Name: Purificación de las mitocondrias de las células de levadura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-24T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Aprende a purificar mitocondrias de levadura Saccharomyces cerevisiae mediante digestión enzimática, homogeneización y centrifugación en gradiente de sacarosa. Este método rápido aísla mitocondrias funcionales sin contaminación para estudios bioquímicos.

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Este trabajo fue apoyado por becas de los CIHR y NSERC de Canadá. VIT es un investigador de Nueva CIHR y Concordia Cátedra de Investigación de la Universidad de genómica, biología celular y el envejecimiento.

Materiales y métodos Cepas de levadura y las condiciones de crecimiento La cepa de tipo salvaje BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) fue cultivada en medio rico en YEPD (1% extracto de levadura, 2% de peptona, 2% de glucosa). Las células fueron cultivadas a 30 ° C con rotación agitación a 200 rpm en frascos de Erlenmeyer en un &quot;frasco de volumen / volumen medio de&quot; proporción de 5:1. El aislamiento de la fracción mitocondrial crudo <ol><li> Crecer 1 L de la cultura de la cepa de tipo salvaje BY4742 durante 48 h. </li><li> Vierta la cultura en 500 ml de tubos de centrifugación Nalgene. Equilibrar la carga de la cosecha y las células por centrifugación durante 5 minutos a 3000 xg a temperatura ambiente. </li><li> Decantar células sedimentadas sobrenadante y resuspender en 250 ml de dH2O. Pellet células por centrifugación durante 5 minutos a 3000 xg a temperatura ambiente. </li><li> Decantar células sedimentadas sobrenadante y resuspender en 250 ml de dH2O. Pellet células por centrifugación durante 5 minutos a 3000 xg a temperatura ambiente. </li><li> Determinar el peso húmedo del sedimento celular. </li><li> Volver a suspender las células sedimentadas en un tampón de TDT [2 ml de buffer / g (peso húmedo), las células]. </li><li> La transferencia de la suspensión celular a 50 ml tubos de plástico Falcon. </li><li> Gire los tubos a 70 rpm en un agitador durante 20 min a 30 ° C. </li><li> Las células de la cosecha por centrifugación durante 5 minutos a 3000 xg a temperatura ambiente. </li><li> Volver a suspender las células sedimentadas en tampón Zymolyase sin Zymolyase [7 ml de tampón / g (peso húmedo), las células]. </li><li> Pellet células por centrifugación durante 5 minutos a 3000 xg a temperatura ambiente. </li><li> Volver a suspender las células sedimentadas en tampón Zymolyase sin Zymolyase [7 ml de tampón / g (peso húmedo), las células]. </li><li> Transferencia de suspensión celular a un frasco de vidrio. </li><li> Añadir el polvo de Zymolyase-100T [1 mg de Zymolyase-100T / g (peso húmedo), las células] a la suspensión celular. </li><li> Gire el frasco con la suspensión de células a 70 rpm en un agitador durante 30 min a 30 ° C. </li><li> Esferoplastos transferencia formado debido a la digestión de la pared celular con Zymolyase-100T de 50 ml tubos plásticos de centrífuga. </li><li> Pellet esferoplastos por centrifugación durante 8 minutos a 2200 xg a 4 ° C. </li></ol> ** Todos los pasos posteriores deben llevarse a cabo a 4 ° C o en hielo. Las suspensiones de esferoplastos deberá ser manejado suavemente con pipetas con las puntas cortadas para evitar romper orgánulos .** <ol start="18"><li> Resuspender esferoplastos pellets en tampón de homogeneización helada [6,5 ml de buffer / g (peso húmedo), las células]. </li><li> Pellet esferoplastos por centrifugación durante 8 minutos a 2200 xg a 4 ° C. </li><li> Resuspender esferoplastos pellets en tampón de homogeneización helada [6,5 ml de buffer / g (peso húmedo), las células]. </li><li> La transferencia de células a un pre-refrigerados en hielo de vidrio homogeneizador. </li><li> El uso de un mortero apretado, homogeneizar las células, haciendo 15 golpes de la mano del mortero. </li><li> Añadir 1 volumen de tampón de homogeneización helada. </li><li> Transferencia de esferoplastos homogeneizada a 50 ml tubos plásticos de centrífuga. </li><li> Pellet células sin romper, los núcleos y los desechos grandes por centrifugación durante 5 minutos a 1500 xg a 4 ° C. </li><li> Centrifugar el sobrenadante resultante durante 5 minutos a 3000 xg a 4 ° C. </li><li> Centrifugar el sobrenadante resultante durante 15 minutos a 12.000 xga 4 ° C. </li><li> Decantar el sobrenadante y el precipitado se resuspende en helado de tampón de homogeneización [6,5 ml de buffer / g (peso húmedo), las células]. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 3000 xg a 4 ° C. </li><li> Centrifugar el sobrenadante resultante durante 15 minutos a 12.000 xga 4 ° C. </li><li> Decantar el sobrenadante y el precipitado se resuspende en 3 ml de tampón helado SEM. </li></ol> ** A pesar de esta suspensión se enriquece en la mitocondria, que también contiene otros orgánulos como el retículo endoplasmático (microsomas), aparato de Golgi y vacuolas. Para obtener puro mitocondrias, esta fracción mitocondrial crudo puede ser objeto de fraccionamiento adicional, tal como se describe a continuación .** La purificación de las mitocondrias desprovistas de contaminación por otros orgánulos <ol><li> Coloque 1,5 ml de helado de 60% (w / v) de sacarosa en tampón de EM en un tubo de centrífuga Beckman ultra claro. </li><li> Superposición del 60% (w / v) de sacarosa con 4 ml de 32%, 1,5 ml de 23%, 1,5 ml de 15% de sacarosa (todos buffer p / v en EM). </li><li> Colocar 3 ml de la fracción mitocondrial crudo en el SEM de amortiguación en la parte superior del 15% (w / v) de sacarosa. </li><li> Centrífuga en un Beckman SW41 Ti pivotar-Rotor durante 1 hora a 134.000 xg (33.000 rpm) a 4 ° C. </li><li> La forma de la mitocondria intacta una banda de color marrón en el 60% / interfaz de sacarosa del 32%. </li><li> Retire con cuidado sacarosa hasta llegar a la banda mitocondrial. </li><li> Retire la banda mitocondrial utilizando una pipeta con una punta corta y colóquela en un tubo de centrífuga Beckman de la MLS-5 rotor. </li><li> Llenar el tubo con tampón SEM. </li><li> Pellet de las mitocondrias puro por centrifugación en un rotor MLS-5 durante 30 minutos a 10.000 xg (31.000 rpm) durante 30 minutos a 4 ° C. </li><li> Sobrenadante se decanta conuna pipeta. </li><li> Utilice el puro mitocondrias para el análisis de las funciones mitocondriales, y proteoma mitocondrial lipidome, y el ADN mitocondrial. </li></ol> Reactivos <ol><li> TDT buffer [100 mM Tris/H2SO4 (pH 9,4), 10 mM ditiotreitol] (por 15 ml) <ul style="list-style-type:none;"><li> 1,5 ml de 1 M de tampón Tris/H2SO4 (pH 9,4) </li><li> 150 ml de 1 M de TDT </li><li> Volumen de 15 ml </li></ul></li><li> Buffer Zymolyase [20 mM fosfato de potasio (pH 7,4), 1,2 M sorbitol] (por 100 ml) <ul style="list-style-type:none;"><li> 2 ml de una solución amortiguadora de fosfato de potasio M (pH 7,4) </li><li> 60 ml de 2 M de sorbitol </li><li> Volumen de 100 ml </li></ul></li><li> Tampón de homogeneización [10 mM Tris / HCl (pH 7,4), 0,6 M sorbitol, 1 mM EDTA, 0,2% (w / v) BSA] (por 250 ml] <ul style="list-style-type:none;"><li> 2,5 ml de 1 M Tris / HCl buffer (pH 7,4) </li><li> 75 ml de 2 M de sorbitol </li><li> 500 l de 500 mM EDTA </li><li> 0,5 g de BSA </li><li> Volumen de 250 ml </li></ul></li><li> SEM buffer [10 mM MOPS / KOH (pH 7,2), 250 mM de sacarosa, 1 mM EDTA] (por 250 ml) <ul style="list-style-type:none;"><li> 2,5 ml de 1 M MOPS / KOH (pH 7.2) </li><li> 31,25 ml de 2 M de sacarosa </li><li> 500 l de 500 mM EDTA </li><li> Volumen de 250 ml </li></ul></li><li> EM buffer [10 mM MOPS / KOH (pH 7,2), 1 mM EDTA] (por 250 ml) <ul style="list-style-type:none;"><li> 2,5 ml de 1 M MOPS / KOH (pH 7.2) </li><li> 500 l de 500 mM EDTA </li><li> Volumen de 250 ml </li></ul></li></ol>

<ol><li>Voet, D., Voet, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Biochemistry.</a> , 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2004).</li>
<li>Suen, D. -F., Norris, K. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dynamics+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dynamics and apoptosis.</a> Genes Dev. 22, 1577-1590 (2008).</li>
<li>Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F. &amp, Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+factors+with+dual+roles+in+death+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial factors with dual roles in death and survival.</a> Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).</li>
<li>Detmer, S. A., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+dysfunctions+of+mitochondrial+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 870-879 (2007).</li>
<li>McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+more+than+just+a+powerhouse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: more than just a powerhouse.</a> Curr. Biol. 16, R551-R560 (2006).</li>
<li>Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+oxidants%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, oxidants, and aging.</a> Cell. 120, 483-495 (2005).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este método permite el aislamiento de alto rendimiento de puro mitocondrias de células de levadura. Las mitocondrias purificadas por este método son esencialmente libres de contaminación por otros orgánulos y mantener su integridad estructural y funcional después de su purificación. El método descrito mitocondrias rendimientos que son adecuados para células libres de la reconstitución de los procesos esenciales mitocondrial. Estas mitocondrias de alta pureza también se puede utilizar para el análisis de la estructura mi...

purificación de las mitocondrias de las células de levadura

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Las mitocondrias son el sitio principal de producción de ATP durante el metabolismo aeróbico en eucariotas no fotosintéticos células<sup&gt; 1</sup&gt;. Estos orgánulos complejos también juegan un papel esencial en la muerte celular por apoptosis<sup&gt; 2</sup&gt;, La supervivencia celular<sup&gt; 3</sup&gt;, Desarrollo de los mamíferos<sup&gt; 4</sup&gt;, El desarrollo neuronal y la función<sup&gt; 4</sup&gt;, La señalización intracelular<sup&gt; 5</sup&gt;, Y la longevidad de la regulación<sup&gt; 6</sup&gt;. Nuestra comprensión de estos complejos procesos biológicos controlados por las mitocondrias se basa en métodos robustos para la evaluación de su morfología, la proteína y la composición de los lípidos, la integridad de su ADN, y sus numerosas funciones vitales. La levadura en ciernes<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;, Una genéticamente y bioquímicamente eucariotas unicelulares manipulable con el genoma y el proteoma anotada bien definido, es un valioso modelo para el estudio de los mecanismos moleculares y celulares subyacentes a las funciones biológicas esenciales de las mitocondrias. Para este tipo de estudios, es fundamental contar con las mitocondrias de alta pureza. Aquí se presenta una descripción detallada de un método rápido y eficaz para la purificación de la mitocondria de levadura. Este método permite el aislamiento de alta pureza, las mitocondrias, que son esencialmente libres de contaminación por otros orgánulos y mantener su integridad estructural y funcional después de su purificación. Las mitocondrias purificadas por este método son adecuados para la libre de células de la reconstitución de los procesos esenciales de la mitocondria y se puede utilizar para el análisis de la estructura mitocondrial y funciones, y proteoma mitocondrial lipidome, y el ADN mitocondrial.

Se describe un método rápido y eficaz para la purificación de las mitocondrias de la levadura<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;. Este método permite el aislamiento de alto rendimiento de puro mitocondrias, que son esencialmente libres de contaminación por otros orgánulos y mantener su integridad estructural y funcional después de su purificación.

Purificación de las mitocondrias de las células de levadura

Las mitocondrias son el sitio principal de producción de ATP durante el metabolismo aeróbico en las células eucariotas no fotosintéticas1. Estos orgánulos complejos también desempeñan ...

Este protocolo comienza convirtiendo células de levadura en esferoplastos mediante la digestión de la pared celular con licolisina; luego, los esferoplastos se homogenizan utilizando un homogenizador de vidrio y teflón. El homogenado resultante se somete dos veces a centrifugación para sedimentar células no rotas, núcleos y grandes restos celulares. A continuación, el sobrenadante resultante se centrifuga durante 15 minutos a 12.000 ×g para sedimentar las mitocondrias.Finalmente, la fracción mitocondrial cruda, que aún contiene otras organelas, se somete a centrifugación durante 60 minutos a 134.000 G en un gradiente de densidad de sacarosa; las mitocondrias puras, libres de contaminación por otras organelas, se recuperan en la interfase entre el 60 % peso/volumen y el 32 % peso/volumen de sacarosa. Hola, soy el doctor Christopher Greg del laboratorio del doctor Vladimir Tko, del departamento de biología de la Universidad Concordia. Hoy les mostraré cómo aislar mitocondrias de la levadura Saccharomyces cerevisiae.Hacemos esto para estudiar la dinámica y los cambios relacionados con la edad que ocurren en las mitocondrias. A medida que las células envejecen, analizaremos los cambios en el proteoma, el contenido lipídico y el ADN mitocondrial. Así que comencemos.Comience este protocolo cultivando la cepa de levadura en diez matraces de doscientos cincuenta mililitros, cada uno conteniendo 50 mililitros de medio YP, a 30 grados Celsius con agitación rotatoria durante 48 horas. A continuación, vierta el cultivo en tubos centrífugos Nalgene de 500 mililitros.Recoger las células por centrifugación durante cinco minutos a 3000 Gs a temperatura ambiente, desechar el sobrenadante y resuspender las células sedimentadas en 250 mililitros de agua destilada; centrifugar las células durante cinco minutos a 3000 Gs a temperatura ambiente. Repita este paso: resuspenda las células sedimentadas en 250 mililitros de agua destilada y centrifugue durante cinco minutos.A 3000 Gs a temperatura ambiente, pese el pellet celular húmedo resultante, luego resuspenda las células sedimentadas en tampón DTT y transfiera la suspensión celular a un matraz de 250 mililitros. Incube el matraz rotando a 70 RPM a 30 grados Celsius durante 20 minutos. Tras los 20 minutos, recolecte las células por centrifugación durante cinco minutos a 3000 Gs a temperatura ambiente, resuspenda las células sedimentadas en tampón Xs sin Xs y centrifugue durante cinco minutos.A 3000 Gs a temperatura ambiente, resuspenda las células sedimentadas en tampón Zy sin Xs nuevamente y transfiera la suspensión celular a un matraz de vidrio. Añada la liasa Zy 100 T en polvo a la suspensión celular y rote a 70 RPM en un agitador a 30 grados Celsius durante 30 minutos; la liasa Zy 100 T digerirá las paredes celulares para formar esferoplastos. Todos los pasos posteriores a la digestión X mostrada previamente deben realizarse a cuatro grados Celsius o sobre hielo.Las suspensiones de esferoplastos deben manipularse con cuidado utilizando pipetas con puntas recortadas para evitar romper los orgánulos. Una vez finalizada la digestión de 30 minutos con XMO, transfiera los esferoplastos a tubos plásticos de centrífuga de 50 mililitros, centrifugue durante ocho minutos a 2200 G a cuatro grados Celsius, resuspenda el sedimento de esferoplastos S en tampón de homogenización frío con hielo y vuelva a centrifugar los esferoplastos S durante ocho minutos a 2200 G a cuatro grados Celsius.Re-suspenda el sedimento de esfero plást en hielo. Añada tampón de homogenización frío y transfiera las células a un homogenizador de vidrio previamente enfriado. Utilizando un pistilo ajustado, homogenice las células realizando 15 movimientos del pistilo.Añada un volumen igual de tampón de homogenización frío con hielo a los "splats" homogeneizados de S, y transfiera la mezcla a tubos plásticos de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugue los "splats" homogeneizados durante cinco minutos a 1500 G a cuatro grados Celsius para obtener un sedimento de células no rotas, núcleos y restos grandes. Vierta el sobrenadante resultante en tubos nuevos y centrifugue durante cinco minutos.A 3000 Gs a cuatro grados Celsius. Después de esa centrifugación, el sobrenadante resultante durante 15 minutos a 12 000 Gs a cuatro grados Celsius, deseche el sobrenadante y resuspenda el precipitado en hielo. Centrifugue el tampón de homogenización frío.Se suspende nuevamente el precipitado durante cinco minutos a 3000 Gs a cuatro grados Celsius. Finalmente, centrifugue el sobrenadante resultante durante 15 minutos a 12 000 Gs a cuatro grados Celsius, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el precipitado en tres mililitros de frío intenso.Tampón SEM. Esta suspensión es la fracción mitocondrial cruda. Aunque está enriquecida en mitocondrias, también contiene otros orgánulos como el retículo endoplasmático o microsomas GOGI y VAs para obtener mitocondrias puras.La suspensión se someterá a una fraccionamiento adicional como se describe en la siguiente sección. Para comenzar el fraccionamiento de la suspensión mitocondrial cruda y obtener mitocondrias puras, coloque 1.5 mililitros de sacarosa al 60% peso por volumen, fría con hielo, en tampón em en un tubo de centrífuga Beckman UltraClear.A continuación, superponga suavemente 4 mililitros de sacarosa al 32%, 1,5 mililitros de sacarosa al 23% y 1,5 mililitros de sacarosa al 15% (peso por volumen en tampón EM) sobre la sacarosa al 60%. Coloque 3 mililitros de la fracción mitocondrial cruda en tampón SEM sobre la sacarosa al 15% peso por volumen. Centrifugue en un rotor oscilante Beckman SW 41 TI durante una hora a 134.000 G o 33.000 RPM a 4 grados Celsius.Después de la centrifugación, las mitocondrias intactas formarán una banda marrón en la interfase entre el 60 % y el 32 % de sacarosa. Retire cuidadosamente la sacarosa hasta alcanzar la banda mitocondrial utilizando una pipeta con la punta cortada, extraiga la banda mitocondrial y colóquela en un tubo de centrífuga Beckman. Para un rotor MLS cinco, llene el tubo con tampón SEM, pelete las mitocondrias puras mediante centrifugación en un rotor MLS cinco a 10 000 ×g o 31 000 rpm durante 30 minutos a cuatro grados Celsius y deseche el sobrenadante.Estas mitocondrias puras pueden utilizarse ahora para los análisis de las funciones mitocondriales, el proteoma mitocondrial y el ADN mitocondrial. La fracción mitocondrial cruda en las bandas izquierdas y las mitocondrias purificadas mediante centrifugación en un gradiente de densidad de sacarosa en las bandas derechas se sometieron a electroforesis en SDS y transferencia inmunológica con anticuerpos contra marcadores proteicos de diversas organelas. La presencia de mitocondrias en ambas preparaciones se confirmó mediante inmunorreactividad frente a PO one P y COX one p. El análisis inmunológico indicó la presencia de DP M1 P, FO 13 p y VPS 10 P, que representan proteínas del retículo endoplasmático, lisosomas y aparato de Golgi, respectivamente, en la fracción mitocondrial cruda.En contraste, estas proteínas marcadoras no se detectaron en las mitocondrias purificadas, lo que confirma que el protocolo produjo mitocondrias libres de contaminación por otros orgánulos. Así que acaban de mostrarle cómo aislar mitocondrias de la levadura sace visier. Simplemente recuerde que, al realizar este experimento, no debe dejar que las células incuben en zy lies 100 T por más de media hora, ya que existe el riesgo de degradar las proteínas de membrana o las proteínas de orgánulos que podrían estar presentes en las células.Esto podría deberse a las proteasas presentes en el reactivo. Además, cuando esté a punto de aislar las mitocondrias y el gradiente de sacarosa, puede congelar estas mitocondrias a menos 20 grados antes de realizar el procedimiento y luego descongelarlas antes de estar listo para llevar a cabo el paso de centrifugación. Eso es todo.Buena suerte con sus experimentos.

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Investigación

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Biología

La contaminación de las preparaciones de los ribosomas eucarióticos purificado por los métodos tradicionales de purificación de nucleasas y proteasas co-incide negativamente en posteriores análisis bioquímicos y estructurales. Un método de cromatografía de purificación rápida y sencilla se utiliza para resolver este problema con los ribosomas levadura como un sistema modelo.

Purificación por cromatografía de ribosomas de levadura de gran actividad

Muchos ARNm que codifican proteínas mitocondriales se asocian con la membrana externa mitocondrias. Se describe un procedimiento de fraccionamiento subcelular destinada a aislamiento de las mitocondrias de levadura con sus ARNm y ribosomas asociados. Este protocolo se puede aplicar a las células cultivadas bajo diversas condiciones con el fin de revelar los mecanismos de la localización del mRNA y la traducción localizada cerca de las mitocondrias.

Aislamiento de ARNm asociados a la mitocondria de levadura para estudiar los mecanismos de traducción localizada

Aquí presentamos un protocolo para expresar, solubilizar y purificar varios transportadores de borato eucariotas con homología a la familia de transportador SLC4 usando levadura. También describimos un análisis Cross-linking químico para evaluar las proteínas purificadas homomeric multimérica Asamblea. Estos protocolos pueden ser adaptados para otras proteínas de membrana desafiante.

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El genoma mitocondrial de levadura de Baker codifica ocho polipéptidos. El objetivo del protocolo actual es etiquetarlos todos ellos y posteriormente visualizarlos como bandas separadas.

Etiquetado y visualización de productos de expresión del genoma mitocondrial en la levadura de Panadero Saccharomyces cerevisiae

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Aislamiento de dos pasos sin etiquetas de las mitocondrias para mejorar el descubrimiento y la cuantificación de proteínas

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Un método mejorado para aislar los sitios de contacto mitocondrial

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