Name: La normalización nació para tomografía de fluorescencia de proyección óptica de imágenes de todo corazón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 44 s
Description: Aprende el método BnOPT para tomografía de proyección óptica que mejora la reconstrucción de fluorescencia en órganos de animales pequeños. Esta técnica avanza la investigación en imagen biomédica.

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C. Vinegoni reconoce el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) de subvención 1-SR1-EB006432.

Procedimiento de imágenes El montaje experimental se muestra en detalle en la figura 1. A LS fuente de luz sirve como luz para las mediciones de absorción y como fuente de excitación para medidas de fluorescencia y se filtra con una estrecha banda de interferencia de pase BPF filtro. Un conjunto de fijos y variables de densidad neutra ND filtros combinados con la presencia de un obturador automático S permiten controlar la cantidad de luz en la muestra y que lo mantenga lo suficientemente bajo como para evitar cualquier photobleaching. Iluminación uniforme de la muestra se logra mediante el uso de un expansor de haz SER con una combinación de dos lentes del telescopio de Galileo y un difusor. El S muestra se sumerge en la solución de compensación y se mantiene en su lugar en un titular y girar sobre su eje vertical por medio de una etapa de alta velocidad de rotación (Newport, PR50) con una precisión absoluta de 0,05 grados. Tres controladores manuales distintos para permitir que el eje vertical de la muestra que se inclina y se ajusta en su plano ortogonal. La señal de la transiluminación es detectado directamente por la cámara CCD, la señal de fluorescencia se filtra a través de un filtro de interferencias de banda estrecha de paso, junto con un filtro de paso largo (Omega. óptico, de Brattleboro, VT) y luego recogió con una lente telecéntrico TL. Objetivos telecéntricos ofrecen la ventaja de proporcionar características únicas que los hacen ideales para tomografía por proyección óptica. De hecho, la presencia de una abertura parada situada en el conjunto de la lente en el punto focal de la lente asegura que los rayos, que hacen que la imagen del diafragma de apertura, se desplazará en paralelo al eje óptico que elimina prácticamente cualquier distorsión de la perspectiva y ofrecer el mismo aumento de varios planos dentro de la profundidad telecéntrico. Preparación de la muestra El siguiente procedimiento con el fin de fijar los tejidos / órganos <ol><li> Muestras se han fijado en PFA durante 8 horas a 4 ° C. </li><li> Muestra se lavó en PBS durante 15 minutos </li><li> La muestra se inserta en un bloque de agarosa 0,8% </li><li> Agarosa bloque se deshidrata a través de una serie de 20% a 100% de las soluciones de etanol. Este procedimiento de deshidratación de etanol serie ayuda a evitar cualquier contracción asimétrica de la muestra. </li><li> Por último, la muestra se incuba 10 horas en etanol al 100% con el fin de eliminar cualquier contenido de agua de la muestra. </li><li> Se coloca la muestra en una solución 1:2 de alcohol bencílico y benzoato de bencilo por el tiempo necesario para que la muestra clara. Tenga en cuenta que el tiempo puede variar considerablemente de una muestra a partir de unas pocas horas hasta varios días. </li><li> De etanol en los rastros mínima puede estar presente al final del proceso de compensación que da lugar a separar los artefactos en las reconstrucciones debido a la agitación térmica del alcohol en la solución de limpieza en sí. Con el fin de evitar este problema, un ciclo de limpieza en segundo recomendado. </li><li> Puntos 4 y 5 se debe realizar en la oscuridad para evitar el blanqueo de agentes de contraste fluorescente o las proteínas. </li></ol> Corazón de preparación de la muestra Es importante eliminar cualquier contenido de sangre de cualquier tejido antes de ser fotografiado con el fin de evitar artefactos de alta absorción en las reconstrucciones. El siguiente procedimiento se puede seguir. <ol><li> Anestesiar a los ratones con una vía intraperitoneal (IP) la inyección de una mezcla de ketamina (90 mg / kg) y xilazina (10mg/kg). Nota: &quot;. De aquí en adelante mantener la muestra protegida de la luz&quot; </li><li> Inyectar 50 U de heparina (IP) y cinco minutos más tarde, realizar una laparotomía longitudinal. </li><li> Abrir la vena renal izquierda (VRI) e infundir 20 ml de solución salina en la vena cava inferior. </li><li> El bloque de agarosa debe estar deshidratado, con cuatro, incubación de una hora, en el 20%. 40%, 60% y el 80% de etanol y, finalmente, las muestras se incuban en el 100% de etanol durante 10 horas (una noche). </li><li> El corazón se fija el procedimiento de preparación de muestras en general Nota: &quot;. De aquí en adelante mantener la muestra protegida de la luz&quot; </li></ol> Reconstrucciones de absorción Reconstrucción de la absorción óptica en la ausencia de dispersión son, en general, análoga a X-CT y se puede obtener mediante un algoritmo común retroproyección filtrada radón. Las imágenes de absorción son recogidas por una cámara CCD en la transiluminación más de 360 ​​proyecciones con un ángulo de 1 grado a lo largo del eje vertical. Es conveniente para alinear el eje vertical de la paralela de la muestra a la columna de píxeles del CCD. <ol><li> Coloque el bloque de agarosa en una cámara llena con una solución de limpieza </li><li> Iluminar la muestra con un haz colimado, tanto para la excitación y las mediciones de transmisión </li><li> Rotar la muestra de más de 360 ​​proyecciones con un ángulo de 1 grado. </li><li> Adquirir imágenes en la transiluminación, tanto en la absorción (intrínseca) y longitudes de onda de fluorescencia. </li><li> Coloque una velocidad de obturación para evitar la iluminación continua y reducir la decoloración. </li><li> Utilice el bloqueo AFalgoritmo de retroproyección iltered radón para reconstruir tomográficamente la muestra </li></ol> Reconstrucciones de fluorescencia El algoritmo utilizado para la reconstrucción de absorción no es válida para la reconstrucción de la distribución de la fluorescencia y, si no se toma en cuenta la contribución de absorción de plomo a los artefactos graves. <ol><li> Proceder como se indica en el &quot;Absoprtion Reconstrucciones&quot; sección. </li><li> Adquirir al mismo tiempo tanto la absorción y fluorescencia </li><li> Combinar los datos en las imágenes de campo normalizado Nacido </li><li> Escriba las ecuaciones del modelo de propagación de la luz hacia longitudes de onda intrínseca y de fluorescencia. </li><li> Calcular el peso de la matriz en una malla de discretización de funciones de Green de la modelo hacia adelante </li><li> Invertir la matriz de pesos y se multiplica por el detectado imágenes normalizado campo Nacido para obtener la reconstrucción de la distribución de la fluorescencia en el objeto </li></ol>

<ol><li>Sharpe, J., Ahlgren, U., Perry, P., Hill, B., Ross, A., Hecksher-Sorensen, J., Baldock, R., Davidson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+projection+tomography+as+a+tool+for+3D+microscopy+and+gene+expression+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies.</a> Science. 296, 541-544 (2002).</li>
<li>Lee, K., Avondo, J., Morrison, H., Blot, L., Stark, M., Sharpe, J., Bangham, A., Coen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+plant+development+and+gene++in+three+dimensions+using+optical+projection+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing plant development and gene in three dimensions using optical projection tomography.</a> Plant Cell. 18, 2145-2156 (2006).</li>
<li>Oldham, M., Sakhalkar, H., Wang, Y. M., Guo, P. Y., Oliver, T., Bentley, R., Vujaskovic, Z., Dewhirst, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+whole+rodent+organs+using+optical+computed+and+emission+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of whole rodent organs using optical computed and emission tomography.</a> J. Biomed. Opt. 12, 1-10 (2007).</li>
<li>Ntziachristos, V., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+three-dimensional+fluorescence+reconstruction+of+diffuse+media+by+use+of+a+normalized+Born+approximation%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Experimental three-dimensional fluorescence reconstruction of diffuse media by use of a normalized Born approximation.</a> Opt. Lett. 26, 893-895 (2001).</li>
</ol>

la normalización nació para tomografía de fluorescencia de proyección óptica de imágenes de todo corazón

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Tomografía por proyección óptica es una técnica de imagen tridimensional que se ha introducido recientemente como una herramienta de imagen sobre todo en la biología del desarrollo y estudios de expresión génica. La técnica hace que la muestra biológica ópticamente transparente, en primer lugar a la deshidratación y después colocar en una mezcla de alcohol bencílico y benzoato de bencilo en una proporción de 2:1 (Babb o Murray solución s abierto). La técnica hace que las muestras biológicas ópticamente transparente, en primer lugar a la deshidratación en soluciones de etanol clasificado luego colocarlos en una mezcla de alcohol bencílico y benzoato de bencilo en una proporción de 2:1 (Babb o solución clara Murray s) para borrar. Después de que el proceso de compensación de la contribución de la dispersión en la muestra se puede reducir considerablemente y de hecho casi insignificante, mientras que la contribución de la absorción no puede ser eliminada por completo. Al tratar de reconstruir la distribución de la fluorescencia en la muestra investigada, esta contribución afecta a las reconstrucciones y conduce, inevitablemente, a los artefactos de la imagen y los errores de cuantificación .. Mientras que la absorción podría reducirse aún más con una permanencia de varias semanas o meses en los medios de compensación, esto conducirá a una pérdida progresiva de la fluorescencia y un tiempo de procesamiento de la muestra exageradamente largo. Esto es cierto cuando la reconstrucción de los agentes de contraste exógenos (agentes de contraste molecular), así como el contraste endógenos (por ejemplo, la reconstrucción de la expresión genética proteínas fluorescentes).

Le sugerimos un enfoque normalizado para Nacido Tomografía de Proyección Óptica (BnOPT) que da cuenta de las propiedades de absorción de las muestras de imágenes para obtener reconstrucciones de fluorescencia precisa y cuantitativa tomográfica. Usamos el algoritmo propuesto para reconstruir la distribución de fluorescencia de la sonda molecular dentro de los órganos de pequeños animales.

La normalización nació para tomografía de fluorescencia de proyección óptica de imágenes de todo corazón

La tomografía de proyección óptica es una técnica de imagen tridimensional que se ha introducido recientemente como una herramienta de imagen principalmente en el desarrollo...

Con el fin de realizar una tomografía de proyección óptica normalizada, primero se fija la muestra y se incrusta en un cilindro de agarosa. Luego, la muestra se rota alrededor de un eje vertical y se ilumina uniformemente con una longitud de onda de excitación, y se mide la transmisión con una cámara CCD y óptica adecuada. La señal fluorescente a la longitud de onda se mide en modo de transiluminación.Las imágenes de fluorescencia y absorción adquiridas se utilizan para determinar la razón de Born normalizada y reconstruir la distribución de los fluoróforos dentro de la muestra. Hola, me llamo Claudia Naone y trabajo en los Centros de Biología de Sistemas del Hospital General de Massachusetts, Escuela Médica de Harvard. Soy Danielle Raki del Instituto de Imagen Biológica y Médica de la Universidad Técnica de Múnich y del Al Center Múnich.Soy Giselle Fido. Soy directora de Experimentos su Co aquí en C-M-I-C-S-B, Hospital General de Massachusetts, Escuela de Medicina de Harvard. Hoy les mostraremos un procedimiento para la obtención de imágenes en tiempo real de órganos completos fuera del cuerpo, utilizando el enfoque normalizado de Born para la tomografía de proyección óptica.Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la distribución de sondas moleculares fluorescentes en órganos huecos. Comencemos. Este video explicará el procedimiento para utilizar la tomografía de proyección óptica con el fin de obtener imágenes de tejidos u órganos preparados, junto con un video complementario.Explicamos cómo utilizar este sistema para realizar imágenes de lapso de tiempo en drosófila en desarrollo. La técnica de imagen tridimensional denominada tomografía de proyección óptica requiere una combinación única de óptica y una plataforma giratoria. En esta parte del video, se explicará el procedimiento de imagen.Para comenzar, la fuente de luz principal sirve como origen tanto para mediciones de iluminación como de absorción, y para proporcionar excitación fluorescente en mediciones de fluorescencia; primero, la fuente de luz principal se filtra mediante un filtro de interferencia de banda estrecha. A continuación, la luz atraviesa un conjunto de filtros neutros de densidad fijos y variables. Estos se combinan con la presencia de un obturador automático para controlar la cantidad de luz sobre la muestra y mantenerla lo suficientemente baja como para evitar cualquier fotoblanqueo.Se logra una iluminación uniforme de la muestra utilizando un expansor de haz y una lente telescópica glan combinada con una lente difusora. Finalmente, se utilizan filtros ópticos de interferencia de banda estrecha para purificar ópticamente la luz de la fuente de excitación. La muestra se sumerge en una solución transparentante y se mantiene en su lugar para la adquisición de imágenes dentro de un tubo de vidrio.La muestra se rota a lo largo de su eje vertical mediante una plataforma de rotación de alta velocidad con una precisión absoluta de 0,05 grados. Tres controladores manuales independientes permiten inclinar y ajustar el eje vertical de la muestra en su plano ortogonal. La señal absorbente se adquiere en iluminación transmitida y es detectada directamente por una cámara CCD.La señal fluorescente se filtra a través de un filtro de interferencia de banda estrecha, acoplado con un filtro de paso largo, y luego se recoge con una lente telecéntrica. Las lentes tele ofrecen la ventaja de proporcionar características únicas que las hacen ideales para la tomografía de proyección óptica.La presencia de un diafragma de apertura ubicado dentro del ensamblaje del lente en el punto focal del lente es fundamental. Asegura que la imagen viaje paralela al eje óptico. Esto elimina la distorsión de perspectiva y proporciona una ampliación uniforme en múltiples planos focales dentro de la profundidad telecéntrica.El siguiente segmento de video describe una técnica para la preparación de muestras. A continuación, se presentará la metodología utilizada para la obtención de imágenes. La preparación del tejido u órgano de muestra para la obtención de imágenes tomográficas se basa en una deshidratación con etanol que evita la contracción asimétrica.Este proceso tarda varios días en completarse. En este video, se prepara un corazón de ratón, aunque el protocolo puede aplicarse a cualquier tejido u órgano. Demostraremos nuestro método de imagen de fluorescencia utilizando el corazón de un animal que ha sufrido una infartación controlada.En otras palabras, una pérdida del suministro sanguíneo que conduce a una necrosis tisular evidente de forma anticipada. Al ratón se le ha inyectado pro desde seis 80 en act sensores fluorescentes que informan sobre la actividad de la catepsina en la cicatrización. Miocardio anestesiar al ratón para la perfusión y extrusión del corazón mediante una inyección intraperitoneal de ketamina y xilacina. Luego inyectar 50 unidades de heparina por vía intraperitoneal para prevenir la coagulación.Cinco minutos después, realice la laparotomía longitudinal en el animal completamente anestesiado para extraer la sangre. Primero, abra la vena renal izquierda. Ahora inyecte lentamente 20 mililitros de solución salina en la vena cava inferior.La solución salina desplaza la sangre después de lavar completamente toda la sangre bajo un microscopio estereoscópico. Continúe utilizando métodos operativos estándar para abrir la cavidad torácica y extraer el corazón. Ahora, fije el corazón durante ocho horas en PFA al 4 % a cuatro grados Celsius.A partir de este momento, los pasos de preparación del tejido deben realizarse en la oscuridad para evitar el blanqueo de cualquier agente de contraste fluorescente o proteínas aplicados al tejido. Cuando la fijación esté completa, retire el PFA con un lavado de 15 minutos en PBS; luego, el corazón limpio se incrusta en una capa de agarosa al 0,8 %. Una vez que la agarosa se seca, se corta la agarosa alrededor del tejido para formar una pieza en forma de bloque.A continuación, deshidrate el corazón aros encriptado mediante una serie de cinco pasos que consiste en remojarlo primero en etanol al 20 %, luego en concentraciones progresivamente mayores de etanol y finalmente en etanol puro. Este procedimiento de deshidratación ayuda a evitar cualquier contracción asimétrica de la muestra. Los primeros cuatro baños en etanol diluido deben realizarse durante una hora y el baño final en etanol al 100 % debe realizarse durante al menos 10 horas.Una vez finalizados los tratamientos con etanol, coloque la muestra en la solución de aclarado de Murray hasta que la muestra se vuelva transparente, lo cual varía desde unas pocas horas hasta varios días. Esta solución de aclarado imita el agua celular y tiene un índice que coincide con el de las membranas celulares, haciendo así que el tejido se vuelva transparente. Pueden quedar trazas mínimas de etanol al final del proceso de aclarado, lo que puede generar varios artefactos en las reconstrucciones debido al movimiento térmico del alcohol dentro de la propia solución de aclarado.Para evitar este problema, se recomienda un segundo ciclo de clarificación. Este no debería tomar más de cuatro horas. Una vez completado, la muestra está lista para la proyección óptica.Tomografía con la ayuda de un ordenador. La reconstrucción de la absorción óptica en ausencia de dispersión de la luz se puede obtener utilizando un algoritmo común de retroproyección filtrada de Radon. Este proceso es análogo a la tomografía computarizada de rayos X en dos dimensiones.Coloque el bloque de aeros en la cámara de imagen transparente llena con la solución de clarificación. Ahora monte la cámara sobre la platina e ilumine la muestra con un haz colimado para realizar mediciones de excitación y transmisión. La elección de la fuente de excitación depende de la proteína fluorescente o del agente de contraste molecular de imagen elegido.Es conveniente alinear el eje vertical de la muestra paralelo a la columna de píxeles del CCD. Gire la muestra durante 360 proyecciones utilizando incrementos angulares de un grado, y adquiera imágenes en cada ángulo en iluminación transmitida a ambas longitudes de onda, la de absorción y la de fluorescencia. El software que controla la adquisición regula automáticamente el obturador de la fuente de luz principal para evitar la iluminación continua y reducir el fotoblanqueo de la muestra.El obturador es especialmente importante cuando se requieren tiempos largos de integración para crear una reconstrucción 3D a partir de los datos de absorción. Simplemente utilice un algoritmo de retroproyección de Radon filtrado para la reconstrucción 3D a partir de las imágenes fluorescentes. Deben tenerse en cuenta otras contribuciones de absorción, las cuales se describen en el siguiente segmento del video.Después de completar los pasos necesarios para una reconstrucción de absorción, hay algunos pasos adicionales para finalizar una reconstrucción fluorescente. La reconstrucción de un mapa óptico en ausencia de dispersión de la luz se puede obtener utilizando un algoritmo común de retroproyección filtrada de Radon. El proceso es análogo a la tomografía computarizada de rayos X en dos dimensiones.Al reconstruir la distribución de fluorescencia, la absorción variable dependiente del espacio hace incorrecto el uso de la transformada inversa de Radon para retroproyectar las imágenes de fluorescencia, afectando gravemente las distribuciones obtenidas de proteínas fluorescentes o sondas moleculares fluorescentes y su capacidad de cuantificación. Cada rayo en la longitud de onda de excitación Lambda X que se emite desde una posición arbitraria de la fuente Xs se atenúa exponencialmente al atravesar el objeto imagenado.Tras la excitación, el fluorocromo ubicado en la posición X emite radiación que se filtra y recoge mediante el píxel del CCD situado en la posición XD, utilizando el sistema de lentes de imagenología telericéntrica. Aunque la fluorescencia emitida no sigue la misma trayectoria que el rayo de excitación, la intensidad registrada en cada píxel aproxima una proyección de todos los fluorocromos excitados a lo largo de toda la zona focal correspondiente a este rayo de excitación particular. Debido a la alta telericentricidad del sistema, el objeto imagenado se rota luego 360 grados y se adquieren múltiples mediciones del detector de origen, UX a la longitud de onda de excitación y UFL a la longitud de onda de emisión, mediante la cámara CCD.Estos se combinan luego bajo el campo normalizado de Born UB, definido como la relación entre ambos. La reconstrucción de la distribución del fluorocromo puede facilitarse escribiendo el modelo directo para la propagación de la luz de excitación y emisión, y la función de Green que describe la excitación. La propagación de rayos sigue una simple ley de Beer-Lambert, donde moo A es la distribución de absorción óptica determinada previamente.La intensidad de luz UX emitida desde la fuente en la posición exceso y medida por el detector en la posición XD sobre el C.C, D puede escribirse como el producto de la función verde con una constante B que depende del sistema. Luego, puede calcularse la distribución precisa de la intensidad de luz de excitación GX a lo largo de cada trayectoria de rayo. La intensidad de fluorescencia UFL detectada en el detector XD, que es estimulada por la luz emitida desde la fuente Xs, tiene en cuenta la contribución de todos los elementos excitados a lo largo de la trayectoria del rayo desde X hasta xd.El modelo directo de nuestro problema de imagen se puede escribir entonces como ub ub, donde alfa incorpora las constantes desconocidas que dependen del sistema. A continuación, el modelo directo se discretiza en la malla supuesta y se realiza una inversión para extraer la distribución del fluorocromo, adquirir tanto la señal de transmisión como la señal fluorescente y utilizar el algoritmo convencional de proyección inversa para reconstruir la muestra. Aquí se muestran reconstrucciones de tomografía óptica de proyección por transmisión y fluorescencia convencional.Se muestra una reconstrucción de un solo plano del corazón en absorción y fluorescencia. Se presenta la reconstrucción normalizada de Born y muestra la diferencia en la distribución del colorante dentro del corazón. Tras la normalización, simplemente le hemos mostrado cómo realizar el montaje para la tomografía de proyección óptica y cómo eliminar artefactos debidos a la absorción óptica en las reconstrucciones de tomografía de fluorescencia.De hecho, es muy importante tener en cuenta la necesidad de clarificar la muestra para eliminar la contribución de la luz dispersada, pero al mismo tiempo también es importante equilibrar el proceso de clarificación para conservar, en lo posible, la contribución de la fluorescencia. Otra cosa muy importante que hay que recordar al utilizar este enfoque es calcular la relación normalizada del hueso, que se obtiene dividiendo las imágenes de fluorescencia por las de absorción. Eso es todo.Gracias por unirse a nuestro experimento visualizado y mucha suerte con sus propios experimentos.

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