Un compartimiento de Multi-CNS neuronas-glia Co-cultivo de microfluidos Plataforma

La fabricación del dispositivo microfluídico para cultivo celular conjunto de neuronas en múltiples compartimentos comienza con la definición de depósitos en el bloque de PMMA mediante una máquina de fresado, seguida de la impresión en caliente de matrices de microcanales que conectan los compartimentos. Una vez que se ha preparado el molde A-P-M-M-A, se replica a partir del molde de PMMA el molde maestro A-P-D-M-S y se recubre con tricloretileno. El dispositivo final se replica a partir del molde maestro de PDMS y se ensambla en una placa de cultivo recubierta con PDL.

Primero, neuronas primarias de rata E 16 a 18 se cargan en el compartimento del soma y se cultivan durante dos semanas antes de añadir una a dos células de oligodendrocitos de rata en la parte superior de las capas axónicas dentro del compartimento axon ggl para un cultivo conjunto. Hola, soy J Par del Laboratorio de Sistemas Nano Bio en el departamento de Ingeniería Eléctrica y Computacional de la Universidad Texas A&M. Hoy les mostraremos un procedimiento para fabricar una plataforma microfluídica de cultivo conjunto neuronal con múltiples compartimentos.

Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar in vitro la interacción entre neuronas y glía del sistema nervioso central. Comencemos. Para iniciar este procedimiento, use una fresadora micro para crear compartimentos de 3,5 milímetros de profundidad.

En el bloque A-P-M-M-A, defina un compartimento somático y seis compartimentos axónicos ggl. Después de preparar los compartimentos, someta a ultrasonido e isopropanol durante 10 minutos para eliminar los residuos, cree estructuras de microcristas sobre la lámina de vidrio mediante litografía fotográfica convencional y proceso de grabado húmedo; embosque en caliente los patrones de microcristas desde el vidrio. Deslice sobre el molde maestro de PMMA primero, alinee manualmente el molde maestro de PMMA y el sustrato de vidrio.

Luego aumente la temperatura a 115 grados Celsius en una prensa caliente. Y una vez alcanzada la temperatura, aplique un peso de 0,5 toneladas durante cinco minutos. Después de cinco minutos, enfríe hasta 40 grados Celsius y libere la presión.

Ahora comience a preparar el molde maestro de PDMS. Mezcle el prepolímero de PDMS con su agente de curado en una proporción de 10 a 1 en peso, corte el molde maestro de PMMA en bloques de 50 milímetros por 50 milímetros. Utilizando una sierra curva, colóquelo dentro de un recipiente y vierta la mezcla de PDMS encima del molde maestro de PMMA; coloque el recipiente en un desecador conectado a una bomba de vacío y DGA durante 15 minutos.

Para eliminar las burbujas generadas durante el proceso de mezcla del PDMS. Una vez eliminadas todas las burbujas, coloque el molde en un horno nivelado a 85 grados Celsius durante una hora para la polimerización. Ahora que el PDMS está completamente curado, desprenda el molde de PDMS del molde de PMMA, vaporice el molde de PDMS colocándolo dentro de un desecador con dos o tres gotas de tricloroetileno y aplique vacío durante 15 minutos.

El recubrimiento del molde maestro de PDMS facilita la liberación del dispositivo final de co-cultivo de neuronas de PDMS del molde maestro de PDMS. Después del recubrimiento, el molde maestro de PDMS se enjuaga brevemente con alcohol isopropílico para eliminar el exceso de tricloroetileno y se seca con gas nitrógeno. La fabricación del dispositivo de co-cultivo de neuronas a partir del polímero de PDMS es similar a la preparación del molde maestro de PDMS descrita en la sección anterior. Comience mezclando el prepolímero de PDMS con un agente opacificante en una proporción de 10 a 1 en peso, y luego vierta la mezcla de PDMS sobre el molde maestro de PDMS. Es importante no verter demasiado PDMS para que la estructura de PDMS de 3,5 milímetros de altura sobre el molde maestro no quede completamente sumergida.

DGA dentro de un desecador conectado a una bomba de vacío durante 15 minutos. Cuando todas las burbujas hayan sido eliminadas, coloque el PDMS dentro de un horno nivelado a 85 grados Celsius durante una hora para la polimerización. Al final de la hora, saque el PDMS del horno y déjelo enfriar a temperatura ambiente. Luego, retire suavemente los dispositivos de cultivo de neuronas de PDMS del molde maestro de PDMS.

Envuelva los dispositivos de PDMS en parafilm para protegerlos del polvo o los residuos. Finalice cortando el PDMS envuelto en parafilm en piezas individuales utilizando una taladradora equipada con una cuchilla; los dispositivos de PDMS para co-cultivo de neuronas están casi listos para su uso en placas de cultivo celular. Antes de colocar el dispositivo de PDMS para co-cultivo de neuronas en una placa de cultivo celular, coloque el dispositivo dentro del limpiador de plasma y expóngalo al plasma de aire durante 90 segundos para hacer la superficie hidrofílica.

Este tratamiento facilitará el llenado de los microcanales con medio de cultivo tras el ensamblaje sobre placas recubiertas con polilisina. Para esterilizar el dispositivo tratado con plasma, sumérjalo en etanol al 70 % durante 30 minutos y traslade el recipiente a la cabina de flujo laminar estéril. Después de 30 minutos, retire el dispositivo y séquelo con gas de nitrógeno filtrado mediante un filtro Milipore de 0,2 micrones.

A continuación, coloque los dispositivos secos sobre una placa de cultivo de poliestireno de seis pocillos recubierta con poli-D-lisina y aplique presión suave para asegurar un sello hermético entre la superficie de la placa de cultivo y el hielo del dispositivo. Ahora, llene el compartimento somático con medio de cultivo. Espere uno o dos minutos para asegurarse de que no queden burbujas atrapadas dentro de los microcanales.

Luego, llene los seis compartimentos de axón-glia. Finalmente, incube los dispositivos llenos con medio de cultivo en un incubador a 37 grados Celsius durante la noche para eliminar cualquier posible residuo de desechos o tóxico. Después de la incubación nocturna, se puede iniciar el cultivo para prepararse para la carga celular en el dispositivo.

Utilice una pipeta para aspirar el medio de cultivo de los compartimentos Soma y Axón. A continuación, cargue 40 microlitros de células neuronales primarias del cerebro anterior de ratas de los días embrionarios 16 a 18 en el compartimento del soma alrededor de las entradas de los microcanales, con una densidad aérea de 500 células por milímetro cuadrado. Es importante no tocar el dispositivo de PDMS durante la carga de las células, ya que podría romper el sello entre el dispositivo y la placa de cultivo celular.

Estas imágenes microscópicas muestran células neuronales teñidas con amarillo de calcio. Dentro del compartimento del soma, las células están uniformemente cargadas dentro del compartimento y ubicadas cerca de los canales microfluídicos. Incube los dispositivos cargados con las células durante 30 minutos en un incubador a 37 grados Celsius para mejorar la adhesión celular al sustrato.

Después de esta incubación, complete todos los compartimentos con medio de cultivo. Mantenga las células creciendo en el dispositivo a 37 grados Celsius en un incubador humedecido con 5% CO₂, cambiando solo la mitad del medio de cultivo cada tres o cuatro días. Debe formarse una red axonal densa dentro de los compartimentos de axón y glia.

Después de dos semanas de cultivo tras 14 días de cultivo, se añaden las células CLIA de neuronas primarias in vitro antes de cargar las células; aspire aproximadamente el 60 % del medio de cultivo de los compartimentos. Los oligodendrocitos se disecaron de los hemisferios cerebrales de ratas Sprague Dawley en período posnatal. Del día uno al dos, añada cinco microlitros de células oligodendrocíticas a cada compartimento de axón-glia con una densidad superficial de 1000 células por milímetro cuadrado. Se debe tener precaución de no tocar el sustrato inferior con la pipeta durante la carga, ya que podría dañar la red axonal formada sobre el sustrato. Tras la adición de los oligodendrocitos, incube las células durante una hora a 37 grados Celsius y luego complete los compartimentos.

Con el medio de cultivo, continúe cultivando las neuronas como antes de la adición del CLIA; cambie solo la mitad del medio de cultivo cada tres o cuatro días durante otras dos semanas mientras estudia el sistema nervioso central de mamíferos. La interacción axón-glía cuando los experimentos se llevan a cabo adecuadamente. Las células neuronales cargadas en el compartimento del soma se ubican cerca de las entradas de los microcanales y una capa axonal comienza a formarse dentro de los compartimentos Ggl de axón.

Después de una semana de cultivo, los signos de agregación de células neuronales dentro del compartimento del soma pueden indicar que las células no están sanas al cargar oligodendrocitos. Después de dos semanas de cultivo neuronal, los compartimentos axonales deberían estar cubiertos con una capa densa de axones y los oligodendrocitos deberían cargarse encima de la capa axonal. Acabamos de mostrarle cómo fabricar una plataforma de cultivo neuroglial de múltiples compartimentos y cómo utilizarla para estudiar la interacción neuroglial del SNC in vitro.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener los dispositivos protegidos del polvo y no esterilizarlos en etanol durante demasiado tiempo, ya que podrían deteriorar la unión. Eso es todo. Gracias por ver y mucha suerte en sus experimentos.