La obtención de ARN de alta calidad a partir de poblaciones de células individuales en tejido cerebral humano post-mortem

Se describe un procedimiento que utiliza láser microdisección de captura para aislar y extraer el ARN de una población celular homogénea, las neuronas piramidales en la capa III de la circunvolución temporal superior en los cerebros humanos postmortem. Estamos posteriormente amplifican linealmente (T7-based) mRNA, y se hibridan la muestra a la Affymetrix humanos X3P microarrays.

Este procedimiento comienza con la sección de bloques de tejido congelado de vapor de nitrógeno líquido de ocho micrómetros en un criostato colocado a menos 17 grados Celsius en portaobjetos de vidrio simples sin carga. A continuación, las secciones se tiñen con el kit de tinción del gen histo. Después de identificar las neuronas piramidales, las células, alrededor de 500, se capturan con láser en la tapa de captura HS.

La tapa con celdas se coloca en un tubo de microcentrífuga que contiene 50 microlitros de tampón de extracción volteado boca abajo y se coloca en un tubo Falcon previamente colocado en Irak, asentado en un baño de agua ajustado a 42 grados Celsius. Después de un breve paso de centrifugación, se retira la tapa. A continuación, la solución restante está lista para el aislamiento del ARN.

Hola, soy Charmaine Peterson del laboratorio de Wilson Wu en el Departamento de Neurociencia Estructural y Molecular del Hospital McLean. Hoy vamos a mostrarte un procedimiento para la captura láser de neuronas parametálicas a partir de tejido cerebral humano post mortem. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la expresión génica diferencial en los giros superiores y pobres de los sujetos con esquizofrenia utilizando la tecnología de microarrays.

Así que comencemos. Los tejidos cerebrales se obtuvieron del Centro de Recursos de Tejidos Cerebrales de Harvard como bloques congelados de vapor de nitrógeno líquido antes de la sección de tejidos. Es importante reducir la contaminación por ARN: todas las superficies, incluida el área de trabajo, la cuchilla de corte y los portaobjetos, se tratan con una solución de descontaminación de ARN, como ARN SAP, y se limpian con etanol al 100%.

Este procedimiento comienza con la sección de bloques de tejido congelado con vapor de nitrógeno líquido en un criostato colocado a menos 17 grados Celsius en portaobjetos de vidrio simples sin carga. Las secciones de tejido ya están listas para la identificación de neuronas piramidales utilizando el kit de tinción rápida del gen histo. Prepare la serie de deshidratación de etanol con 25 mililitros de las concentraciones adecuadas de etanol y agua libre de ARN en los frascos de tinción provistos con el kit de genes histo.

Coloque todos los frascos en una cubeta de hielo, excepto un frasco de etanol al 75%. Coloque ese etanol al 75% en el congelador a menos 20 grados centígrados. A continuación, prepare la solución de tinción añadiendo un microlitro de inhibidor de ARN por cada 100 microlitros de solución de tinción.

Dado que vamos a teñir cuatro secciones de tejido en dos portaobjetos, se añaden cuatro microlitros de inhibidor de ARN a 400 microlitros de la solución de tinción en un tubo de microcentrífuga. Mantén la solución de tinción en hielo. Debajo de una campana extractora.

Agregue tamices moleculares en el frasco de xileno para eliminar el exceso de agua, lo que podría comprometer la elevación del tejido. Encienda el baño de agua con la temperatura ajustada a 42 grados centígrados y coloque un tubo Falcon de 50 mililitros sostenido por una rejilla en el baño de agua. Retire dos portaobjetos del congelador a menos 80 grados centígrados y descongélelos con una toallita Kim.

Durante aproximadamente 30 segundos o justo hasta que las esquinas de los portaobjetos comiencen a descongelarse, fije brevemente el tejido en el etanol al 75% durante 30 segundos en el congelador a menos 20 grados centígrados. Luego, usando pinzas libres de ARN, transfiera los portaobjetos a agua libre de nucleasas para un lavado número 32 Después de lavar los portaobjetos, delinee las secciones con un bolígrafo de barrera PAP para concentrar la solución de tinción en la sección y tiña las cuatro secciones con la solución de tinción del gen histo durante 20 segundos. Con 97 microlitros del inhibidor de ARN de corte de manchas por sección, deshidrate las secciones en el etanol previamente preparado en hielo durante 30 segundos por paso.

El paso final de etanol al 100% debe extenderse a tres minutos para lograr una deshidratación suficiente para una elevación adecuada del tejido. Finalmente, sumerja los portaobjetos en xileno durante cinco minutos, permitiendo que los portaobjetos se sequen completamente al aire antes de proceder a la microdisección con captura láser, las neuronas piramidales deben eliminarse inmediatamente después de teñir el procedimiento para la captura láser de una sola célula. La microdisección o LCM requiere un baño de agua a 42 grados centígrados que contiene un tubo Falcon de 50 mililitros soportado por un, que se instaló anteriormente.

El LCM de una sola celda se logra con el sistema y software de captura láser ARCTURUS XT. Para comenzar este procedimiento, cargue las correderas y las tapas en el aparato arcturus XT. Utilice las mayúsculas de captura HS, pero mantenga la configuración del programa en macro.

Haga clic en el cuadro de carga con descripción general para obtener una foto de descripción general de cada diapositiva. Ajuste el enfoque de brillo a dos aumentos para determinar la sección óptima para la captura láser. Evite las secciones de tejido con pliegues excesivos, pero elija secciones que estén intactas, lisas y manchadas.

Pues coloca una tapa sobre la zona general donde vas a capturar, asegurándote de incluir la zona a capturar en nuestro caso. Capa tres de la corteza. Asegúrese de que los rieles de la tapa no descansen sobre ningún pliegue, ya que esto inclinará la tapa, lo que dará como resultado tamaños de punto variables.

A continuación, confirme la ubicación del punto láser IR manualmente con un aumento de 40x. La cruz azul debe estar centrada dentro del punto láser IR. De lo contrario, ajuste su ubicación haciendo clic con el botón derecho en el lugar y seleccionando el punto IR ubicado.

A un aumento de 40x, identifique las neuronas piramidales de acuerdo con los siguientes criterios, uno que las células de nuestra forma piramidal y dos, la porción proximal de las dendritas apicales y/o basales sean identificables. Guarde la posición de la tapa haciendo clic en el signo más en la función de posición. De esta manera, si se mueve la tapa, siempre volverá exactamente al mismo lugar para el que ajustó el tamaño del punto.

Introduzca estos valores en la caja de control, 70 en potencia y 16 en duración. Dado que estos parámetros son específicos de nuestro tejido, le recomendamos que pruebe y ajuste estas variables de acuerdo con su muestra de tejido específica antes de comenzar. Con la captura láser de celdas individuales, desmarque la opción de etapa de movimiento automático y asegúrese de que el símbolo del tamaño correcto se correlacione con el símbolo en el panel de la derecha.

Seleccione la opción de círculo en la parte inferior derecha para seleccionar una neurona que le gustaría probar captura. Y después de alinear la cruz azul con el círculo, active el láser haciendo clic en probar punto IR. En primer lugar, el punto creado por el láser debe tener un anillo oscuro y nítido alrededor del objeto capturado.

Asegúrese de que el anillo sea lo suficientemente grande como para abarcar la célula, pero lo suficientemente pequeño como para que no incluya tejido u otras células no deseadas. Si este anillo es demasiado ligero, la célula no fue capturada. Si hay un punto oscuro en el medio del anillo oscuro, entonces la duración del corte de fuerza del láser es demasiado grande.

Repita este proceso en diferentes partes del tejido dentro de la capa que desea capturar. Para comprobar que el tamaño del punto no difiere en función de la ubicación, ajústelo en consecuencia. Identificar neuronas piramidales para capturar aproximadamente 500 células.

Presione el botón de captura láser para capturar células. Mueva la tapa a la estación de control de calidad. Asegúrese de que al menos el 90% de las neuronas hayan sido extirpadas.

De lo contrario, capture más células en el área donde se capturaron la mayoría de las células. Coloque la tapa en un tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitros que contenga 50 microlitros de tampón de extracción. La tapa ha sido diseñada para encajar perfectamente para evitar que el tampón tenga fugas.

Dé la vuelta al conjunto, asegurándose de que el tampón de extracción cubra toda la tapa y colóquelo en la parte inferior del tubo Falcon de 50 mililitros en el baño de agua establecido a 42 grados centígrados. Incubar las neuronas durante 30 minutos para eliminar el tejido de la tapa después de la incubación, centrifugar el conjunto del tubo y la tapa durante dos minutos a 800 gs. Después de la centrifugación, retire la tapa.

Si el aislamiento del ARN solo se realizará en un momento posterior. Almacene el extracto celular restante a menos 80 grados centígrados. De lo contrario, proceda con el aislamiento del ARN del extracto celular como se muestra en la siguiente sección, el aislamiento del ARN se realiza utilizando el kit de aislamiento puro PICO, que está diseñado para aislar pequeñas cantidades de células de muestras de LCM y retener ARNm de baja abundancia.

Para comenzar este procedimiento, agregue el 70% de etanol provisto con el kit al extracto celular y centrifugue en una columna de purificación preacondicionada. Para unir el ARN al filtro de columna después del lavado, trate el ARN con D Ns para eliminar el riesgo de interferencia en el ADN. Este paso es particularmente importante en aplicaciones posteriores como R-T-P-C-R en tiempo real.

Después de la digestión del ADN, agregue 40 microlitros de tampón de lavado y centrifugue la columna de purificación durante 15 segundos a 8, 000 Gs. A partir de entonces, proceda con los lavados de acuerdo con el protocolo proporcionado con el kit, pero extienda el paso de lavado final con tampón de lavado dos de dos a dos minutos y medio para asegurarse de que no quede tampón de lavado en la columna, lo que puede reducir el rendimiento de ARN. Transfiera la columna a otro tubo de microcentrífuga. Agregue el tampón eluciano e incube en el filtro en la columna durante un minuto, centrifugue la columna para eluir el ARN.

Por último, compruebe la calidad del ARN extraído mediante la ejecución de un chip de laboratorio Experian High Sense, que proporciona un gel virtual y una pipeta de electroferograma de 1,3 microlitros de la muestra en un tubo de 0,5 mililitros. Para la prueba de control de calidad, congele el resto de la muestra a menos 80 grados centígrados. Una vez verificada la calidad del ARN, éste puede ser amplificado, marcado e hibridado.

Para el análisis de perfiles de expresión génica, se realizarán dos rondas de amplificación lineal con el kit ribo amp HS plus, lo que debería dar como resultado aproximadamente 50 microgramos de ARN amplificado suficientes para la realización de experimentos de microarrays y Q-R-T-P-C-R. El kit de etiquetado turbo biotina y el etiquetado de dispositivos moleculares se utilizan para etiquetar el ARN amplificado. Por último, se realizará el perfil de expresión génica utilizando el chip genético humano X three P pro beret de atrix.

El corte de tejido debe dar como resultado dos portaobjetos con dos secciones por portaobjetos, cuatro secciones en total por caja. Cada sección debe ser lisa con un mínimo de rasgaduras, grietas o pliegues. Las neuronas piramidales deben estar teñidas oscuramente de alrededor de 20 a 25 micrómetros de tamaño con una forma piramidal y dendritas apicales visibles.

Durante la LCM, después de que el láser ha pulsado a través de la película termoplástica, las células se adhieren a la tapa y, por lo tanto, ya no están en el portaobjetos dejando el tejido circundante. Detrás aproximadamente del 85 al 100% de las neuronas deben adherirse a la tapa con las tapas HS de captura en la configuración macro y el ajuste correcto de la potencia y la fuerza del láser. Para cada sección, debe obtener alrededor de 500 a 700 células por sección, lo que da como resultado al menos 500 picogramos de ARN total por caso.

Después del aislamiento total del ARN, la calidad del ARN se evalúa mediante un electroferograma y un gel virtual a través del BioRad Experian. En el electroferograma, debería ver dos picos distintos que corresponden a las unidades de ARN ribosómico 18 s y 20 s con tejido postmortem. Sin embargo, no siempre es así, ya que el tejido puede degradarse debido a factores previos al corte.

Normalmente verá una gran protuberancia que indica degradación, con un pico grande de alrededor de 18 s y un pico más pequeño de 28 s, como lo indican las flechas rojas. Por el contrario, el ARN de mala calidad con demasiada degradación se indicará mediante un electroferograma con un área grande debajo de su curva. Además de un cambio descendente en la ubicación de la propagación para probar la calidad del ARNm después de dos rondas de amplificación lineal, utilizamos tanto el chip de laboratorio estándar BioRad Experian Sense como el espectrofotómetro NanoDrop.

La tecnología tradicional de microarrays de Atrics requiere que la propagación de la transcripción de ARNm tenga al menos 600 nucleótidos de longitud para ser detectada con este protocolo. La propagación del ARNm alcanzó el rango de 1000 nucleótidos, como lo indica el electroferograma, con grandes picos que descienden lentamente en función del tiempo. Este resultado también es confirmado por el gel virtual.

Si las longitudes de transcripción son inferiores a 600 nucleótidos, no se debe incluir la muestra Para la hibridación, las lecturas de NanoDrop indicaron un promedio de dos 60 sobre una proporción de dos 80 o una pureza de 2,5 en todas las muestras. La concentración media fue de 1,7 microgramos por microlitro, lo que dio como resultado aproximadamente 50 microgramos de ARNm por muestra, suficiente tanto para el análisis de microarrays como para la posterior validación, que requiere entre 15 a 20 microgramos de ARNm y la posterior validación de los resultados con QR TPCR. Nuestros resultados indican que con este protocolo, tanto la cantidad como la calidad del ARN obtenido son lo suficientemente buenas como para investigar las diferencias de expresión génica a través del chip atrix human X three P.

Después de la hibridación con el chip Atrics Human X three P, logramos un porcentaje de llamadas de un promedio de 26.6%, lo que indica intensidades adecuadas de hibridación y sonda. Acabamos de mostrarte cómo capturar con láser neuronas parametálicas a partir de tejido cerebral humano postmortem para utilizar el ARN obtenido de estas células. Para los estudios de perfiles de microarrays G, al realizar este procedimiento, es importante realizar todos los pasos en un entorno libre de ARN y completar los pasos de manera oportuna para preservar la integridad del ARN.

Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.