Tejido diana quimeras embrionarias: pez cebra Gástrula Trasplante de células

Este procedimiento comienza alineando embriones de pez cebra de una sola célula en una placa de microinyección. Microinyecte una solución de dextrina fluorescente en la yema. Justo debajo de la célula, los embriones inyectados son sus donantes para trasplante.

Coloque embriones donantes y huéspedes y cultívelos hasta la etapa de escudo; coloque dos embriones inyectados con dextrina recubierta con DEC lado a lado en un pocillo de una placa de trasplante. Repita debajo de cada par donante. Añada un embrión huésped por pocillo para dirigir las células trasplantadas hacia el futuro diencéfalo del prosencéfalo; trasplante las células desde y hacia la línea media.

A mitad de camino entre el polo animal y el escudo. Transplante células del gasa donante al Gasa del huésped. Incube hasta 30 horas y fije.

Realice inmunohistoquímica si es necesario, monte e image. Alternativamente, monte el hospedador en vivo y realice imágenes de lapso de tiempo. Hola, mi nombre es Elizabeth De Shane del laboratorio del Dr. Michael ESI en el Departamento de Ciencias Biológicas del Smith College en Northampton, Massachusetts.

Y soy el investigador principal del laboratorio, el Dr. Michael Besi. Hoy les mostraremos cómo crear embriones quiméricos mediante trasplantes de células en etapa de gástrula utilizando el sistema modelo del pez cebra. En mi laboratorio utilizamos este procedimiento para estudiar la función de genes específicos en el desarrollo de la comisura del prosencéfalo, así como el proceso de interacciones axón-glía durante la formación de la comisura.

Así que comencemos. Para empezar, prepare moldes de surcos para las placas de microinyección rompiendo cuidadosamente tres capilares sin filamento de un milímetro de diámetro y cuatro pulgadas de largo por la mitad. Utilizando pegamento instantáneo, pegue dos de las mitades de capilar una al lado de la otra sobre una superficie plana.

El tercer capilar, colocado encima de estos dos, encaja en la ranura para formar una estructura en forma de pirámide. Con los tres capilares, permita que el molde se seque. Debe elaborar aproximadamente entre tres y cinco moldes para cada placa de inyección.

A continuación, prepare las placas de inyección vertiendo entre 20 y 25 mililitros de aros fundido al 1,5 % en medio embrionario dentro de una placa de Petri de 100 milímetros. Inmediatamente coloque de tres a cinco moldes de canales en el fondo de la placa, asegurándose de que el lado plano del molde toque el fondo de la placa de Petri y quede completamente cubierto por el aros. Una vez que el aros haya solidificado, retire los moldes de canal cortando un cuadrado grande de aros que los contenga.

Desprenda suavemente el agar de la periferia del cuadrado cortado y deséchelo. Doble la pieza cuadrada de agar y, utilizando pinzas finas, retire completamente los moldes de las ranuras. Vierta agar fundido en la placa de Petri alrededor del cuadrado para mantener en su lugar los pozos recién moldeados.

Dejar que solidifique. Las placas pueden sellarse con paraformaldehído y almacenarse durante semanas a cuatro grados Celsius. Deben descartarse si hay signos de crecimiento en el agar.

Finalmente, para preparar las agujas de inyección, utilice un extractor de capilares de micropipeta para fabricar las agujas a partir de capilares de vidrio de un milímetro de diámetro y cuatro pulgadas de largo, con filamentos internos, una vez que la placa de microinyección y las agujas estén preparadas. Veamos cómo recolectar embriones y montar el aparato de microinyección. Los huevos fertilizados se recolectan inmediatamente después de ser puestos y se mantienen en una placa de Petri llena de medio para embriones.

Utilizando una pipeta de vidrio de punta ancha, expulse los embriones en los pocillos de una placa de inyección a temperatura ambiente llena con medio para embriones. Use pinzas romas sujetas para colocar suavemente los embriones en el fondo de las canaletas; deseche aquellos embriones cuyo corion o yema hayan sido dañados.

A continuación, cargue la aguja de inyección con uno a dos microlitros de solución diluida de dextrina fluorescente Alexa 5 9 4. Permita que la dextrina avance hasta la punta de la aguja de inyección por acción capilar. Fije la aguja de inyección al portacapilares de un micro manipulador estereotáctico y ajuste inicialmente la presión en el aparato de microinyección.

40 a 50 PSI y una duración de pulso de 500 milisegundos. Utilice pinzas para rozar suavemente o cortar la punta de la aguja de inyección y romper el sello. Idealmente, el diámetro debe ser de 0,05 a 0,15 milímetros.

Para calibrar la aguja, utilice un microscopio estereoscópico y expulse la dextrina sobre un micrómetro que tenga aceite mineral en su superficie. Modifique el tamaño del bolo ajustando la duración de la presión de aire del pulso y el tamaño de la aguja. Consejo. Durante las inyecciones, se debe mantener un tamaño de bolo equivalente a un volumen de 0,8 a un nanolitro.

Ahora podemos comenzar la microinyección de dextrina utilizando aproximadamente 3.2 x de aumento en un microscopio estereoscópico. Comience las inyecciones en los embriones desde un extremo del canal, perforando suavemente el corion y la membrana celular de los embriones para acceder al vitelo. Inyecte la solución de dextrina justo debajo de la célula.

Asegúrese de retirar la aguja de inyección con el mismo movimiento suave utilizado para introducirla en el embrión. Mueva el plato de Petri para colocar el siguiente embrión en línea y continúe inyectando a lo largo de la longitud del canal. Verifique periódicamente la presión y el tamaño del bolo.

Ahora use pinzas para empujar suavemente los embriones fuera de los surcos. Trasfiera los embriones a una placa de Petri llena con medio para embriones con antibiótico. Incube los embriones a 28,5 grados Celsius y controle la presencia de huevos no fertilizados o muerte embrionaria.

Los embriones ya están listos para futuros trasplantes. Antes de completar un poli durante la racionalización de gas, permanecen expuestas porciones del vitelo. El vitelo es extremadamente frágil y se adherirá fácilmente, rasgándose al contacto con el plástico de la placa de Petri.

Por lo tanto, los embriones deben recubrirse en placas recubiertas un día antes de que se realicen los trasplantes. Prepare estas placas de decoración vertiendo entre cinco y diez mililitros de aros fundido en una placa de Petri de 100 milímetros. Solo se necesita una capa delgada de aros, de aproximadamente dos a tres milímetros, para amortiguar los embriones durante la decoración.

Deje enfriar las placas. A continuación, prepare placas de trasplante separadas vertiendo 30 mililitros de solución de aros al 1,5% en una placa de Petri de 100 milímetros e inserte un molde de pocillos para trasplante. El molde debe contener 104 muescas triangulares, cada una compuesta por tres lados de 90 grados y un lado inclinado de 45 grados.

Los pocillos están diseñados para contener dos embriones uno al lado del otro. Tenga cuidado de no atrapar burbujas de aire debajo del molde y deje que el agar se endurezca. Al retirar el molde se revela un área hundida que contiene los pocillos cuadrados con un borde inclinado.

Para preparar embriones huésped y donantes para trasplante, es necesario monitorear su desarrollo para mantener emparejamientos casi coincidentes en edad. Para ello, los embriones pueden cultivarse a temperaturas variables entre 23 y 31 grados Celsius para ralentizar o acelerar el desarrollo. Tanto los embriones huésped como los donantes deben ser revestidos manualmente en una placa de recubrimiento recubierta una hora antes de la edad deseada.

En el caso de trasplantes en la etapa de gastrulación, esto debería completarse antes de las cinco horas post-fecundación o HPF, previo a la etapa de escudo a las 5,5 HPF. Utilice una pipeta de vidrio para cargar los embriones huésped y donantes en una placa de trasplante llenada con medio embrionario antibiótico. Aquí, la primera fila se llena con embriones donantes, con dos embriones por pocillo, y las dos filas siguientes se llenan con un único embrión huésped por pocillo.

Para los trasplantes, utilizamos un microscopio estereoscópico fluorescente Zeiss luer que cuenta con un control completamente automatizado mediante joystick del zoom y del enfoque. Aunque este microscopio automatizado no es indispensable, aumenta considerablemente la facilidad y eficiencia de estos trasplantes quirúrgicos finos, especialmente cuando se desean un gran número de trasplantes. Para configurar el aparato de trasplante, coloque el einor air tram en la posición central de su escala, conecte el tubo del air tram al porta-capilares y asegure el porta-capilares al micromanipulador automatizado einor. Con los embriones y el aparato de trasplante preparados, ahora podemos pasar a los trasplantes de células en estadio gastro.

La habilidad más crítica para realizar trasplantes de células en la etapa de gastrulación es la capacidad de reconocer la anatomía celular del labio del blastómero dorsal APO, también conocido como escudo en el pez cebra. Aquí presentamos una película secuencial de la gástrula desde diferentes puntos de vista y destacamos la ubicación del escudo en esta vista lateral. El escudo o lado dorsal se encuentra a la derecha, dentro del contorno rojo, para dirigir las células hacia las células trasplantadas del cerebro anterior y hacia la línea media.

Exactamente a mitad de camino entre el polo animal y el escudo, comenzaremos a rotar el embrión primero hacia usted para mostrar el polo animal, resaltando el escudo y el sitio de trasplante en el trayecto. A continuación, el embrión gira sobre su eje para colocar el escudo en la parte inferior. Ahora el gastro gira nuevamente hacia arriba, ofreciéndole una vista dorsal directa.

El embrión se gira ahora nuevamente en secuencia hasta una vista lateral a las seis HPF. Utilizando el micromanipulador, roce suavemente el embrión con la punta de la micropipeta para rotarlo a una posición adecuada para la extracción celular, de modo que su línea media y su escudo sean visibles y queden opuestos a la punta de la micropipeta. Los embriones donantes se verifican fácilmente cambiando de iluminación de campo claro a iluminación fluorescente. Aquí, las células del intestino fluorescen en rojo. Aspire una pequeña cantidad de medio embrionario dentro de la micropipeta para eliminar cualquier posibilidad de que las células entren en contacto con la interfase aire-agua, lo cual las dañaría.

Punzar suavemente el ectodermo del embrión donante en la línea media exactamente entre el polo animal y el escudo. Había aproximadamente 20 micrómetros de células entre el ectodermo superficial y el vitelo subyacente en el gasa. Por lo tanto, tener cuidado de no atravesar el vitelo, ya que esto suele provocar la muerte en cuestión de horas.

Utilizando el tramo de aire, aspire lentamente las células hacia la capilaridad. Mantenga siempre visible la línea de agua agitando ligeramente la punta. Mientras esté dentro del donante, esto ayudará a aflojar los contactos entre célula y célula.

Se deben extraer aproximadamente entre 10 y 50 células del embrión donante. A continuación, retire la micropipeta del donante. Oriente de manera similar el hospedador y atraviese con ella, introduciendo y expulsando las células en la misma ubicación exacta. En un embrión hospedador, el cambio de la iluminación de campo claro a la iluminación fluorescente revela el movimiento de las células marcadas con dextrina dentro de la aguja capilar hacia el embrión hospedador.

Finalmente, tras el trasplante, retire los embriones donantes y huéspedes de los pocillos. Séparelos y colóquelos suavemente en una placa de Petri recubierta con A, llena con antibiótico para embriones. Incube los embriones en medio a 28,5 grados Celsius hasta que finalice el trasplante.

Comencemos con la visualización y el análisis por imágenes. Los embriones se fijan inicialmente en la etapa adecuada para el análisis por imágenes, utilizando un conservante verificado para inmunoquímica. En nuestro caso, esto se realiza con formaldehído al 4 % durante dos horas a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados Celsius con agitación rotatoria.

A continuación, enjuague los embriones fijados dos veces y luego lávelos durante tres a cinco minutos en PBS 0,1 M. Realice la inmunomarcación adecuada si es necesario.

Coloque los embriones en glicerol al 75%, sumérjalos a temperatura ambiente y almacénelos a cuatro grados Celsius. Prepare un portaobjetos para montar dos embriones creando dos contornos cuadrados de vaselina petrolera sobre el portaobjetos que coincidan con el diámetro interno de un cuadrado. Cubra cada embrión con una laminilla y realice las disecciones necesarias para obtener una vista frontal del prosencéfalo.

Disecte el cerebro anterior cortando perpendicularmente a través del mesencéfalo. Coloque este tejido con una cantidad mínima de glicerol dentro del petróleo. Oriente adecuadamente el tejido en la posición apropiada y coloque una lámina de cubierta sobre el espécimen.

Alternativamente, para embriones vivos, móntelos en una solución de agar al 0,75 % sobre un portaobjetos de vidrio. Antes de que el agar se solidifique, utilice una aguja de tungsteno para manipular el embrión y colocarlo en la orientación adecuada para la obtención de imágenes. Se obtienen imágenes tanto de muestras fijadas como de embriones vivos.

Utilizando el microscopio confocal de barrido láser Leica SP, se adquieren pilas ZS y se realiza un procesamiento de imágenes tridimensional o tetradimensional mediante el software Velocity para generar embriones quiméricos en los que una parte de la población de astroglias dentro del embrión difiere en genotipo o fenotipo. Empleamos un enfoque multifacético que combina el uso de embriones transgénicos GFP, que marcan las astroglias, junto con el trasplante de células en estadio gastrular para dirigir específicamente nuestros clones hacia el cefalón. Utilizamos el mapa de destino gastrular del pez cebra para extraer selectivamente células en la línea media, equidistantes del polo animal y del escudo.

Estas células extraídas se trasplantaron luego al mismo lugar en un hospedador de tipo silvestre gasa, que posteriormente se crió hasta las 30 HPF y se marcó inmunológicamente para identificar todos los axones como referencias anatómicas del cerebro anterior. En el ejemplo mostrado aquí, el análisis confocal de un embrión hospedador revela células aisladas positivas para GFP distribuidas a lo largo del cefalón y el cefalón. La morfología completa de estas células positivas para GFP puede observarse en este ensayo clonal, lo que revela que la mayoría de estas células adoptan la morfología característica de las células gliales radiales, en la que el soma se encuentra adyacente a la zona ventricular y un gran pie terminal finaliza un proceso radial en la superficie periférica.

La representación tridimensional del Zack de estas rebanadas ópticas recolectadas muestra claramente la posición de estas células con respecto a los axones marcados. Otro enfoque comúnmente utilizado para visualizar células trasplantadas consiste en inyectar inicialmente un colorante fluorescente de linaje celular en el vitelo de un embrión silvestre de un solo estadio celular o transgénico GFP. En este ejemplo, inyectamos dextrina Alexa 594 en embriones silvestres.

En el estadio de una sola célula, los dejamos desarrollar hasta el estadio de escudo y luego realizamos cuatro trasplantes dirigidos al cerebro como se mencionó anteriormente. Pero en lugar de eso, trasplantamos en un huésped transgénico en estadio de gástrula para obtener imágenes del cefalón dorsal mediante escaneo láser. La microscopía confocal reveló agrupaciones fluorescentes rojas de células donantes entre núcleos positivos para GFP dentro del prosencéfalo.

Analizamos más a fondo este hospedador mediante la recopilación de imágenes Zacks cada tres minutos durante un período de dos horas con el microscopio confocal de barrido láser. La representación tetradimensional de esta serie temporal, realizada con el software Velocity de IMP Provision, muestra movimientos celulares dinámicos de las membranas celulares del dominio en forma de bastón y de los núcleos positivos para GFP. Acabamos de mostrarle cómo preparar todos los aparatos y reactivos necesarios para realizar trasplantes celulares en embriones de pez cebra.

En particular, demostramos la técnica en la etapa de gástrula. Sin embargo, también es aplicable a trasplantes en la etapa de blástula. Al utilizar este procedimiento, es importante correlacionar con precisión la ubicación final deseada de las células trasplantadas con la ubicación temprana en el mapa de destinos de estas células en el gas. Consulte el estudio detallado del Dr. Scott Frazier de 1995 titulado Fate Maps of the Zebrafish Embryo para obtener orientación adicional.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.