La obtención de ARN de alta calidad a partir de poblaciones de células individuales en tejido cerebral humano post-mortem

Este procedimiento comienza con la sección de bloques de tejido congelados en vapor de nitrógeno líquido de ocho micrómetros en un criostato ajustado a menos 17 grados Celsius sobre portaobjetos de vidrio lisos y no cargados. Posteriormente, las secciones se tiñen con el kit de tinción histo gene. Tras identificar las neuronas piramidales, aproximadamente 500 células se capturan mediante láser en la tapa de captura HS.

El capuchón con las células se coloca en un tubo de microcentrífuga que contiene 50 microlitros de tampón de extracción, dado la vuelta, y se introduce en un tubo Falcon previamente colocado en Irak, sumergido en un baño de agua ajustado a 42 grados Celsius. Tras un breve paso de centrifugación, se retira el capuchón. La solución restante está entonces lista para el aislamiento de ARN.

Hola, soy Charmaine Peterson del laboratorio de Wilson Wu en el Departamento de Neurociencia Estructural y Molecular del Hospital McLean. Hoy les mostraremos un procedimiento para capturar mediante láser neuronas parametales de tejido cerebral humano postmortem. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la expresión diferencial de genes en el giro superior y el giro pobre de sujetos con esquizofrenia, empleando tecnología de microarreglos.

Así que comencemos. Los tejidos cerebrales se obtuvieron del Centro de Recursos de Tejido Cerebral de Harvard en bloques congelados en vapor de nitrógeno líquido antes de la sección del tejido. Es importante reducir la contaminación por ARN en todas las superficies; por ello, el área de trabajo, la hoja de corte y los portaobjetos se tratan con una solución de descontaminación de ARN, como RNA SAP, y se limpian con etanol al 100 %.

Este procedimiento comienza con el corte de bloques de tejido congelados en vapor de nitrógeno líquido en un criostato ajustado a menos 17 grados Celsius, colocándolos sobre portaobjetos de vidrio lisos sin carga. Las secciones de tejido ya están listas para la identificación de neuronas piramidales utilizando el kit de tinción histo gene quick. Prepare la serie de deshidratación con etanol: alícuotas de 25 mililitros de las concentraciones adecuadas de etanol y agua libre de ARN en los frascos de tinción proporcionados con el kit histo gene.

Coloque todos los frascos en un cubo de hielo, excepto un frasco de etanol al 75%. Coloque ese frasco de etanol al 75% en el congelador a menos 20 grados Celsius. A continuación, prepare la solución de tinción añadiendo un microlitro de inhibidor de ARN por cada 100 microlitros de solución de tinción.

Dado que se van a teñir cuatro secciones de tejido en dos portaobjetos, se añaden cuatro microlitros de inhibidor de ARN a 400 microlitros de la solución de tinción en un tubo microcentrífugo. Mantenga la solución de tinción sobre hielo. Bajo una campana extractora.

Agregue tamices moleculares al frasco de xileno para eliminar el exceso de agua, el cual podría comprometer la separación del tejido. Encienda el baño de agua con la temperatura ajustada a 42 grados Celsius y coloque un tubo Falcon de 50 mililitros sostenido por un soporte en el baño de agua. Retire dos portaobjetos del congelador a menos 80 grados Celsius y déjelos descongelar sobre una toalla Kim.

Durante aproximadamente 30 segundos o justo hasta que las esquinas de los portaobjetos comiencen a descongelarse, fije brevemente el tejido en etanol al 75 % durante 30 segundos en el congelador a menos 20 grados Celsius. Luego, utilizando pinzas libres de RNAsa, transfiera los portaobjetos a agua libre de nucleasas para un lavado de 32 segundos. Después de lavar los portaobjetos, delimite las secciones con un rotulador PAP para concentrar la solución de tinción sobre la sección; tiña las cuatro secciones con la solución de tinción histo gene durante 20 segundos. Con 97 microlitros de la tinción más inhibidor de RNAsas por sección, deshidrate las secciones en el etanol previamente preparado sobre hielo durante 30 segundos por paso.

El paso final con etanol al 100 % debe prolongarse hasta tres minutos para lograr una deshidratación suficiente que permita un adecuado levantamiento del tejido. Por último, sumerja los portaobjetos en xileno durante cinco minutos, dejándolos secar al aire completamente antes de proceder a la microdisección con láser; los neuronas piramidales deben eliminarse inmediatamente después de la tinción, según el procedimiento para microdisección láser de una sola célula. La MICRODISECCIÓN CON LÁSER o LCM requiere un baño de agua a 42 grados Celsius que contenga un tubo Falcon de 50 mililitros sostenido por un soporte, el cual fue preparado previamente.

La microdisección láser de una sola célula se realiza con el sistema y el software de captura ARCTURUS XT. Para comenzar este procedimiento, cargue los portaobjetos y las cubiertas en el equipo arcturus XT. Utilice las cubiertas Capture HS, pero mantenga la configuración del programa en modo macro.

Haga clic en el cuadro cargar con vista general para obtener una imagen general de cada portaobjetos. Ajuste el enfoque de brillo a dos aumentos para determinar la sección óptima para la captura láser. Evite secciones de tejido con plegado excesivo, pero elija secciones que estén intactas, lisas y teñidas.

Coloque una cubierta sobre la zona general donde realizará la captura, asegurándose de incluir la zona que se va a capturar en nuestro caso, la capa tres de la corteza. Asegúrese de que los rieles de la cubierta no reposen sobre ningún pliegue, ya que esto inclinaría la cubierta y daría lugar a tamaños de punto variables.

A continuación, confirme manualmente la ubicación del punto del láser de infrarrojos con un aumento de 40 x. La cruz azul debe estar centrada dentro del punto del láser de infrarrojos. Si no lo está, ajuste su ubicación haciendo clic derecho sobre el punto y seleccionando ubicar punto de IR.

Con un aumento de 40x, identifique las neuronas piramidales según los siguientes criterios: uno, que las células tengan forma piramidal, y dos, que sea posible identificar la porción proximal de las dendritas apicales y/o basales. Guarde la posición del casquete haciendo clic en el signo más en la función de posición. De este modo, si el casquete se mueve, siempre regresará exactamente al mismo lugar en el que ajustó el tamaño del punto.

Introduzca estos valores en el cuadro de control: 70 en potencia y 16 en duración. Dado que estos parámetros son específicos para nuestro tejido, recomendamos que pruebe y ajuste estas variables según su muestra de tejido específica antes de comenzar. Al capturar células individuales con el láser, desactive la opción de mover automáticamente la platina y asegúrese de que el símbolo de tamaño correcto coincida con el símbolo en el panel de la derecha.

Seleccione la opción de círculo en la parte inferior derecha para seleccionar una neurona que desee probar la captura. Después de alinear la cruz azul con el círculo, active el láser haciendo clic en el punto de IR de prueba. El punto producido por el láser debe presentar primero un anillo oscuro definido alrededor del objeto capturado.

Asegúrese de que el anillo sea lo suficientemente grande como para abarcar la célula, pero lo suficientemente pequeño como para no incluir tejido no deseado u otras células. Si este anillo es demasiado tenue, la célula no fue capturada. Si hay un punto oscuro en el centro del anillo oscuro, entonces la intensidad del láser o la duración es excesiva.

Repita este proceso en diferentes partes del tejido dentro de la capa que desee capturar. Para verificar que el tamaño del punto no varíe según la ubicación, ajústelo según sea necesario. Identifique neuronas piramidales para la captura de aproximadamente 500 células.

Pulse el botón de captura con láser para capturar las células. Mueva la tapa a la estación de control de calidad. Asegúrese de que se hayan eliminado al menos el 90% de las neuronas.

Si no es así, capture más células en la zona donde se capturaron la mayoría de las células. Coloque la tapa en un tubo microcentrífugo de 0,5 mililitros que contenga 50 microlitros de tampón de extracción. La tapa ha sido diseñada para encajar perfectamente y evitar que el tampón se filtre.

Dar la vuelta al ensamblaje, asegurándose de que el tampón de extracción cubra toda la tapa, y colocarlo en la parte inferior de un tubo Falcon de 50 mililitros en un baño de agua ajustado a 42 grados Celsius. Incubar las neuronas durante 30 minutos para eliminar el tejido de la tapa; tras la incubación, centrifugar el tubo y el ensamblaje de la tapa durante dos minutos a 800 gs. Después de la centrifugación, retirar la tapa.

Si el aislamiento de ARN solo se realizará en un momento posterior, almacene el extracto celular restante a menos 80 grados Celsius. De lo contrario, continúe con el aislamiento de ARN a partir del extracto celular, como se muestra en la siguiente sección. El aislamiento de ARN se realiza utilizando el kit de aislamiento PICO pure, que está diseñado para aislar pequeños números de células a partir de muestras de LCM y para conservar ARNm de baja abundancia.

Para comenzar este procedimiento, agregue etanol al 70 % proporcionado con el kit al extracto celular y centrifugue en una columna de purificación acondicionada previamente. Con el fin de unir el ARN al filtro de la columna después del lavado, trate el ARN con D Ns para eliminar el riesgo de interferencia de ADN. Este paso es particularmente importante en aplicaciones posteriores, como la R-T-P-C-R en tiempo real.

Después de la digestión del ADN, agregue 40 microlitros del tampón de lavado uno y centrifugue la columna de purificación durante 15 segundos a 8.000 Gs. A continuación, continúe con los lavados según el protocolo proporcionado con el kit, pero extienda el paso final de lavado con el tampón de lavado dos de dos a dos minutos y medio para asegurar que no quede tampón de lavado en la columna, lo cual podría reducir el rendimiento de ARN. Transfiera la columna a otro tubo de microcentrífuga. Agregue el tampón de elución e incube sobre el filtro en la columna durante un minuto; luego centrifugue la columna para eluir el ARN.

Finalmente, verifique la calidad del ARN extraído utilizando un chip Experian High Sense, que proporciona un gel virtual y un electroferograma; pipete 1,3 microlitros de la muestra en un tubo de 0,5 mililitros. Para la prueba de control de calidad, congele el resto de la muestra a menos 80 grados Celsius. Una vez verificada la calidad del ARN, este puede amplificarse, marcarse e hibridarse.

Para el análisis de perfilado de expresión génica, se realizarán dos rondas de amplificación lineal con el kit ribo amp HS plus, lo que debería producir aproximadamente 50 microgramos de ARN amplificado, suficiente para llevar a cabo experimentos de microarreglo y Q-R-T-P-C-R. El kit de etiquetado turbo biotina y el etiquetado de molecular devices se utilizan para marcar el ARN amplificado. Finalmente, se realizará el perfilado de expresión génica utilizando el chip génico humano X three P pro beret de atrix.

El corte de tejido debe dar como resultado dos portaobjetos con dos secciones por portaobjetos, cuatro secciones en total por caso. Cada sección debe ser lisa con mínimos desgarros, grietas o pliegues. Las neuronas piramidales deben estar intensamente teñidas, con un tamaño de alrededor de 20 a 25 micrómetros, forma piramidal y dendritas apicales visibles.

Durante la MAC, después de que el láser ha pulsado a través de la película termoplástica, las células se adhieren al casquete y por lo tanto ya no permanecen en el portaobjetos con el tejido circundante. Aproximadamente entre el 85 y el 100 % de las neuronas deben adherirse al casquete con los casquetes de captura HS en configuraciones macro y un ajuste correcto de la potencia e intensidad del láser. Para cada sección, se debe obtener alrededor de 500 a 700 células por sección, lo que resulta en al menos 500 picogramos de ARN total por caso.

Después del aislamiento de ARN total, la calidad del ARN se evalúa mediante un electroferograma y un gel virtual utilizando el BioRad Experian. En el electroferograma, deberían observarse dos picos distintos correspondientes a las unidades de ARN ribosómico 18 s y 20 s con tejido post mortem. Sin embargo, esto no siempre ocurre, ya que el tejido puede estar degradado debido a factores previos al corte.

Normalmente observará un gran pico que indica degradación, con un pico amplio alrededor de los 18 s y un pico más pequeño a los 28 s, como indican las flechas rojas. En contraste, el ARN de mala calidad con excesiva degradación se indicará mediante un electroferograma con un área grande bajo su curva. Además de un desplazamiento hacia abajo en la ubicación de la dispersión para evaluar la calidad del ARNm tras dos rondas de amplificación lineal, utilizamos tanto el chip estándar BioRad Experian Sense Lab como el espectrofotómetro NanoDrop.

La tecnología tradicional de microarreglos Atrics requiere que la longitud de la transcripción de ARNm sea de al menos 600 nucleótidos para poder detectarse mediante este protocolo. La extensión del ARNm alcanzó el rango de 1000 nucleótidos, como lo indica el electroferograma, con picos grandes que descienden lentamente en función del tiempo. Este resultado también se confirma mediante el gel virtual.

Si las longitudes de los transcritos son más cortas que 600 nucleótidos, la muestra no debe incluirse. Para hibridación, las lecturas del NanoDrop indicaron un promedio de una relación de 260 sobre 280 o pureza de 2,5 en todas las muestras. La concentración promedio fue de 1,7 microgramos por microlitro, lo que resultó en aproximadamente 50 microgramos de mRNA por muestra, cantidad suficiente tanto para análisis de microarreglo como para validación posterior, que requiere entre 15 y 20 microgramos de mRNA y validación subsiguiente de los resultados mediante RT-PCR cuantitativa. Nuestros resultados indican que con este protocolo, tanto la cantidad como la calidad del ARN obtenido son lo suficientemente buenas como para investigar diferencias en la expresión génica mediante el chip Atrix Human X Three P.

Después de la hibridación con el chip Atrics Human X three P, obtuvimos porcentajes de llamadas con un promedio del 26,6 %, lo que indica una hibridación adecuada y intensidades de sonda suficientes. Acabamos de mostrarle cómo capturar mediante láser neuronas parametales a partir de tejido cerebral humano post mortem para utilizar el ARN obtenido de estas células. Para estudios de perfilado mediante microarreglos G, al realizar este procedimiento es importante llevar a cabo todos los pasos en un entorno libre de ARNasas y completarlos de manera oportuna para preservar la integridad del ARN.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.