Name: Aislamiento del ARN de síntesis embrionarias pez cebra y el cDNA de análisis de expresión génica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-07T16:40:00.000+00:00
Duration: 15 min 21 s
Description: Aprende a aislar ARN de alta calidad de embriones de pez cebra Danio rerio y sintetizar cDNA para análisis de expresión génica mediante microarrays. Este protocolo facilita estudios de biología molecular.

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Parte 1: Extracción de ARN total utilizando el reactivo TRIzol Cuando se trabaja con el ARN es muy importante para trabajar en un ambiente libre de RNAsas. Precauciones simples como tener pipetas reservados para uso exclusivo con los procedimientos de ARN y la pulverización de la zona de trabajo con un reactivo descontaminante (por ejemplo, RNAsa Away) antes de iniciar el procedimiento es muy útil. <ol><li> Para lograr una suficiente cantidad de ARN de embriones de pez cebra piscina de 50 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y eliminar la mayor cantidad de agua posible con una pipeta. </li><li> Inmediatamente añadir 250 l de reactivo TRIzol 1 al tubo de microcentrífuga que contiene los embriones. TRIzol reactivo contiene fenol y sólo debe utilizarse bajo una campana de humos. </li><li> Lisis y homogeneizar los embriones con una mano de pellet (aproximadamente 20 golpes) hasta que el tejido es suficientemente perturbado. </li><li> Cuando las células son lo suficientemente homogeneizado, añadir 750 l de reactivo TRIzol igual a un volumen total de 1 ml. </li><li> Para permitir la disociación completa de los complejos de nucleoproteína, incubar muestras homogeneizadas durante 5 minutos a temperatura ambiente. En esta etapa, la muestra puede ser flash congelado en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C o el protocolo se puede continuar. </li><li> Para continuar añadir 0,2 ml de cloroformo y oscilar el tubo durante 15 segundos para mezclar. </li><li> Incubar la muestra durante 2 minutos a temperatura ambiente y centrifugar a 12.000 xg durante 15 minutos a 4 ° C. </li><li> La mezcla se separará en una menor rojo de fenol-cloroformo fase, una interfase, y un descolorido fase acuosa superior. La fase acuosa superior contiene el ARN. La capa superior debe formar parte de alrededor del 60% del volumen inicial de TRIzol (aproximadamente 0,6 ml). La transferencia de la capa acuosa superior a un tubo de microcentrífuga nuevo utilizando una pipeta de 1 ml con cuidado de no transferir ninguna de la capa de interfase. </li><li> Para precipitar el ARN añadir 0,5 ml de isopropanol. </li><li> Dejar que la muestra llegue a temperatura ambiente durante 10 minutos y centrifugar la muestra a 12.000 xg durante 10 minutos a 4 ° C. ARN se forma una bolita de gel en la parte inferior del tubo. </li><li> Sin perturbar el sedimento, separar el sobrenadante con una pipeta y se lava el precipitado en 1 ml de etanol al 75%. Mezclar la muestra por inversión suave y centrifugar a 7500 xg durante 5 minutos a 4 ° C. </li><li> Después de la centrifugación, separar el etanol con una pipeta y que la muestra se seque mientras está invertido durante 10 minutos. </li><li> Resuspender el pellet añadiendo 100 l de RNasa libre de agua e incubar la muestra a 55 ° C durante 10 minutos. Se recomienda a los dedos del vórtice con frecuencia durante la incubación para ayudar en la rehidratación de ARN. Si lo desea, puede comprobar la calidad y cantidad de la muestra con un ND-1000 espectrofotómetro NanoDrop o directamente pasar a la siguiente etapa. </li></ol> Parte 2: El ARN de limpieza utilizando el Qiagen RNeasy Mini Kit El Qiagen RNeasy Mini Kit 2 es útil en la eliminación de los contaminantes y las impurezas de una muestra de ARN aislado de otros métodos. Para este procedimiento, β-mercaptoetanol, el etanol y el agua libre de nucleasa se necesitan, además de los componentes incluidos en el kit. Una opción de tratamiento con ADNasa se recomienda durante este procedimiento. <ol><li> Tras el primer uso del kit, Buffer RPE deberán ser preparados por la adición de 4 volúmenes de etanol al 100% para un volumen de buffer RPE. </li><li> En el día del procedimiento, el tampón RLT tendrá que estar preparado fresco. Calcular la cantidad total de RLT buffer que se necesitarán. Un volumen de 350 l que se necesita por muestra. Para preparar el tampón RLT, añadir 10 l de β-mercaptoetanol por cada 1 ml de solución tampón. Esto debe hacerse bajo la campana de humos. </li><li> Para cada muestra se añaden 350 l de tampón RLT y 250 l de etanol al 100%. Mezclar bien con la pipeta hacia arriba y abajo varias veces. </li><li> Transferir la muestra, que debe ser de aproximadamente 700 l, en una columna RNeasy que se coloca en un tubo de recogida de 2 ml y centrifugar a 8000 xg durante 1 minuto a temperatura ambiente. </li><li> Después de centrifugar, descartar el flujo a través y añadir 700 l de tampón RW1 a una columna de giro RNeasy. </li><li> Centrifugar la muestra a 8.000 xg durante 1 minuto a temperatura ambiente y luego descartar el flujo a través. </li><li> Tratamiento con DNAsa Qiagen Kit RNasa libre de DNasa: DNAsa tratamiento es opcional, pero es muy recomendable para las muestras de la más alta calidad. <ol style="list-style-type:upper-alpha;"><li> Al recibir el kit de tratamiento de DNAsa, tendrá que preparar la solución de DNAsa I de valores mediante la adición de 550 l de nucleasa libre de agua a la DNAsa. Mezclar suavemente por inversión y no del vórtice. Alícuotas en viales de un solo uso con 10 l de la solución madre. Puede almacenar la solución madre a -20 ° C durante un máximo de 9 meses. Las alícuotas descongeladas se pueden almacenar a 4 ° C durante 6 semanas si es necesario, pero no volver a congelar las alícuotas después de la descongelación. </li><li> Para preparar la mezcla de DNasa I incubación añadir 70 l de búfer DDR a 10 l s DNAsa Itac solución por muestra. Mezclar por inversión suave y tubo de centrífuga brevemente para recoger el líquido residual de los lados del tubo. Añadir 80 l DNAsa mezcla de incubación que directamente a la columna de centrifugación RNeasy. Incubar el tratamiento DNAsa durante 30 minutos a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Después del tratamiento con DNAsa añadir 350 l RW1 Buffer a la columna de centrifugación y centrifugar a 8000 xg durante 1 minuto a temperatura ambiente. </li><li> Después de la centrifugación descartar el flujo a través de RPE y añadir 500 l de búfer en la columna de giro. Incubar la muestra durante 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugar la muestra a 8.000 xg durante 1 minuto a temperatura ambiente y desechar el flujo a través. </li><li> Después de la centrifugación añadir 500 l de etanol al 75% en la columna de giro. </li><li> Repetir la centrifugación a 8.000 xg, pero durante 2 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Después de la centrifugación descartar el flujo a través de la columna y permitir que se seque durante 5 minutos. </li><li> Inmediatamente se centrifuga a 8000 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente para eliminar a la izquierda sobre los rastros de etanol. </li><li> Después de la centrifugación es la transferencia completa de la columna de centrifugación en un nuevo tubo de 1.5 ml de recogida y se añaden 10 l agua libre de nucleasa. Incubar durante 1 minuto y centrifugar a 10.000 xg durante 1 minuto a temperatura ambiente. El ARN estará en el flujo a través. </li><li> Añadir otro l 10 de agua libre de nucleasa a la columna de centrifugación y se incuban a temperatura ambiente durante 1 minuto. Centrifugar la muestra a 10.000 xg durante 1 minuto a temperatura ambiente. </li><li> Después de la centrifugación retirar y desechar la columna de giro. ARN estará en el flujo a través. </li><li> Comprobar la cantidad y calidad del ARN utilizando un NanoDrop ND-1000 espectrofotómetro siguiendo las instrucciones del fabricante. </li><li> Además, corre un gel de desnaturalización o de utilizar un Agilent 2100 Bioanalyzer para comprobar la integridad del ARN. </li><li> Las muestras deben ser almacenadas a -80 ° C hasta que la síntesis de ADNc se puede realizar. </li></ol> Parte 3: Síntesis de cDNA utilizando la Invitrogen superíndice primer capítulo del Sistema El ARN es fácilmente propensa a la ruptura por RNAsas que conduce a la degradación. Como resultado, muchos protocolos de expresión de los genes se han desarrollado para utilizar un producto de cDNA más estable que ha sido directamente sintetiza a partir del ARN. Aquí detallamos la síntesis de cDNA primer capítulo con la Invitrogen superíndice primer capítulo de síntesis del sistema tres. Cada reacción de síntesis de cDNA con capacidad para 5 g de ARN. <ol><li> Antes de iniciar el procedimiento de mezcla y centrifuga brevemente cada componente. </li><li> Prepare ARN / mezcla de imprimación en un tubo de microcentrífuga estéril 0,5 ml como se indica en la Tabla 1. </li><li> Incubar la muestra a 65 ° C durante 5 minutos. </li><li> Inmediatamente la transferencia de muestras de suspensión de hielo durante 10 minutos. </li><li> Mientras que la muestra se enfría preparar una mezcla maestra con los componentes descritos en la Tabla 2. Los volúmenes están indicadas por una reacción. Ajustar los volúmenes de acuerdo con el número total de reacciones. </li><li> Después de enfriar, añadir 9 l de la mezcla maestra preparada en el paso 5 para cada ARN / mezcla de imprimación. Mezclar suavemente y recoger por centrifugación breve. El volumen total de cada muestra debe ser de 19 l. </li><li> Incubar la muestra a 42 ° C durante 2 minutos en un termociclador. </li><li> Añadir 1 l (50 unidades) de superíndice II RT a cada tubo, mezclar e incubar a 42 ° C durante 60 minutos en un termociclador. </li><li> Terminar la reacción a 70 ° C durante 15 minutos y luego se muestra frío a 4 ° C. Un termociclador puede ser programado para los pasos 8 y 9. </li><li> Después de la muestra ha llegado a 4 ° C, la transferencia de la reacción a un baño de hielo. </li><li> En el hielo añadir 1 l de RNasa H a cada tubo y se incuba durante 20 minutos a 37 ° C. El volumen total es ahora de 21 microlitros. Además de RNasa H en la muestra se degrada el ARN molde y dejar sólo el producto de cDNA único. </li></ol> Parte 4: Aislamiento de ADNc y precipitación <ol><li> A 1,5 ml de la fase de bloqueo del tubo de gel se utiliza en el aislamiento del producto de cDNA. Preparar un 1,5 ml de fase de bloqueo del tubo de gel mediante centrifugación a 12.000 xg durante 2 minutos. El gel debe ser todo en la parte inferior del tubo. </li><li> Añadir 81,5 l de fenol (Tris-saturadas, tamponada a pH 8,0), 81,5 l de cloroformo alcohol isoamílico 24:1, y la muestra (21 l) en el tubo de gel de fase de bloqueo. Mezcla varias veces por inversión suave. </li><li> Centrifugar la muestra a 12.000 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> El cDNA debe estar en la fase acuosa superior. Transferir la fase superior a un tubo de microcentrífuga limpio de 1.5 ml. El volumen total debe ser de alrededor de 20 microlitros. </li><li> Añadir 1X volumen de 3 M NaOAc, pH 5,2 y mezclar suavemente. Por ejemplo, si el volumen de la fase acuosa superior era igual a 20 l, tendrá que añadir 2 l de 3 M NaOAc, pH 5,2. </li><li> Añadir 7 l de 5 mg / ml de glucógeno y mezclar suavemente. </li><li> Añadir 1X volumen de isopropanol y mezclar suavemente. En general, esta es de unos 30 l de isopropanol. </li><li> Que la muestra de incubar a temperatur ambientee durante 10 minutos y centrifugar a 12.000 xg durante 20 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Una pequeña bolita de cDNA que se forman en la parte inferior del tubo. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta. </li><li> Añadir 500 l de etanol al 70% y mezclar por inversión. </li><li> Centrifugar la muestra a 12.000 xg durante 5 minutos. </li><li> Después de la centrifugación separar el sobrenadante con una pipeta y repetir el lavado de etanol al 70% y centrifugación (medidas 10 y 11). </li><li> Después de la centrifugación separar el sobrenadante con una pipeta. Si no es el líquido residual en los lados del tubo, que puede ser recogida por una breve gira el tubo. Elimine cualquier exceso de líquido y permitir que se seque el precipitado a temperatura ambiente durante 5 minutos. </li><li> Añadir 20 l de agua libre de nucleasa para rehidratar la pastilla. Coloque la muestra a 55 ° C durante 5 minutos para la rehidratación de la pastilla. </li><li> La cantidad y la calidad del producto de cDNA se comprueba utilizando un NanoDrop ND-1000 espectrofotómetro siguiendo las instrucciones del fabricante. El cDNA se pueden almacenar a -20 ° C. </li></ol> Resultados representante Después de la limpieza de ARN, de aproximadamente 15 g de ARN de alta calidad total se puede esperar a partir de 50 embriones de pez cebra. Para evaluar la calidad total de ARN, un espectrofotómetro, electroforesis en gel, y un Bioanalyzer Agilent 2100 puede ser utilizado. ND-1000 NanoDrop espectrofotómetro se puede utilizar para evaluar la absorbancia a 260 nm en comparación con la absorbancia a 280 nm (Figura 1). El A 260 / A 280 puede revelar la presencia de contaminantes y dar pruebas de una posible degradación. Un 260 / A 280 de 1,9-2,0 se considera aceptable. Además, es altamente recomendable que un gel de desnaturalización del ARN puede ejecutar para evaluar la integridad del ARN. Cadenas de ARN se separan en función de su tamaño, con menor migración de líneas más abajo en el gel. Una muestra no degradada, aparecerá como una prueba con dos bandas muy resistentes. La citología es el resultado de una población de diferentes cadenas de ARNm de tamaño y las bandas correspondientes a 28S y 18S ARNr. La banda 28S debe ser aproximadamente el doble de intensa que la banda 18S (Figura 2). Por otra parte, el total de la integridad del ARN se puede evaluar utilizando un Agilent 2100 Bioanalyzer. Dos picos distintos que representan el rRNA 28S y 18S se espera (Figura 3). El pico 28S debe ser mayor que el 18S pico con el área bajo los picos de aproximadamente 2:1, respectivamente. Dos picos distintos, no se observó en muestras degradadas. RNA de muestras que exhiban degradación no debe ser llevado a través de posteriores procedimientos experimentales. La prueba espectrofotométrica se puede utilizar para evaluar la calidad del producto de cDNA (Figura 4). El A 260 / A 280 debe estar alrededor de 1,8. reacciones cDNA con una entrada de 5 g de ARN total rutinariamente rendimiento mg 1-2 de cDNA producto en nuestro laboratorio. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Un espectro NanoDrop de muestra de RNA. Después de la limpieza de ARN, ARN cantidad y la calidad se puede evaluar con un ND-1000 NanoDrop espectrofotómetro. Aproximadamente 15 mg de ARN total de alta calidad de forma rutinaria dado a partir de 50 embriones de pez cebra con un A 260 / A 280 alrededor de 1.9-2.0. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Un gel de desnaturalización del ARN. Para evaluar la integridad del total aislamiento de ARN, un gel de desnaturalización del ARN se puede correr. Una prueba con dos bandas brillantes que corresponden a 28S y 18S ARNr se espera. La banda 28S debe ser aproximadamente el doble de intensa que la banda 18S. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Un rastro de una muestra de ARN de una bioanalizador. Para evaluar la integridad del total aislamiento de ARN, las muestras pueden ser analizadas en un Agilent 2100 Bioanalyzer. Dos picos agudos, que corresponde al 28S y 18S rRNA, debe ser visible. El pico 28S debe ser mayor que el 18S pico con el área bajo los picos de aproximadamente 2:1, respectivamente. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Un espectro NanoDrop de una muestra de DNA. La prueba espectrofotométrica con un NanoDrop ND-1000 se puede utilizar para evaluar la cantidad y calidad del producto de cDNA. El A 260 / A 280 debe estar alrededor de 1,8. reacciones cDNA con una entrada de 5 ug de RNA total rutinariamente rendimiento 1.2 ug de cDNA en nuestro laboratorio. Tabla 1. Componentes para añadir el RNA / mezclas de imprimación en el paso 2 de la síntesis de cDNA. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volumen </td></tr><tr><td> El ARN total (hasta 5 g) </td><td> 10 l </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP mix </td><td> 1 l </td></tr><tr><td> Oligo (dT) 12-18 (0.5 mg / l) </td><td> 1 l </td></tr><tr><td> Agua tratada con DEPC </td><td> n l </td></tr><tr><td> Volumen total </td><td> 10 l </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Mezcla de reacción para el paso 5 de la síntesis de cDNA. Los volúmenes indicados son por reacción. Aumentar los volúmenes de cada componente para el número total de reacciones. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Componente </td><td> Volumen </td></tr><tr><td> 10X Buffer RT </td><td> 2 l </td></tr><tr><td> 25 mM MgCl2 </td><td> 4 l </td></tr><tr><td> 0,1 mM DTT </td><td> 2 l </td></tr><tr><td> RNAseOUT </td><td> 1 l </td></tr></tbody></table>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22TRIzol+Reagent+Manual%22">TRIzol Reagent Manual</a>. , (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22RNEasy+Mini+Handbook%22">RNEasy Mini Handbook</a>. , 4th ed, (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22SuperScript+First-Strand+Synthesis+System+for+RT-PCR%22">SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR</a>. , Version E. (2003).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La fragilidad de la molécula de ARN es la consideración más importante que debe tenerse en cuenta a lo largo de este protocolo. Material estéril que se RNasa libre siempre debe ser utilizado en una zona de RNasa libre del laboratorio. Es de gran ayuda para reservar una parte del laboratorio que deberán utilizarse para los procedimientos de ARN solamente. Esta área debe ser rociado con frecuencia con un producto de la eliminación de RNAsa, como la RNAsa lejos. El RNA de muestras siempre deben ser manejados con guantes y ...

<table><tbody><tr><td>Glicógeno (5 mg/ml)</td><td>Ambion</td><td>9510</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-100</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Pestillos para Pellets con Tubo de Microcentrífuga</td><td>VWR international</td><td>KT749520-0090</td><td></td></tr><tr><td>Gel de Bloqueo de Fase Light, 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>2302800</td><td></td></tr><tr><td>Fenol saturado con Tris</td><td>Roche Group</td><td>3117944001</td><td></td></tr><tr><td>RNAse Away</td><td>VWR international</td><td>17810-491</td><td></td></tr><tr><td>Kit de DNasa Libre de RNAsa</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Kit RNEasy Mini</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Síntesis de Primera Cadena SuperScript&amp;#174; para RT-PCR</td><td>Invitrogen</td><td>11904-018</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento del arn de síntesis embrionarias pez cebra y el cdna de análisis de expresión génica

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Muchos procedimientos de laboratorio importantes y complejas requieren una entrada de alta calidad, el ARN intacto. Una muestra degradada o la presencia de impurezas puede llevar a resultados desastrosos en posteriores aplicaciones experimentales. Por lo tanto, de suma importancia el uso de técnicas sólidas con numerosas salvaguardias y controles de calidad para asegurar una muestra superior. Aquí, los detalles de un protocolo para aislar el ARN total a partir de embriones de pez cebra con todo un desnaturalizante químico disponible en el mercado y la limpieza posterior para eliminar los rastros de ADN y las impurezas mediante un kit comercial de aislamiento de ARN. Como el ARN es relativamente inestable y fácilmente propensa a la ruptura por RNAsas, la mayoría de los protocolos de ensayo de expresión génica utilizando un producto de cDNA que está directamente sintetizado a partir de una plantilla de ARN. Se detalla un procedimiento para convertir el ARN en el producto más estable cDNA utilizando un kit disponible comercialmente. A lo largo de estos procedimientos existen numerosos controles de calidad para asegurar que la muestra no es degradadas o contaminadas. El producto final de estos protocolos es cDNA que es adecuado para el análisis de microarrays, RT-PCR o el almacenamiento a largo plazo.

El aislamiento de alta calidad, intacta ARN es un paso esencial en los protocolos de laboratorio de muchos. Este sentido, demuestran la extracción de RNA a partir de embriones de pez cebra conjunto y la síntesis de ADNc para su posterior aplicación en diversos procedimientos experimentales, incluyendo el análisis de microarrays de expresión génica.

Aislamiento del ARN de síntesis embrionarias pez cebra y el cDNA de análisis de expresión génica

Muchos procedimientos de laboratorio importantes y complejos requieren la entrada de ARN intacto y de alta calidad. Una muestra degradada o la presencia de impurezas pueden conducir...

Para comenzar el aislamiento de ARN y obtener rendimientos suficientes, se transfieren 50 embriones de pez cebra a un tubo microfusilado con mortero. El ARN se extrae primero utilizando triol, reactivo y cloroformo tras una homogenización completa. Luego, el ARN se limpia y purifica utilizando el minikit Qiagen RNEZ para obtener ARN total de alta calidad, no degradado, apto para aplicaciones futuras y almacenamiento a largo plazo.El ARN se sintetiza en el producto de ADNc más estable. El ADNc se purifica para eliminar la cadena de la plantilla de ARN original. Hola, mi nombre es Sam Peterson del laboratorio de la Dra. Jennifer Freeman del Departamento de Ciencias de la Salud de la Universidad de Purdue.Hoy les mostraremos cómo extraer ARN de alta calidad de embriones enteros de pez cebra y convertirlo en el producto ADNc. Típicamente, utilizamos este procedimiento para estudiar perfiles de expresión génica. Así que comencemos.Al trabajar con ARN, es muy importante hacerlo en un entorno libre de RNasas. Tome precauciones simples, como utilizar pipetas reservadas exclusivamente para procedimientos con ARN y rociar el área de trabajo con RNAsa Away antes de iniciar la extracción de ARN total. Comience la extracción en la campana extractora y coloque 50 embriones de pez cebra en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Retire la mayor cantidad posible de agua e inmediatamente agregue 250 microlitros de reactivo TRIzol, que contiene fenol.Utilice un pistilo de pelador para triturar y homogeneizar los embriones durante aproximadamente 20 movimientos hasta que el tejido esté suficientemente descompuesto. Luego, agregue 750 microlitros de reactivo de triazol y incube durante cinco minutos a temperatura ambiente para permitir la disociación completa de los complejos de proteínas nucleares. Cuando hayan transcurrido los cinco minutos, agregue N 0.2 mililitros de cloroformo mezclando mediante agitación suave del tubo durante 15 segundos e incube la muestra durante dos minutos a temperatura ambiente; a continuación, centrifugue a 12,000 G durante 15 minutos a cuatro grados Celsius.La mezcla se separará en una fase inferior roja de fenol-cloroformo, una fase intermedia y una fase acuosa superior incolora. La capa superior tiene aproximadamente 0,6 milímetros de grosor y contiene el ARN; transfiera toda la capa acuosa superior, aproximadamente 0,6 milímetros, a un nuevo tubo micro FUZE, teniendo cuidado de no transferir ninguna parte de la capa intermedia. A continuación, para precipitar el ARN, agregue 0,5 mililitros de isopropanol y mezcle.Y dejemos la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos, luego centrifugue la muestra a 12.000 G durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. El ARN debe formar un pellet de consistencia gelatinosa. Retire el sobrenadante sin perturbar el pellet y lávelo añadiendo un mililitro de etanol al 75 %, mezclando mediante inversión suave y centrifugando a 7.500 G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.Después de la centrifugación, retire el etanol e invierta el tubo para secarlo durante 10 minutos. Reuspenda el precipitado añadiendo 100 microlitros de agua libre de RNAsas e incube a 55 grados Celsius durante 10 minutos. Vortexee frecuentemente con los dedos para facilitar la rehidratación del ARN.Ahora que el ARN ha sido extraído de los embriones, continúe con la purificación del ARN y el tratamiento con D a's. Para purificar el ARN, comience con un kit Rogen RN easy mini. Al primer uso, agregue cuatro volúmenes de etanol al 100 % a un volumen del tampón RPE trabajando en la campana extractora.Añada 10 microlitros de etanol beta-mercapto por cada mililitro de tampón RLT. Luego, añada 350 microlitros de tampón RLT y 250 microlitros de etanol al 100 % a la muestra, mezclando mediante pipeteo arriba y abajo varias veces, y transfiera toda la muestra a una columna RNeasy colocada en un tubo colector de dos mililitros. Centrifugue a 8.000 ×g durante un minuto a temperatura ambiente; tras la centrifugación, deseche el flujo atravesado y añada 700 microlitros de tampón RW1 a la columna de centrifugación.Centrifugue nuevamente a 8.000 G durante un minuto y deseche el flujo para eliminar el AD del muestra. A continuación, trate el ADN utilizando el kit de ADN libre de ARN. Al recibir el kit, agregue 550 microlitros de agua libre de nucleasas a los ADN y mezcle suavemente invirtiendo el tubo. Almacene la solución stock dividida en alícuotas de 10 microlitros y congele a menos 20 grados Celsius.Añada 70 microlitros del tampón RDD a 10 microlitros de la solución stock uno de ADN, mezcle mediante inversión suave, centrifugue brevemente y añada directamente a la columna R y fácil de girar A. Incube el tratamiento del ADN durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, añada 350 microlitros del tampón RW uno a la columna de giro, centrifugue a 8.000 G durante un minuto a temperatura ambiente, deseche el flujo pasante y añada 500 microlitros del tampón RPE a la columna de giro. Incube la muestra durante cinco minutos a temperatura ambiente.Centrifugar nuevamente a 8.000 G durante un minuto a temperatura ambiente, desechar el filtrado y añadir 500 microlitros de etanol al 75 % a la columna de centrifugación. Repetir la centrifugación a 8.000 G, pero durante dos minutos a temperatura ambiente; tras la centrifugación, desechar el filtrado y dejar secar la columna inmediatamente durante cinco minutos. Centrifugar a 8.000 G durante cinco minutos a temperatura ambiente para eliminar cualquier rastro residual de etanol.Ahora, transfiera la columna de centrifugación a un nuevo tubo colector de 1,5 mililitros y agregue 10 microlitros de agua libre de nucleasas; incube durante un minuto para eluir el ARN y centrifugue a 10.000 G durante un minuto. A temperatura ambiente, el ARN estará en el flujo atravesante. Repita la elución con otros 10 microlitros de agua.Verifique la cantidad y calidad del ARN utilizando un espectrofotómetro NanoDrop ND 1000 siguiendo las instrucciones del fabricante. Además, realice una electroforesis en gel desnaturalizante o utilice un bioanalizador Agilent 2100 para comprobar la integridad del ARN. Si la calidad y cantidad del ARN son satisfactorias, continúe con la síntesis de ADNc.Finalmente, almacene el ARN a menos 80 grados Celsius hasta que se pueda realizar la síntesis de ADN. Inicie la síntesis de ADN mezclando y centrifugando brevemente cada componente del cebador de ARN. Mezcle los NTPs de ARN y el oligo dt.Agregue cada componente a un tubo microfusible estéril de 0,5 mililitros hasta un volumen total de 10 microlitros. Para volúmenes específicos, consulte el protocolo escrito adjunto. Luego, incube la muestra a 65 grados Celsius durante cinco minutos.Transfiera inmediatamente la muestra a una mezcla de hielo durante 10 minutos. Mientras la muestra se enfría, prepare una mezcla maestra de tampón hasta un volumen total de nueve microlitros, como se indica en el protocolo escrito adjunto. Después del enfriamiento, combine la mezcla maestra de tampón con la mezcla de cebador de ARN, mezcle suavemente y recupere mediante una breve centrifugación. A continuación, incube la muestra combinada en el termociclador a 42 grados Celsius durante dos minutos.Para iniciar la transcripción inversa, agregue un microlitro de superscript two RT al tubo y mezcle. Incube a 42 grados Celsius durante una hora. Detenga la reacción a 70 grados Celsius durante 15 minutos.Luego enfríe la muestra a cuatro grados Celsius y transfiérala a un baño de hielo sobre hielo. Añada un microlitro de RNAsa H a la muestra e incube durante 20 minutos a 37 grados Celsius; la RNAsa H degrada la plantilla de ARN, dejando únicamente el producto de ADNc de cadena sencilla. La síntesis de ADNc ahora está completa, requiriendo solamente un paso adicional de purificación y concentración. Para aislar el producto de ADNc, prepare un tubo de gel de bloqueo de fases de 1,5 mililitros mediante centrifugación a 12.000 ×g durante dos minutos.Todos los geles deben estar en la parte inferior del tubo. Añada 81,5 microlitros de fenol saturado con tris tamponado a pH 8,0, 81,5 microlitros de cloroformo:isoamílico (24:1) y la muestra al tubo con gel de bloqueo de fases; mezcle varias veces mediante inversión suave y centrifugue la muestra a 12 000 ×g durante cinco minutos a temperatura ambiente. El ADNc debe estar en la fase acuosa superior.Transfiera la fase superior, que debe ser de aproximadamente 20 microlitros, a un tubo microfuger limpio de 1,5 mililitros. Para precipitar el ADNc, agregue dos microlitros de acetato de sodio tres molar a pH 5,2 y mezcle suavemente. Agregue siete microlitros de glicógeno al cinco miligramos por mililitro y mezcle suavemente.Luego, agregue 30 microlitros de isopropanol y mezcle suavemente; deje que la muestra se incube a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, centrifugue a 12.000 G durante 20 minutos a temperatura ambiente. Tras la centrifugación, aparece un pequeño pellet de ADNc en el fondo del tubo.Retire cuidadosamente el sobrenadante con un pipeteador. Lave el sedimento añadiendo 500 microlitros de etanol al 70 % y mezcle mediante inversión. Centrifugue la muestra a 12 000 ×g durante cinco minutos. Tras la centrifugación, retire el sobrenadante con un pipeteador.Repita el lavado, agregue etanol y centrifugue, luego elimine el sobrenadante SUP. Después del segundo lavado, centrifugue brevemente el tubo para recoger cualquier líquido residual. Retire todo el exceso de líquido y deje secar el pellet a temperatura ambiente durante cinco minutos.Luego, agregue 20 microlitros de agua libre de nucleasas para rehidratar el precipitado. Incube la muestra a 55 grados Celsius durante cinco minutos. Para la rehidratación, el ADN CD se puede almacenar a menos 20 grados Celsius.Finalmente, compruebe la cantidad y calidad del producto de ADN mediante un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 siguiendo las instrucciones del fabricante. La extracción y purificación de ARN a partir de 50 embriones de pez cebra proporciona habitualmente aproximadamente 15 microgramos de ARN total de alta calidad, según se evaluó utilizando un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000; la relación de absorbancia entre 60 y 80 es de alrededor de 1,9 a 2,0. La integridad del ARN extraído se evalúa mediante un gel de ARN desnaturalizante. El ARN aparece como una mancha difusa con dos bandas brillantes correspondientes al ARN ribosómico 18S y 28S.La banda de 28 s debe tener una intensidad aproximadamente el doble que la banda de 18 s. Alternativamente, la integridad del ARN se evalúa utilizando un bioanalizador Agilent 2100. Son visibles dos picos nítidos correspondientes al ARN ribosómico de 18 s y 28 s.El pico de 28 s debe ser mayor que el pico de 18 s. La transcripción inversa de cinco microgramos de ARN total habitualmente produce de uno a dos microgramos de ADNc, según se determina mediante un NanoDrop ND 1000. La relación de absorbancia de 60 a 80 de dos de ADNc es de aproximadamente 1,8.Acabamos de mostrarle cómo aislar ARN total de embriones enteros de pez cebra y convertir ese ARN en el producto de ADNc. Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener un ambiente libre de RNasas. Eso es todo.Gracias por ver el video y buena suerte con sus experimentos.

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