La normalización nació para tomografía de fluorescencia de proyección óptica de imágenes de todo corazón
June 2nd, 2009
Le sugerimos un enfoque normalizado para Nacido Tomografía de Proyección Óptica (BnOPT) que da cuenta de las propiedades de absorción de las muestras de imágenes para obtener reconstrucciones de fluorescencia precisa y cuantitativa tomográfica. Usamos el algoritmo propuesto para reconstruir la distribución de fluorescencia de la sonda molecular dentro de los órganos de pequeños animales.
Para realizar la tomografía de proyección óptica de nacimiento normalizada, primero se fija la muestra y se incrusta en un cilindro de barrena. A continuación, la muestra se gira a lo largo de un eje vertical y luego se ilumina uniformemente con una longitud de onda de excitación, y la transmisión se mide con una óptica adecuada C, CD. La señal fluorescente en longitud de onda se mide en modo de transiluminación.
Las imágenes fluorescentes y de absorción adquiridas se utilizan para determinar la proporción de nacimientos normalizada y reconstruir la distribución de los cuatro fluorescentes dentro de la muestra. Hola, mi nombre es Claudia Naone y trabajo en los Centros de Biología de Sistemas del Hospital General de Masas, Facultad de Medicina de Harvard. Soy Danielle Raki, del Instituto de Imágenes Biológicas y Médicas de la Universidad Técnica de Múnich y del Centro Al de Múnich.
Soy Giselle Fido. Soy el director de Experimental su Co aquí en C-M-I-C-S-B, Massachusetts General Hospital, Harvard Med School. Hoy le mostraremos un procedimiento para la obtención de imágenes ex vivo de órganos completos en tiempo real utilizando el enfoque normalizado de Born para la tomografía de proyección óptica.
Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la distribución de la sonda molecular de fluorescencia en órganos huecos. Así que comencemos. Este video explicará el procedimiento para usar la tomografía de proyección óptica para obtener imágenes de tejidos u órganos preparados y un video que lo acompaña.
Explicamos cómo utilizar este sistema para realizar imágenes de lapso de tiempo en drosófila en desarrollo. La técnica de imagen tridimensional de la tomografía de proyección óptica requiere una combinación única de óptica y una platina giratoria. En este segmento del video, se dilucidará el procedimiento de imagen.
Para empezar, la fuente de luz primaria sirve como fuente para las mediciones de iluminación y absorción, y para proporcionar excitación fluorescente para las mediciones de fluorescencia, la fuente de luz primaria se filtra primero con un filtro de interferencia de paso de banda estrecha. A continuación, la luz pasa a través de un conjunto de filtros de densidad neutra fijos y variables. Estos se combinan con la presencia de un obturador automático para controlar la cantidad de luz en la muestra y mantenerla lo suficientemente baja como para evitar cualquier blanqueo fotográfico.
La iluminación uniforme de la muestra se logra mediante el uso de un expansor de haz y una lente de telescopio glan combinada con una lente difusora. Por último, los filtros ópticos de interferencia de paso estrecho se utilizan para limpiar ópticamente la luz de la fuente de excitación. La muestra se sumerge en una solución de limpieza y se mantiene en su lugar para obtener imágenes dentro de un tubo de vidrio.
La muestra se gira a lo largo de su eje vertical mediante una etapa de rotación de alta velocidad con una precisión absoluta de 0,05 grados. Tres controladores manuales distintos permiten inclinar y ajustar el eje vertical de la muestra en su plano ortogonal. La señal absorbente se adquiere en la iluminación trans y es detectada directamente por una cámara CCD.
La señal fluorescente se filtra a través de un filtro de interferencia de paso de banda estrecha, junto con un filtro de paso largo y luego se recoge con una lente telecéntrica. Los teleobjetivos ofrecen la ventaja de proporcionar características únicas que los hacen ideales. Para tomografía óptica de proyección.
La presencia de un tope de apertura ubicado dentro del conjunto de la lente en el punto focal de la lente es clave. Asegura que la imagen viajará paralela al eje óptico. Esto elimina la distorsión de la perspectiva y proporciona un aumento igual en muchos planos focales dentro de la profundidad telecéntrica.
El siguiente segmento de vídeo describe una técnica para preparar muestras. A esto le seguirá la metodología utilizada para la obtención de imágenes. La preparación de la muestra, el tejido o el órgano para la toma de imágenes se basa en una deshidratación de la muestra basada en etanol que evita la contracción asimétrica.
Este proceso tarda muchos días en completarse. En este video, se prepara un corazón de ratón, pero el protocolo se puede aplicar a cualquier tejido u órgano. Demostraremos nuestro método de imágenes de fluorescencia utilizando el corazón de un animal que ha sufrido un infarto controlado.
En otras palabras, una pérdida del suministro de sangre que conduce a una necrosis tisular evidente antes de tiempo. El ratón ha sido inyectado con pro desde seis sensores fluorescentes de 80 inact que informan sobre la actividad de la catepsina en la curación. Anestesia del miocardio al ratón para su perfusión y extrusión cardíaca mediante una inyección intraperitoneal de ketamina y xilacina, luego inyecte 50 unidades de heparina intraperitoneal para evitar la coagulación.
Cinco minutos después, realizar la laparotomía longitudinal en el animal completamente anestesiado para extraer la sangre. Primero, abra la vena renal izquierda. Ahora inyecte lentamente 20 mililitros de solución salina en la vena cava inferior.
La solución salina desplaza la sangre después de eliminar toda la sangre bajo un microscopio de disección. Continúe usando los métodos operativos estándar para abrir el tórax y extraer el corazón. Ahora, fije el corazón durante ocho horas en 4% de PFA a cuatro grados centígrados.
A partir de este momento, los pasos de preparación del tejido deben realizarse en la oscuridad para evitar el blanqueo de cualquier agente de contraste fluorescente o proteínas aplicadas al tejido. Cuando se complete la fijación, lave el PFA con un enjuague de 15 minutos en PBS, el corazón limpio se incrusta en una piscina de 0.8%aros. Una vez que el aros se seca, la agarosa se corta alrededor del tejido para hacer una forma de bloque.
A continuación, deshidrate el corazón encriptado aros a través de una serie de cinco pasos de primer remojo en etanol al 20%, luego concentraciones progresivamente más altas de etanol y, finalmente, etanol puro. Este procedimiento de deshidratación ayuda a evitar cualquier contracción asimétrica de la muestra. Los primeros cuatro baños en etanol diluido deben realizarse durante una hora y el baño final en etanol al 100% debe realizarse durante al menos 10 horas.
Una vez que se completen los tratamientos con etanol, coloque la muestra en la solución clara de Murray hasta que la muestra se aclare, lo que varía de unas pocas horas a varios días. Esta solución de limpieza imita el agua celular y el índice coincide con las membranas celulares, lo que hace que el tejido sea transparente. El etanol en trazas mínimas puede estar presente al final del proceso de limpieza, dando lugar a varios artefactos en las reconstrucciones debido al movimiento térmico del alcohol dentro de la propia solución de limpieza.
Para evitar este problema, se recomienda un segundo ciclo de limpieza. Esto no debería tomar más de cuatro horas. Una vez completada, la muestra está lista para la proyección óptica.
Tomografía con la ayuda de una computadora. La reconstrucción de la absorción óptica en ausencia de dispersión de la luz se puede obtener utilizando un algoritmo común de retroproyección de radón filtrado. Este proceso es análogo a la tomografía computarizada de rayos X bidimensional.
Coloque el bloque de aeros en la cámara de imágenes transparente llena de la solución de limpieza. Ahora monte la cámara en el escenario, ilumine la muestra con un haz intercalado para las mediciones de excitación y transmisión. La elección de la fuente de excitación se basa en la proteína fluorescente elegida o en el agente de contraste de imágenes moleculares.
Es conveniente alinear el eje vertical de la muestra paralelo a la columna de píxeles del CCD. Gire la muestra a lo largo de 360 proyecciones utilizando incrementos angulares de un grado, adquiera imágenes en cada ángulo con iluminación trans tanto en las longitudes de onda de absorción como de fluorescencia. El software que ejecuta la adquisición controla automáticamente el obturador en la fuente de luz principal para evitar la iluminación continua y reducir el blanqueo fotográfico de la muestra.
El obturador es especialmente importante cuando se requieren largos tiempos de integración para crear una reconstrucción 3D a partir de los datos de absorción. Basta con utilizar un algoritmo de retroproyección de radón filtrado para la reconstrucción en 3D a partir de las imágenes fluorescentes. Hay que tener en cuenta otros aportes de absorción, que se describen en el siguiente segmento de vídeo.
Después de completar los pasos necesarios para una reconstrucción por absorción, hay algunos pasos más para completar una reconstrucción fluorescente. La reconstrucción de un mapa óptico en ausencia de dispersión de la luz se puede obtener utilizando un algoritmo común de retroproyección de radón filtrado. El proceso es análogo a la tomografía computarizada de rayos X bidimensional.
Al reconstruir la distribución de fluorescencia. La absorción variable dependiente del espacio hace incorrecto el uso del radón inverso para la espalda, proyectando las imágenes de fluorescencia afectando severamente las distribuciones de proteínas fluorescentes o sondas moleculares fluorescentes obtenidas y su capacidad de cuantificación. Cada rayo a la longitud de onda de excitación Lambda X que se emite desde una posición de fuente arbitraria Xs, se atenúa exponencialmente a medida que pasa a través del objeto de la imagen.
Después de excitar, el fluorocromo ubicado en la posición X, la radiación en la longitud de onda de emisión es filtrada y recogida por el píxel CCD ubicado en la posición XD utilizando el sistema de lentes de imágenes Teleric. Aunque la fluorescencia emitida no sigue el mismo camino que el rayo de excitación, la intensidad registrada en cada píxel se aproxima a una proyección de todos los fluorocromos excitados a lo largo de toda la zona focal correspondiente a este rayo de excitación en particular. Debido a la alta telecentricidad del sistema, el objeto fotografiado se gira 360 grados y las mediciones del detector de múltiples fuentes, UX en la longitud de onda de excitación y UFL en la longitud de onda de emisión se adquieren con la cámara CCD.
A continuación, se combinan bajo el campo de nacimiento normalizado UB, definido como la razón de los dos. La reconstrucción de la distribución del cromo fluorado se puede facilitar escribiendo el modelo directo tanto para la propagación de la luz de excitación como para la propagación de la luz de emisión, la función de verdes que describe la excitación. La propagación de rayos sigue una simple ley de Lambert de Beer donde moo A es la distribución de absorción óptica previamente determinada.
La intensidad de luz UX emitida desde la fuente en la posición exceso y medida por el detector en la posición XD en el C.C, D se puede escribir como el producto de la función verde con una constante B que depende del sistema. A continuación, se puede calcular la distribución precisa de la intensidad luminosa de excitación GX a lo largo de cada trayectoria del rayo. La intensidad de fluorescencia UFL detectada en el detector XD que es estimulada por la luz emitida desde la fuente Xs tiene en cuenta la contribución de todos los theros que han sido excitados a lo largo de la trayectoria del rayo de X a xd.
El modelo directo de nuestro problema de imagen se puede escribir como ub ub, donde alpha incorpora las constantes desconocidas que dependen del sistema. A continuación, el modelo directo se discretiza en la malla supuesta y se realiza una inversión para extraer la distribución del fluorocromo, adquirir tanto la señal de transmisión como la fluorescente y utilizar el algoritmo convencional de retroproyección para reconstruir la muestra. Aquí se muestran reconstrucciones de tomografía de proyección óptica de transmisión y fluorescencia convencional.
Se muestra una reconstrucción de un solo plano del corazón tanto en la absorción como en la fluorescencia. Se presenta la reconstrucción del nacimiento normalizada y muestra la diferencia en la distribución del tinte dentro del corazón. Después de la normalización, acabamos de mostrarle cómo ser la configuración para la tomografía de proyección óptica y cómo eliminar los artefactos debidos a la absorción óptica en las reconstrucciones para la tomografía de fluorescencia.
De hecho, es muy importante tener en cuenta la limpieza de la muestra para eliminar la contribución de la luz dispersa, pero al mismo tiempo, también es importante equilibrar el proceso de limpieza para mantener la mayor cantidad posible de la contribución de fluorescencia. Otra cosa que es muy importante recordar al utilizar este enfoque es calcular la relación ósea normalizada que se obtiene dividiendo las imágenes de fluorescencia por las de absorción. Así que eso es todo.
Gracias por unirse a nuestro experimento visualizado y buena suerte con sus propios experimentos.
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Visión general
Este estudio introduce un enfoque normalizado de Born para la Tomografía de Proyección Óptica (BnOPT) que mejora la precisión de las reconstrucciones tomográficas de fluorescencia al considerar las propiedades de absorción de las muestras. El método se aplica para reconstruir la distribución de sondas moleculares de fluorescencia en órganos de animales pequeños.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Imagen óptica
- Tomografía de fluorescencia
- Imagen biomédica
Antecedentes
- La Tomografía de Proyección Óptica es una técnica utilizada para la obtención de imágenes de muestras biológicas.
- Los métodos tradicionales pueden no tener en cuenta las propiedades de absorción, lo que lleva a inexactitudes.
- Las sondas moleculares de fluorescencia son esenciales para visualizar procesos biológicos.
- Mejorar los métodos de reconstrucción puede mejorar la comprensión de las funciones de los órganos.
Propósito del estudio
- Desarrollar un método que reconstruya con precisión las distribuciones de fluorescencia.
- Tener en cuenta las características de absorción de las muestras biológicas.
- Mejorar la fiabilidad de la obtención de imágenes de órganos de animales pequeños.
Métodos utilizados
- Las muestras se fijan y se incorporan en un cilindro de barreno.
- Las muestras se rotan y se iluminan con una longitud de onda de excitación.
- Las señales fluorescentes se miden en modo de transiluminación.
- Se calcula la razón born normalizada para ayudar en la reconstrucción.
Principales resultados
- El método BnOPT propuesto proporciona reconstrucciones de fluorescencia precisas.
- Tiene en cuenta eficazmente las propiedades de absorción de las muestras.
- El método visualiza con éxito la distribución de las sondas en los órganos de animales pequeños.
- Los resultados demuestran una mejor calidad de imagen en comparación con los métodos tradicionales.
Conclusiones
- El enfoque BnOPT mejora la precisión de la tomografía de fluorescencia.
- Ofrece un método fiable para el estudio de muestras biológicas in vivo.
- Esta técnica puede avanzar en la investigación en imagen biomédica y análisis de la función de los órganos.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Accurate fluorescence quantification in whole-organ imaging is critical for target validation and mechanistic de-risking in early drug discovery. The Born normalized Optical Projection Tomography (BnOPT) method addresses absorption-induced artifacts that compromise fluorescence signal interpretation, thereby improving predictive confidence in probe distribution analysis. This capability supports reliable assessment of therapeutic target engagement and pathway modulation in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by providing artifact-free fluorescence distributions of molecular probes in intact organs.
- Operational Value: Supports functional target validation through quantitative imaging of probe activity in pathophysiological contexts such as infarction models.
- Predictive Value: Enhances confidence in target modulation readouts by correcting for spatially varying absorption that otherwise distorts quantification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares cleared, stable biological samples suitable for longitudinal imaging studies requiring reproducible fluorescence readouts.
- Operational Value: Standardizes sample preparation via ethanol dehydration and Murray’s clearing, minimizing asymmetric shrinkage and signal variability.
- Assay Readiness: Generates quantitative absorption and fluorescence datasets enabling normalized ratio calculations essential for reliable signal interpretation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Facilitates progression from discovery to preclinical validation by maintaining fluorescence signal integrity during extended clearing and imaging sessions.
- Mechanistic De-risking: Reduces false conclusions about probe distribution by accounting for absorption effects that mimic or mask true biological signals.
- Disease Model Fidelity: Applied to infarcted mouse hearts to visualize protease activity probes, supporting target-specific mechanism evaluation in relevant pathophysiology.
Pipeline & Workflow Integration
The BnOPT method integrates into early discovery workflows following target engagement screening, providing quantitative 3D fluorescence maps that inform lead optimization and preclinical candidate selection.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling longitudinal tracking of fluorescent probe distribution in intact organs without signal degradation from absorption artifacts.
- Screening: Delivers assay-ready, cleared tissue samples with standardized preparation protocols ensuring reproducibility across experimental batches.
- Analytics: Outputs normalized born ratios (fluorescence/absorption) that isolate true fluorescence signals from absorption confounders, enabling accurate inter-group comparisons.
- Translational Research: Connects to preclinical studies by preserving fluorescence signal in cleared samples over time, allowing correlation of probe activity with functional outcomes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for whole-organ fluorescence quantification applicable across multiple therapeutic areas and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in target validation by eliminating absorption-mediated quantification errors in fluorescence tomography.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized clearing (Murray’s solution) and dehydration protocols that minimize sample variability.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision reliability by providing accurate spatial readouts of molecular probe activity in disease-relevant organs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted target prioritization by reducing false-positive or false-negative conclusions from uncorrected imaging data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical imaging, sample clearing, and fluorescence quantification to avoid artifacts from residual ethanol or incomplete clearing.
- Dependent on telecentric optical systems, rotation stages with 0.05° accuracy, and synchronized excitation/emission filtering for signal fidelity.
- Necessitates cross-team standardization of clearing duration and ethanol gradients to ensure consistent refractive index matching and fluorescence preservation.
- Adaptation to diverse organ sizes and densities may require adjustments in clearing time and illumination intensity to prevent signal loss or bleaching.
- Practical limitation: prolonged clearing beyond optimal duration risks fluorescence degradation, necessitating timed clearing cycles as described in the protocol.
