de TE pH 8.0, teniendo cuidado de no tocar la interfaz con la punta de la pipeta (siempre dejar una pequeña cantidad de la capa acuosa detrás). Esta capa acuosa contiene el extracto de ADN. </li></ol> Tercera parte: La concentración de ADN y de lavado <ol><li> El siguiente paso es lavar y concentrar la muestra de ADN en un tubo de 15 ml centrífuga Amicon Ultra. Los tubos Amicon consiste en un filtro que retiene las moléculas iguales o superiores a un peso determinado molecular (el concentrado) y un tubo para captar el flujo a través de (el filtrado). En este caso, el filtro retiene su ADN (el material retenido). Transfiere tus extraer el ADN de paso de 2,5 a el compartimiento del filtro de un tubo de Amicon Ultra. </li><li> Giran a 3500 g durante 10 minutos. Asegúrese de que hay menos de 1 ml de líquido retenido en el filtro Amicon. Si se mantiene más concentrado, vuelva a llenar el filtro con TE y girar de nuevo. Asegúrese de usar una punta de pipeta para cada TE Además de evitar la contaminación cruzada. </li><li> Retire el flujo a través, o filtrado, a otro tubo Falcon y guardarlo en la nevera hasta que haya confirmado su producto final de ADN en un gel (cuarta parte). </li><li> Añadir 2 ml de buffer TE con el filtro Amicon y giran a 3.500 g durante 6 minutos, asegurándose de usar una punta de pipeta para cada adición TE para evitar la contaminación cruzada. Piscina con filtrado que desde el paso 3.3 y guardar en la nevera. </li><li> Lavar el ADN dos veces más con TE para un total de tres lavados (asegurándose de utilizar siempre una punta de pipeta), y el ahorro del filtrado cada vez (como pasos por 3.3 y 3.4). Para el último lavado, centrifugado hasta 200 a 500 ml de los restos de material retenido en el filtro Amicon. Registre el volumen final y la transferencia del concentrado (que contiene el ADN) a una etiqueta del tubo Eppendorf de 1,5 ml. </li></ol> Cuarta parte: Determinación de la calidad del ADN <ol><li> Comprobar la calidad del ADN y estimar la concentración del ADN mediante la ejecución de sus muestras en un gel de 0,8% en gel de agarosa estacionesINED con 1 ml de bromuro de etidio (EtBr) durante la noche. (Tenga mucho cuidado cuando se utiliza bromuro de etidio, que es un mutágeno conocido y carcinógeno. Asegúrese de cambiar los guantes con frecuencia y evitar EtBr traslado al resto del laboratorio y para la piel.) Cargar las muestras de ADN junto a las escaleras, que sirven como tamaño y la intensidad de las normas (ver paso siguiente). </li><li> En el primero de varios carriles, la carga de las escaleras con bandas de diferentes pesos moleculares y concentraciones. Se recomienda el patrón de carga siguientes: en el primero y el último carril (carril externo), carga de 10 l de 50ng/μl de 1kb + o escalera 2log. En los carriles de 2,3 y 4, l carga de 2, l 5 y 10 l, respectivamente, de 50ng/μl escalera λHindIII. Por último, la carga de 5 l por vía de extracción de ADN con tinte para cada muestra. </li><li> Correr el gel a 15 voltios durante aproximadamente 16 horas (se recomienda ejecutar durante la noche). </li><li> Al día siguiente, la fotografía del gel usando un sistema de documentación de gel UV. Para determinar el rango de peso molecular de su ADN y su concentración, comparar las bandas de la muestra a las bandas de las escaleras. ADN de buena calidad se han elevado peso molecular (&gt; 36 kb), y muestran poca evidencia de corte / degradación. Véase la figura 1. </li></ol> Parte Cinco: La centrifugación gradiente de cloruro de cesio <ol><li> Si la calidad del ADN es bueno y la cantidad es suficiente, se puede proceder a purificar el ADN mediante la realización de un cloruro de cesio (CsCl) gradiente de centrifugación. Tenga en cuenta que esta etapa de purificación es opcional y no es necesario que todas las aplicaciones posteriores (por ejemplo, si desea generar bibliotecas fosmid se debe purificar, mientras que si simplemente desea llevar a cabo reacciones de PCR, la purificación no suele ser necesario). Primero, etiquete un tubo de centrífuga para cada muestra. </li><li> Para cada tubo de centrífuga, añadir 160 mg de CsCl, 178 l de ADN genómico. Después de la adición de CsCl y el ADN en el tubo, coloque un pequeño trozo de parafina en la parte superior del tubo y suavemente invierta el tubo de diez a veinte veces para mezclar los componentes. No mezclar con la pipeta, que puede causar una ruptura del ADN. A continuación, añadir 10 l de 10 mg / l EtBr a este tubo y mezclar en la misma forma. (Tenga mucho cuidado cuando se utiliza bromuro de etidio, que es un mutágeno conocido y carcinógeno. Asegúrese de cambiar los guantes con frecuencia y evitar EtBr traslado al resto del laboratorio y para la piel.) </li><li> Asegúrese de que el peso de todos los tubos están en equilibrio antes de la centrifugación de tal manera que las diferencias de peso entre los tubos son inferiores a 1 mg. </li><li> Colocar los tubos en la pinza del rotor utilizando, cierre la tapa y colocar el rotor dentro de la ultracentrífuga. </li><li> Cierre la puerta de ultracentrifugación. Vacío se aplicará tan pronto como se cierre la puerta. Realizadas por la noche a 100.000 rpm durante 18 horas y 20 ° C. </li><li> Cuando se haya completado la centrifugación, sacar los tubos del rotor con pinza hemostática y colocarla en un bastidor de tubo. </li><li> Visualizar el ADN con transiluminador de luz azul, o en su defecto, utilizar la luz UV de longitud de onda larga, en un cuarto oscuro. Use un par de gafas de filtro de color ámbar para ver la banda de ADN. Véase la figura 2. </li><li> Con una jeringa estéril de 1 cc y una aguja (26G 5 / 8), quite la banda de ADN y lo coloca en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. </li><li> Para ayudar a recuperar la mayor parte del ADN atrapado en el espacio muerto en la jeringa, enjuague la jeringa con 100 l TE y la solución de enjuagar el tubo. Preparar un tubo con 100 l de buffer TE por muestra con el fin de evitar la contaminación cruzada. </li><li> Para eliminar EtBr a partir del ADN, añadir un volumen igual de agua saturada de butanol en el tubo, invertir los tubos suavemente diez a veinte veces, se centrifuga a 10000 rpm durante 1 minuto y descartar la capa superior. </li><li> Repetir el lavado hasta que el color de butanol es transparente, 3 - 4 veces más. </li><li> Colocar 4 ml TE en un tubo de centrífuga Amicon Ultra y la solución de ADN de más arriba. </li><li> Centrifugar a 3500 g, a temperatura ambiente, hasta que el volumen del ADN se reduce a aproximadamente 100 a 500 l (aproximadamente 6-7 minutos) y descartar el filtrado. </li><li> Añadir 2 ml de TE Amicon filtro y centrifugar a 3500 g durante 6 minutos, asegurándose de usar una punta de pipeta para cada uno además de evitar la contaminación cruzada. Repita dos veces. </li><li> Concentrado a un volumen final de 50 a 100 l por centrifugación adicionales si es necesario y la transferencia de la solución de ADN en el filtro a un nuevo tubo Eppendorf de 1,5 ml. </li><li> Añadir 40 ml TE al filtro Amicon y una pipeta de arriba a abajo a lo largo de las dos membranas de filtro para lavar cualquier resto de ADN. Añadir esta solución en el tubo de 5,15. </li><li> Coloque una Microcon YM-30 unidad de filtro en un tubo de Microcon prelavado y el microcontrolador mediante la adición de 200 l agua esterilizada y centrifugar a 10.000 rpm durante 7 minutos. </li><li> Añadir la solución de ADN de 5,16 a la Microcon prelavado con el fin de concentrar aún más el ADN. Centrifugar a 5000-10000 g por 1 - 3 minutos. Compruebe la cantidad de líquidoel sistema de centrifugación de filtro y repetir hasta que la cantidad de líquido en el filtro se reduce a aproximadamente 50 microlitros. </li><li> Coloque la unidad del filtro boca abajo en un tubo de Microcon nuevas y centrifugar a 1000 g por 3 minutos. La cantidad ideal de la solución concentrada es de 50-60 l. </li><li> Medir y registrar la concentración del ADN en un Nanodrop y control de calidad del pico (deberían ser 260 nm). </li><li> Transferencia de una pequeña alícuota del ADN a un tubo eppendorf limpio para trabajar acciones y congelar a menos 20. Transferir el resto del ADN a un segundo eppendorf limpio y se congelan a menos 80. </li></ol> Los resultados representativos: Cuando este protocolo se realiza correctamente, debería ver una imagen de gel después del paso de 4,4 en la determinación de la calidad del ADN similar a la Figura 1. Concentración de ADN real de los extractos puede variar dependiendo de la fuente de la muestra. Después del paso de 5,7 centrifugación en gradiente de CsCl, el ADN genómico iluminado por la luz azul debe ser similar a la Figura 2. <img src="/files/ftp_upload/1352/1352Fig1newer.png" alt="Figura 1" /> Figura 1. Agarosa al 0,8% la imagen de electroforesis en gel de ADN de alto peso molecular recogidos en cuatro profundidades en el océano Pacífico subártico (por duplicado), se tiñeron con el agente intercalante bromuro de etidio (10 mg / ml). Gel se ha ejecutado a 15 V para ~ 16 horas en el amortiguador 1X TBE gel en funcionamiento. Las bandas de la muestra son de buena calidad que muestran poca evidencia de corte mecánico (solo muestra las bandas o manchas en lugar de múltiples bandas), si bien los extractos de 10 millones de retener parte del ARN llevan más (ver mancha en el rango de 0,5 a 2,0 Kb). <img src="/files/ftp_upload/1352/1352Fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Banda de ADN genómico iluminado por la luz azul después de centrifugación en gradiente de CsCl.

<ol><li>Beja, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+BAC+or+not+to+BAC%3A+marine+ecogenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">To BAC or not to BAC: marine ecogenomics.</a> Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).</li>
<li>Beja, O., Suzuki, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+analysis+of+bacterial+artificial+chromosome+libraries+from+a+marine+microbial+assemblage%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage.</a> Environ Microbiol. 2 (5), 516-529 (2000).</li>
<li>DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+genomics+among+stratified+microbial+assemblages+in+the+oceans+interior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior.</a> Science. 311, 496-503 (2006).</li>
<li>Stein, J. L., Marsh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+uncultivated+prokaryotes%3A+isolation+and+analysis+of+a+40-kilobase-pair+genome+fragment+from+a+planktonic+marine+archaeon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon.</a> J Bacteriol. 178 (3), 591-599 (1996).</li>
<li>Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+rapid+method+for+the+direct+isolation+of+nucleic+acids+from+aquatic+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 55 (3), 548-554 (1989).</li>
</ol>

Dependiendo de cuántas muestras se van a procesar, esto puede ser un procedimiento que consumen mucho tiempo debido a los dos pasos de la incubación de una hora, y los lavados repetidos y pasos de centrifugación. Es mejor plan de dos días para este procedimiento para dejar un montón de tiempo. Si hay problemas para conseguir el volumen de extracto final en el tubo de Amicon para reducir hasta 200-500μl durante la concentración de ADN y el lavado, trate de hacer más lavados de TE y centrifugaciones (repetir la tercera pa...

A correction was made to "<a href="/video/1352">DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation</a>". A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.
The step was corrected from:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 &#956;l lysozyme (125 mg in 1000 &#956;l TE) and 20 ml RNase A (10 &#956;g/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37&#176;C for 1 hour.
to:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 &#956;l lysozyme (125 mg in 1000 &#956;l TE) and 20 &#956;l RNase A (10 &#956;g/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37&#176;C for 1 hour.

A correction was made to <a href="/video/1352">DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation</a>. A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.

Erratum: DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

<table><tbody><tr><td>Jeringa de 1 cc (aguja 26G5/8)</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 1 ml (aguja 26G5/8)</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf de 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 15 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 5 cc</td><td>BD Biosciences</td><td>309603</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivos de filtro centrífugo Amicon&amp;#174; Ultra-4</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC801096</td><td>Límite nominal de peso molecular de 10.000</td></tr><tr><td>Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A383-1</td><td>Prepararlo saturado con agua (butanol:agua = 1:1)</td></tr><tr><td>Rotador de centrífuga, JA5.3</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>368690</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga, Avanti&amp;#174; J-E</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>369003</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de cesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4036</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo:IAA (24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25666-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro de etidio (EtBr)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510-10ml</td><td></td></tr><tr><td>Sal disódica de ácido etilendiaminotetraacético dihidratada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Horno de hibridación</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-247-10</td><td>37&amp;#x00B0;C &amp;amp; 55&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Tampón de lisis</td><td></td><td></td><td>Sacarosa 0,75 M, EDTA 40 mM, Tris 50 mM (pH 8,3)</td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876-5G</td><td>125 mg en 1000 &amp;#x03BC;l de tampón TE</td></tr><tr><td>Unidad de filtro centrífugo Microcon&amp;#174; Ultracel YM-30</td><td>EMD Millipore</td><td>42410</td><td>Umbral de corte de 50 pb</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Fenol:Cloroformo:IAA (25:24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteasa K</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr><tr><td>RNasa A</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2539-100</td><td>10 &amp;#x03BC;g/ml</td></tr><tr><td>Transiluminador de luz azul Safe Imager&amp;#8482;</td><td>Invitrogen</td><td>S37102</td><td></td></tr><tr><td>Dodecilsulfato de sodio (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td>SDS al 20%</td></tr><tr><td>Filtros Sterivex</td><td>Fisher Scientific</td><td>SVG010RS</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>Tampón TE, pH 8,0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Base Trizma&amp;#174;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Rotador de ultracentrífuga, TLA 100</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>343847</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de ultracentrífuga (7X20 mm, PC)</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>343775</td><td></td></tr><tr><td>Portatubos para ultracentrífuga</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>348302</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga, Optima&amp;#174; Max</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

extracción de adn de 0,22 m filtros sterivex y centrifugación de densidad de cloruro de cesio gradient

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

Este método se utiliza para extraer el ADN de alto peso molecular genómico a partir de biomasa planctónica se concentró en 0,22 M filtros Sterivex que han sido tratados con buffer de almacenamiento / lisis y archivados a -80 ° C, y para purificar el ADN utilizando un gradiente de densidad de cloruro de cesio. El protocolo se inicia con dos etapas de incubación de una hora para liberar el ADN de las células y eliminar el ARN. A continuación, una serie de fenol: cloroformo y cloroformo extracciones se llevan a cabo, seguido por centrifugación para separar las proteínas y los componentes de la membrana celular, la recolección del extracto acuoso de ADN, y varias medidas de cambio de amortiguación para el lavado y concentrar el extracto. Quinta Parte describe la purificación opcional a través de gradiente de densidad de cloruro de cesio. Se recomienda trabajar con menos de 15 muestras al mismo tiempo para evitar la confusión y reducir el tiempo de protocolo. El tiempo total requerido para este protocolo depende del número de muestras que se extraen. De 10 a 15 muestras y suponiendo que el equipo de centrifugación adecuada está disponible, este protocolo completo debe tomar 3 días. Asegúrese de tener los hornos de hibridación para configurar la temperatura en el inicio del proceso.

Se describe un método para la extracción de ADN de alto peso molecular genómico a partir de biomasa planctónica se concentró en 0,22 micras filtros Sterivex, seguido por centrifugación en gradiente de densidad de cloruro de cesio para la purificación.

Extracción de ADN de 0,22 M Filtros Sterivex y centrifugación de densidad de cloruro de cesio Gradient

Este método se utiliza para extraer ADN genómico de alto peso molecular a partir de biomasa planctónica concentrada en filtros Sterivex de 0,22 $\mu$M que han sido...

Hola, soy Jody del laboratorio de Steven Hallam, del Departamento de Microbiología e Inmunología de la Universidad de Columbia Británica. Hoy les mostraré un procedimiento para extraer ADN genómico concentrado a partir de muestras de agua de mar retenidas en filtros STX de 0,2 micrones, y para purificar este ADN mediante centrifugación en gradiente de densidad de cloruro de cesio. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para obtener ADN ambiental, con el fin de estudiar la estructura, diversidad y metabolismo de las comunidades microbianas en ambientes marinos.Así que comencemos. Inicie este protocolo descongelando en hielo el filtro de X que previamente ha concentrado con biomasa planctónica, tratado con tampón de lisis y congelado para mayor simplicidad. A continuación se describe el procedimiento para procesar un filtro individual.En la práctica, recomendamos procesar 15 filtros o menos a la vez. Una vez que el filtro haya descongelado, inicie la primera de dos incubaciones: una para lisar las células y eliminar el ARN, y otra para degradar las proteínas.Para la primera incubación, agregue 100 microlitros de lisozima y 20 microlitros de RNasa al filtro. Vuelva a sellar el filtro con parafina y déjelo rotar a 37 grados Celsius durante una hora. Para la siguiente incubación, agregue 100 microlitros de proteína K y 100 microlitros de SDS al 20% al filtro.Cierre nuevamente el filtro utilizando perfil y déjelo girar una o dos horas más. Este tiempo a 55 grados. Utilice una jeringa de cinco cc para transferir el lisado desde el filtro Stax a un tubo cónico de 15 mililitros.Lave el filtro con un mililitro de tampón de lisis y añada el líquido de lavado al lisado en su tubo cónico. Ahora que ha lisado y digerido sus células, está listo para extraer su ADN. El siguiente paso consiste en utilizar el método de fenol-cloroformo para extraer el ADN de su lisado.Añada un volumen igual, aproximadamente tres mililitros, de fenol cloroformo, alcohol isoamílico al tubo de lisado y vortexee durante 10 segundos para mezclar bien. Centrifugue el tubo a 2.500 ×g durante cinco minutos. Durante la centrifugación, la mezcla de lisado con fenol cloroformo debe separarse en dos capas.Una capa org&aacute;nica en la parte inferior que contiene el fenol, el cloroformo y las prote&iacute;nas de su muestra, y una capa acuosa generalmente en la parte superior, que consiste en su ADN, agua y otras mol&eacute;culas m&aacute;s hidrof&iacute;licas. Transfiera la capa acuosa que contiene su ADN a un nuevo tubo Falcon de 15 mililitros. A este tubo, agregue un volumen igual de una mezcla de alcohol isoam&iacute;lico y cloroformo, y vortexee durante 10 segundos.Este paso elimina cualquier fenol restante de su muestra de ADN. Centrifúguelo a 2.500 ×g durante cinco minutos o hasta que la capa acuosa esté clara. Transfiera la capa acuosa a un nuevo tubo cónico etiquetado y agregue un mililitro de tampón TE a pH ocho.Ahora tiene su extracto de ADN. El siguiente paso es lavar y concentrar la muestra de ADN en un tubo de ultracentrífuga Amazon de 15 mililitros. Transfiera su muestra de ADN al compartimento del filtro de anon.Los tubos ultra centrífugos consisten en un filtro que retiene moléculas de peso molecular igual o superior a un valor especificado, el tapón y un tubo para recoger el flujo del filtrado. En este caso, el filtro retiene su ADN al centrifugar a 3.500 ×g durante 10 minutos. Verifique que haya menos de un mililitro de líquido retenido en el filtro Amicon.Si queda más retenido, rellene el filtro con TE y centrifugue nuevamente. Retire el paso de filtración o filtrado a otro tubo cónico y guárdelo en el refrigerador hasta que haya confirmado su producto final en un gel. Añada dos mililitros de tampón TE al filtro Amazon y centrifugue a 3.500 × g durante seis minutos. Retire el filtrado como antes.Lave el ADN dos veces más con TE para un total de tres lavados, guardando el filtrado cada vez para la última centrifugación de lavado hasta que queden entre 200 y 500 microlitros de Tate en el filtro Amon. Anote el volumen final y transfiéralo a un tubo einor de 1,5 mililitros etiquetado. Prepare una alícuota de 70 microlitros del ADN concentrado lavado para usarla como stock de trabajo.Almacene el stock de trabajo a menos 20 grados Celsius. Congele el resto del ADN a menos 80 grados Celsius. Verifique la concentración y calidad del ADN de su producto final realizando electroforesis de sus muestras en un gel junto con ADN patrón.Escaleras que sirven como estándares de tamaño e intensidad preparan un gel de AROS al 0,8 % más bromuro de atherium para correr durante la noche. En las primeras posiciones, cargue escaleras con bandas de diversos pesos moleculares y concentraciones; recomendamos el siguiente patrón de carga. En las dos primeras posiciones, cargue 10 microlitros de la escalera de un kilobase más, y en las siguientes tres posiciones, cargue dos microlitros, cinco microlitros y 10 microlitros, respectivamente, de la escalera Lambda H tres a 50 nanogramos por microlitro.Por último, cargue cinco microlitros por pozo de la muestra de ADN extraído. Corra el gel a 15 voltios durante aproximadamente 16 horas. Fotografíe el gel utilizando el sistema de documentación de geles UV para determinar el rango de peso molecular de su ADN y su concentración.Compare las bandas de la muestra con las bandas de la escalera. El ADN de buena calidad tendrá un peso molecular alto y mostrará escasas evidencias de cizallamiento o degradación. Si la calidad del ADN es buena y la cantidad es suficiente, continúe con la purificación del ADN realizando un gradiente de cloruro de cesio.Primero, etiquete por centrifugación, un tubo de centrífuga para cada muestra; a cada tubo, añada 160 miligramos de cloruro de cesio y 178 microlitros de ADN genómico. Cubra el tubo con un pequeño trozo de perfil e inviértalo suavemente de 10 a 20 veces para mezclar los componentes. No mezcle mediante pipeteo, ya que esto podría causar rotura del ADN.Luego agregue 10 microlitros de bromuro de AUM al tubo y mezcle nuevamente. Asegúrese de que los tubos estén bien equilibrados antes de la centrifugación y de que las diferencias de peso entre los tubos sean menores a un miligramo. Coloque los tubos en el rotor del ultracentrífugo utilizando pinzas de tijera.Luego cierre la tapa del rotor y coloque el rotor dentro del ultracentrífugo. El vacío de la puerta del ultracentrífugo se aplicará tan pronto como cierre la puerta. Ejecute durante la noche durante un total de 18 horas a 100.000 RPM a 20 grados Celsius.Una vez finalizada la centrifugación, retire los tubos del rotor utilizando pinzas tijera y colóquelos en el portatubos. Lleve los tubos al transiluminador de luz azul, póngase las gafas con filtro ámbar. A continuación, encienda la luz azul y observe su banda de ADN utilizando una jeringa estéril de un cc con aguja.Retire la banda de ADN y colóquela en un tubo einor de 1,5 mililitros para ayudar a recuperar la mayor parte del ADN atrapado en el espacio muerto de la jeringa. Enjuague la jeringa con 100 microlitros de te y añada la solución de enjuague al tubo. Prepare un tubo con 100 microlitros de tampón te por muestra para prevenir la contaminación cruzada.Para eliminar el bromuro de AUM del ADN, agregue un volumen igual de butanol saturado con agua al tubo. Invierta suavemente los tubos de 10 a 20 veces, centrifugue a 10.000 RPM durante un minuto y deseche la capa superior. Repita la lavada aproximadamente tres o cuatro veces más hasta que el color del butanol sea transparente.Coloque cuatro mililitros de TE en un tubo de ultracentrífuga y agregue la solución de ADN de la centrífuga anterior a 3 500 veces G a temperatura ambiente hasta que el volumen de ADN se reduzca a aproximadamente 100 a 500 microlitros y deseche el flujo pasante. Añada dos mililitros de TE al filtro Amazon y centrifugue a 3 500 veces G durante seis minutos. Repita dos veces para un total de tres lavados con TE, concentrando hasta un volumen final de 50 a 100 microlitros mediante centrífugación adicional según sea necesario.Y transfiera la solución de ADN del filtro a un nuevo tubo Eppendorf de 1,5 mililitros. Añada 40 microlitros de TE al filtro y pipetee hacia arriba y hacia abajo a lo largo de ambas membranas del filtro para lavar cualquier resto de ADN. Añada esta solución al tubo con ADN concentrado.Coloque una unidad de filtro MicroCon YM 30 en un tubo MicroCon y prelave el MicroCon añadiendo 200 microlitros de agua autoclavada y centrifugando a 10.000 RPM durante siete minutos. Añada la solución de ADN al MicroCon prelavado para concentrar aún más el ADN, centrifugando a 5.000-10.000 veces G durante uno a tres minutos. Verifique la cantidad de líquido en el filtro y repita la centrifugación hasta que la cantidad de líquido en el filtro se reduzca a aproximadamente 50 microlitros.Coloque la unidad de filtro boca abajo en un tubo MicroCon nuevo y centrifugue a 1000 veces G durante tres minutos. La cantidad ideal de la solución concentrada es de 50 a 60 microlitros. Transfiera su muestra de ADN a un tubo einor nuevo de 1,5 mililitros.Mida la concentración de ADN en un NanoDrop y verifique la calidad del pico. Un gráfico de absorbancias para ADN limpio debe presentar un pico claro a 260 nanómetros. Congele el resto del ADN a menos 80 grados Celsius.Cuando este protocolo se realiza correctamente, debería observar una imagen de gel similar a la figura uno; la concentración real de ADN de los extractos variará según la fuente de la muestra. Cuando este protocolo se realiza correctamente, debería ver claramente una banda de ADN a lo largo del centro del tubo. Como se muestra en la figura dos, le acabamos de mostrar cómo extraer ADN genómico de filtros Sterex y purificarlo utilizando un gradiente de densidad de cloruro de cesio.Al realizar este procedimiento, es importante verificar antes de comenzar que se dispone de todos los reactivos y materiales desechables necesarios. En segundo lugar, planifique al menos tres días completos para disponer de suficiente tiempo y poder completar cuidadosamente el procedimiento. Eso es todo.Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

dna-extraction-from-022-m-sterivex-filters-cesium-chloride-density

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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La extracción de ADN de alta molecular genómico de peso de los suelos y los sedimentos

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ADN de isótopos estables de palpado (ADN-SIP)

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