La normalización nació para tomografía de fluorescencia de proyección óptica de imágenes de todo corazón
2 de junio de 2009
Le sugerimos un enfoque normalizado para Nacido Tomografía de Proyección Óptica (BnOPT) que da cuenta de las propiedades de absorción de las muestras de imágenes para obtener reconstrucciones de fluorescencia precisa y cuantitativa tomográfica. Usamos el algoritmo propuesto para reconstruir la distribución de fluorescencia de la sonda molecular dentro de los órganos de pequeños animales.
Con el fin de realizar una tomografía de proyección óptica normalizada, primero se fija la muestra y se incrusta en un cilindro de agarosa. Luego, la muestra se rota alrededor de un eje vertical y se ilumina uniformemente con una longitud de onda de excitación, y se mide la transmisión con una cámara CCD y óptica adecuada. La señal fluorescente a la longitud de onda se mide en modo de transiluminación.
Las imágenes de fluorescencia y absorción adquiridas se utilizan para determinar la razón de Born normalizada y reconstruir la distribución de los fluoróforos dentro de la muestra. Hola, me llamo Claudia Naone y trabajo en los Centros de Biología de Sistemas del Hospital General de Massachusetts, Escuela Médica de Harvard. Soy Danielle Raki del Instituto de Imagen Biológica y Médica de la Universidad Técnica de Múnich y del Al Center Múnich.
Soy Giselle Fido. Soy directora de Experimentos su Co aquí en C-M-I-C-S-B, Hospital General de Massachusetts, Escuela de Medicina de Harvard. Hoy les mostraremos un procedimiento para la obtención de imágenes en tiempo real de órganos completos fuera del cuerpo, utilizando el enfoque normalizado de Born para la tomografía de proyección óptica.
Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la distribución de sondas moleculares fluorescentes en órganos huecos. Comencemos. Este video explicará el procedimiento para utilizar la tomografía de proyección óptica con el fin de obtener imágenes de tejidos u órganos preparados, junto con un video complementario.
Explicamos cómo utilizar este sistema para realizar imágenes de lapso de tiempo en drosófila en desarrollo. La técnica de imagen tridimensional denominada tomografía de proyección óptica requiere una combinación única de óptica y una plataforma giratoria. En esta parte del video, se explicará el procedimiento de imagen.
Para comenzar, la fuente de luz principal sirve como origen tanto para mediciones de iluminación como de absorción, y para proporcionar excitación fluorescente en mediciones de fluorescencia; primero, la fuente de luz principal se filtra mediante un filtro de interferencia de banda estrecha. A continuación, la luz atraviesa un conjunto de filtros neutros de densidad fijos y variables. Estos se combinan con la presencia de un obturador automático para controlar la cantidad de luz sobre la muestra y mantenerla lo suficientemente baja como para evitar cualquier fotoblanqueo.
Se logra una iluminación uniforme de la muestra utilizando un expansor de haz y una lente telescópica glan combinada con una lente difusora. Finalmente, se utilizan filtros ópticos de interferencia de banda estrecha para purificar ópticamente la luz de la fuente de excitación. La muestra se sumerge en una solución transparentante y se mantiene en su lugar para la adquisición de imágenes dentro de un tubo de vidrio.
La muestra se rota a lo largo de su eje vertical mediante una plataforma de rotación de alta velocidad con una precisión absoluta de 0,05 grados. Tres controladores manuales independientes permiten inclinar y ajustar el eje vertical de la muestra en su plano ortogonal. La señal absorbente se adquiere en iluminación transmitida y es detectada directamente por una cámara CCD.
La señal fluorescente se filtra a través de un filtro de interferencia de banda estrecha, acoplado con un filtro de paso largo, y luego se recoge con una lente telecéntrica. Las lentes tele ofrecen la ventaja de proporcionar características únicas que las hacen ideales para la tomografía de proyección óptica.
La presencia de un diafragma de apertura ubicado dentro del ensamblaje del lente en el punto focal del lente es fundamental. Asegura que la imagen viaje paralela al eje óptico. Esto elimina la distorsión de perspectiva y proporciona una ampliación uniforme en múltiples planos focales dentro de la profundidad telecéntrica.
El siguiente segmento de video describe una técnica para la preparación de muestras. A continuación, se presentará la metodología utilizada para la obtención de imágenes. La preparación del tejido u órgano de muestra para la obtención de imágenes tomográficas se basa en una deshidratación con etanol que evita la contracción asimétrica.
Este proceso tarda varios días en completarse. En este video, se prepara un corazón de ratón, aunque el protocolo puede aplicarse a cualquier tejido u órgano. Demostraremos nuestro método de imagen de fluorescencia utilizando el corazón de un animal que ha sufrido una infartación controlada.
En otras palabras, una pérdida del suministro sanguíneo que conduce a una necrosis tisular evidente de forma anticipada. Al ratón se le ha inyectado pro desde seis 80 en act sensores fluorescentes que informan sobre la actividad de la catepsina en la cicatrización. Miocardio anestesiar al ratón para la perfusión y extrusión del corazón mediante una inyección intraperitoneal de ketamina y xilacina. Luego inyectar 50 unidades de heparina por vía intraperitoneal para prevenir la coagulación.
Cinco minutos después, realice la laparotomía longitudinal en el animal completamente anestesiado para extraer la sangre. Primero, abra la vena renal izquierda. Ahora inyecte lentamente 20 mililitros de solución salina en la vena cava inferior.
La solución salina desplaza la sangre después de lavar completamente toda la sangre bajo un microscopio estereoscópico. Continúe utilizando métodos operativos estándar para abrir la cavidad torácica y extraer el corazón. Ahora, fije el corazón durante ocho horas en PFA al 4 % a cuatro grados Celsius.
A partir de este momento, los pasos de preparación del tejido deben realizarse en la oscuridad para evitar el blanqueo de cualquier agente de contraste fluorescente o proteínas aplicados al tejido. Cuando la fijación esté completa, retire el PFA con un lavado de 15 minutos en PBS; luego, el corazón limpio se incrusta en una capa de agarosa al 0,8 %. Una vez que la agarosa se seca, se corta la agarosa alrededor del tejido para formar una pieza en forma de bloque.
A continuación, deshidrate el corazón aros encriptado mediante una serie de cinco pasos que consiste en remojarlo primero en etanol al 20 %, luego en concentraciones progresivamente mayores de etanol y finalmente en etanol puro. Este procedimiento de deshidratación ayuda a evitar cualquier contracción asimétrica de la muestra. Los primeros cuatro baños en etanol diluido deben realizarse durante una hora y el baño final en etanol al 100 % debe realizarse durante al menos 10 horas.
Una vez finalizados los tratamientos con etanol, coloque la muestra en la solución de aclarado de Murray hasta que la muestra se vuelva transparente, lo cual varía desde unas pocas horas hasta varios días. Esta solución de aclarado imita el agua celular y tiene un índice que coincide con el de las membranas celulares, haciendo así que el tejido se vuelva transparente. Pueden quedar trazas mínimas de etanol al final del proceso de aclarado, lo que puede generar varios artefactos en las reconstrucciones debido al movimiento térmico del alcohol dentro de la propia solución de aclarado.
Para evitar este problema, se recomienda un segundo ciclo de clarificación. Este no debería tomar más de cuatro horas. Una vez completado, la muestra está lista para la proyección óptica.
Tomografía con la ayuda de un ordenador. La reconstrucción de la absorción óptica en ausencia de dispersión de la luz se puede obtener utilizando un algoritmo común de retroproyección filtrada de Radon. Este proceso es análogo a la tomografía computarizada de rayos X en dos dimensiones.
Coloque el bloque de aeros en la cámara de imagen transparente llena con la solución de clarificación. Ahora monte la cámara sobre la platina e ilumine la muestra con un haz colimado para realizar mediciones de excitación y transmisión. La elección de la fuente de excitación depende de la proteína fluorescente o del agente de contraste molecular de imagen elegido.
Es conveniente alinear el eje vertical de la muestra paralelo a la columna de píxeles del CCD. Gire la muestra durante 360 proyecciones utilizando incrementos angulares de un grado, y adquiera imágenes en cada ángulo en iluminación transmitida a ambas longitudes de onda, la de absorción y la de fluorescencia. El software que controla la adquisición regula automáticamente el obturador de la fuente de luz principal para evitar la iluminación continua y reducir el fotoblanqueo de la muestra.
El obturador es especialmente importante cuando se requieren tiempos largos de integración para crear una reconstrucción 3D a partir de los datos de absorción. Simplemente utilice un algoritmo de retroproyección de Radon filtrado para la reconstrucción 3D a partir de las imágenes fluorescentes. Deben tenerse en cuenta otras contribuciones de absorción, las cuales se describen en el siguiente segmento del video.
Después de completar los pasos necesarios para una reconstrucción de absorción, hay algunos pasos adicionales para finalizar una reconstrucción fluorescente. La reconstrucción de un mapa óptico en ausencia de dispersión de la luz se puede obtener utilizando un algoritmo común de retroproyección filtrada de Radon. El proceso es análogo a la tomografía computarizada de rayos X en dos dimensiones.
Al reconstruir la distribución de fluorescencia, la absorción variable dependiente del espacio hace incorrecto el uso de la transformada inversa de Radon para retroproyectar las imágenes de fluorescencia, afectando gravemente las distribuciones obtenidas de proteínas fluorescentes o sondas moleculares fluorescentes y su capacidad de cuantificación. Cada rayo en la longitud de onda de excitación Lambda X que se emite desde una posición arbitraria de la fuente Xs se atenúa exponencialmente al atravesar el objeto imagenado.
Tras la excitación, el fluorocromo ubicado en la posición X emite radiación que se filtra y recoge mediante el píxel del CCD situado en la posición XD, utilizando el sistema de lentes de imagenología telericéntrica. Aunque la fluorescencia emitida no sigue la misma trayectoria que el rayo de excitación, la intensidad registrada en cada píxel aproxima una proyección de todos los fluorocromos excitados a lo largo de toda la zona focal correspondiente a este rayo de excitación particular. Debido a la alta telericentricidad del sistema, el objeto imagenado se rota luego 360 grados y se adquieren múltiples mediciones del detector de origen, UX a la longitud de onda de excitación y UFL a la longitud de onda de emisión, mediante la cámara CCD.
Estos se combinan luego bajo el campo normalizado de Born UB, definido como la relación entre ambos. La reconstrucción de la distribución del fluorocromo puede facilitarse escribiendo el modelo directo para la propagación de la luz de excitación y emisión, y la función de Green que describe la excitación. La propagación de rayos sigue una simple ley de Beer-Lambert, donde moo A es la distribución de absorción óptica determinada previamente.
La intensidad de luz UX emitida desde la fuente en la posición exceso y medida por el detector en la posición XD sobre el C.C, D puede escribirse como el producto de la función verde con una constante B que depende del sistema. Luego, puede calcularse la distribución precisa de la intensidad de luz de excitación GX a lo largo de cada trayectoria de rayo. La intensidad de fluorescencia UFL detectada en el detector XD, que es estimulada por la luz emitida desde la fuente Xs, tiene en cuenta la contribución de todos los elementos excitados a lo largo de la trayectoria del rayo desde X hasta xd.
El modelo directo de nuestro problema de imagen se puede escribir entonces como ub ub, donde alfa incorpora las constantes desconocidas que dependen del sistema. A continuación, el modelo directo se discretiza en la malla supuesta y se realiza una inversión para extraer la distribución del fluorocromo, adquirir tanto la señal de transmisión como la señal fluorescente y utilizar el algoritmo convencional de proyección inversa para reconstruir la muestra. Aquí se muestran reconstrucciones de tomografía óptica de proyección por transmisión y fluorescencia convencional.
Se muestra una reconstrucción de un solo plano del corazón en absorción y fluorescencia. Se presenta la reconstrucción normalizada de Born y muestra la diferencia en la distribución del colorante dentro del corazón. Tras la normalización, simplemente le hemos mostrado cómo realizar el montaje para la tomografía de proyección óptica y cómo eliminar artefactos debidos a la absorción óptica en las reconstrucciones de tomografía de fluorescencia.
De hecho, es muy importante tener en cuenta la necesidad de clarificar la muestra para eliminar la contribución de la luz dispersada, pero al mismo tiempo también es importante equilibrar el proceso de clarificación para conservar, en lo posible, la contribución de la fluorescencia. Otra cosa muy importante que hay que recordar al utilizar este enfoque es calcular la relación normalizada del hueso, que se obtiene dividiendo las imágenes de fluorescencia por las de absorción. Eso es todo.
Gracias por unirse a nuestro experimento visualizado y mucha suerte con sus propios experimentos.
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Descripción general
Este estudio presenta un enfoque normalizado según Born para la Tomografía de Proyección Óptica (BnOPT) que mejora la precisión de las reconstrucciones tomográficas de fluorescencia al considerar las propiedades de absorción de las muestras. El método se aplica para reconstruir la distribución de sondas moleculares fluorescentes en órganos de animales pequeños.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Imágenes ópticas
- Tomografía de fluorescencia
- Imágenes biomédicas
Antecedentes
- La tomografía de proyección óptica es una técnica utilizada para obtener imágenes de muestras biológicas.
- Los métodos tradicionales pueden no tener en cuenta las propiedades de absorción, lo que lleva a inexactitudes.
- Las sondas moleculares fluorescentes son esenciales para visualizar procesos biológicos.
- Mejorar los métodos de reconstrucción puede potenciar la comprensión de las funciones orgánicas.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método que reconstruya con precisión las distribuciones de fluorescencia.
- Tener en cuenta las características de absorción de las muestras biológicas.
- Mejorar la fiabilidad de la obtención de imágenes de órganos de animales pequeños.
Métodos Utilizados
- Las muestras se fijan y se incluyen en un cilindro de tornillo sinfín.
- Las muestras se rotan e iluminan con una longitud de onda de excitación.
- Las señales fluorescentes se miden en modo de transiluminación.
- Se calcula la razón de Born normalizada para ayudar en la reconstrucción.
Resultados principales
- El método BnOPT propuesto proporciona reconstrucciones de fluorescencia precisas.
- Considera eficazmente las propiedades de absorción de las muestras.
- El método visualiza con éxito la distribución de sondas en órganos de animales pequeños.
- Los resultados demuestran una calidad de imagen mejorada en comparación con los métodos tradicionales.
Conclusiones
- El enfoque BnOPT mejora la precisión de la tomografía de fluorescencia.
- Ofrece un método confiable para estudiar muestras biológicas in vivo.
- Esta técnica puede avanzar la investigación en imágenes biomédicas y análisis de la función orgánica.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cuantificación precisa de la fluorescencia en imágenes de órganos completos es fundamental para la validación de objetivos y la reducción de riesgos mecanicistas en las primeras etapas del descubrimiento de fármacos. El método de Tomografía de Proyección Óptica normalizado por Born (BnOPT) aborda los artefactos inducidos por la absorción que comprometen la interpretación de la señal de fluorescencia, mejorando así la confianza predictiva en el análisis de la distribución de sondas. Esta capacidad permite una evaluación confiable del acoplamiento a objetivos terapéuticos y la modulación de vías en sistemas relevantes para la enfermedad.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas al proporcionar distribuciones de fluorescencia libres de artefactos de sondas moleculares en órganos intactos.
- Valor operativo: Apoya la validación funcional de dianas mediante imágenes cuantitativas de la actividad de las sondas en contextos fisiopatológicos, como modelos de infarto.
- Valor predictivo: Aumenta la confianza en los resultados de modulación de dianas al corregir la absorción variable espacialmente que de otro modo distorsionaría la cuantificación.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Prepara muestras biológicas transparentadas y estables adecuadas para estudios de imagen longitudinal que requieran lecturas de fluorescencia reproducibles.
- Valor operativo: Estandariza la preparación de muestras mediante deshidratación con etanol y aclaramiento de Murray, minimizando la contracción asimétrica y la variabilidad de la señal.
- Preparación para ensayos: Genera conjuntos de datos cuantitativos de absorción y fluorescencia que permiten cálculos de ratios normalizados, esenciales para la interpretación confiable de las señales.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Facilita la progresión desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante el mantenimiento de la integridad de la señal de fluorescencia durante sesiones prolongadas de clarificación e imagen.
- Reducción de Riesgos Mecánicos: Disminuye las conclusiones falsas sobre la distribución de sondas al tener en cuenta los efectos de absorción que pueden imitar o enmascarar señales biológicas reales.
- Fidelidad del Modelo de Enfermedad: Aplicado a corazones de ratón infartados para visualizar sondas de actividad de proteasas, apoyando la evaluación del mecanismo específico del blanco en una fisiopatología relevante.
Integración de la Secuencia de Trabajo y Flujo de Trabajo
El método BnOPT se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano tras el cribado de interacción con el blanco, proporcionando mapas cuantitativos de fluorescencia en 3D que orientan la optimización del fármaco líder y la selección del candidato preclínico.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis mediante el seguimiento longitudinal de la distribución de sondas fluorescentes en órganos intactos, sin degradación de la señal por artefactos de absorción.
- Selección: Proporciona muestras de tejido clarificado listas para ensayos, con protocolos de preparación estandarizados que garantizan la reproducibilidad entre lotes experimentales.
- Análisis: Genera relaciones de Born normalizadas (fluorescencia/absorción) que aíslan las señales de fluorescencia verdaderas de los factores de confusión por absorción, permitiendo comparaciones precisas entre grupos.
- Investigación Traducional: Se conecta con estudios preclínicos al preservar la señal de fluorescencia en muestras clarificadas a lo largo del tiempo, lo que permite correlacionar la actividad de la sonda con resultados funcionales.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de imagenología reutilizable para la cuantificación de fluorescencia en órganos completos, aplicable en múltiples áreas terapéuticas y clases de dianas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva en la validación de objetivos al eliminar errores de cuantificación mediados por absorción en la tomografía de fluorescencia.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad mediante protocolos estandarizados de clarificación (solución de Murray) y deshidratación que minimizan la variabilidad de las muestras.
- Valor estratégico: Mejora la fiabilidad de las decisiones de avance o interrupción al proporcionar lecturas espaciales precisas de la actividad del sonda molecular en órganos relevantes para la enfermedad.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización de objetivos ajustada al riesgo al reducir conclusiones falsas positivas o falsas negativas derivadas de datos de imagen sin corrección.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en imágenes ópticas, aclarado de muestras y cuantificación de fluorescencia para evitar artefactos derivados del etanol residual o un aclarado incompleto.
- Depende de sistemas ópticos telecéntricos, etapas de rotación con precisión de 0,05° y filtrado sincronizado de excitación/emisión para garantizar la fidelidad de la señal.
- Necesita la estandarización entre equipos del tiempo de aclarado y de los gradientes de etanol para asegurar un índice de refracción homogéneo y la preservación de la fluorescencia.
- La adaptación a diferentes tamaños y densidades de órganos puede requerir ajustes en el tiempo de aclarado y en la intensidad de iluminación para prevenir pérdida de señal o fotoblanqueo.
- Limitación práctica: un aclarado prolongado más allá de la duración óptima conlleva el riesgo de degradación de la fluorescencia, lo que exige ciclos de aclarado temporizados según se describe en el protocolo.
