Gene mundial y Análisis de Expresión utilizando una plataforma de microarrays de oligonucleótidos de pez cebra

Este procedimiento comienza con ADNc sintetizado a partir de una plantilla de ARN de alta calidad. Primero, el ADNc se marca con el colorante fluorescente SI three. Tras completar la reacción de marcado, el ADNc marcado se purifica, aísla y se evalúa la calidad de la reacción de marcado.

El ADNc marcado se hibrida luego en un microarreglo. Tras la hibridación, se analizan los arreglos para determinar los niveles relativos de expresión génica en las muestras. Hola, mi nombre es Sam Peterson del laboratorio de la Dra. Jennifer Freeman en la Escuela de Ciencias de la Salud de la Universidad de Purdue.

Anteriormente, les hemos mostrado cómo extraer ARN de embriones de pez cebra y convertir ese ARN en ADNc. Hoy les mostraremos el procedimiento para marcar e hibridar ese ADNc en una plataforma de microarreglos de oligonucleótidos de pez cebra, con el fin de estudiar los perfiles globales de expresión génica. Típicamente, utilizamos este procedimiento para estudiar la expresión diferencial de genes en respuesta a la exposición a una toxina.

Así que comencemos. El experimento de microarreglo requiere un entorno con luz mínima para prevenir la degradación fotográfica del colorante fluorescente SI tres utilizado en la etiquetación. Para comenzar a etiquetar el ADNc con sci tres haw, los siguientes componentes del sistema de etiquetado genómico bio prime array CGH: tampón de cebador aleatorio 2,5 x, mezcla 10 X-D-C-T-P y agua libre de nucleasas. Además, descongele el stock de 1 milimolar del DCTP marcado con SI tres. Después de descongelar, centrifugue brevemente los reactivos en un tubo de pared gruesa de 0,6 mililitros y combínelos.

500 nanogramos de ADNc, 40 microlitros, 2,5 x tampón de cebadores aleatorios y agua libre de nucleasas para alcanzar un volumen total de 86 microlitros. Mezclar bien y centrifugar brevemente, luego incubar la reacción a cien grados Celsius en un termociclador durante cinco minutos. Al final de la incubación, transferir inmediatamente la reacción a una mezcla de hielo durante 10 minutos.

A continuación, retire la exo DNA polimerasa del congelador y colóquela en hielo. Luego añada al tubo de reacción 10 microlitros de la mezcla 10 X-D-C-T-P, dos microlitros de la SI 3D CTP 1 milimolar y dos microlitros de la exo DNA polimerasa XO, mezcle bien y centrifugue brevemente. Finalmente, incube la reacción a 37 grados Celsius durante 16 horas en un termociclador cuando finalice la etiquetación.

Proceda a limpiar y precipitar el ADNc marcado. Para comenzar la limpieza del ADNc marcado, coloque una columna MicroCon en un tubo de 1,5 mililitros.

Añada 300 microlitros de SSC 0,1X a la columna y luego agregue la reacción de marcado. Centrifugue la columna a 16 100 ×g durante 10 minutos a cuatro grados SIU. Observe que el flujo residual puede ser ligeramente rosado.

Deseche el flujo y agregue otros 300 microlitros de XSSE 0,1 nulo a la columna. Luego, repita la centrifugación a 16.100 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Nuevamente, deseche el flujo y agregue ahora 300 microlitros adicionales de T 0,1 XSSC a la columna; centrifugue a 16.100 ×g durante 12 minutos a cuatro grados Celsius tras este último lavado.

El flujo de salida debe estar claro y el ADNc marcado en rosa debe ser visible en la columna. Nuevamente, deseche el flujo de salida de este lavado final para evitar el ADNc marcado. Añada 100 microlitros de agua libre de nucleasas a la columna. Saque la columna del tubo de microcentrífuga e inviértala hacia un tubo nuevo.

Luego, centrifugue la columna invertida a 2 300 G durante dos minutos a cuatro grados Celsius. El ADNc marcado se disuelve en el agua en la parte inferior del tubo. Verifique el ADNc mencionado utilizando un espectrofotómetro NanoDrop ND 1000 según las instrucciones del fabricante.

Calcule la concentración de ADN y evalúe la incorporación del colorante según se describe en el protocolo escrito adjunto. Si el ADNc está suficientemente marcado, coloque seis microgramos en un nuevo tubo para precipitar la mezcla de ADNc marcado con 0,1 volúmenes de acetato de sodio tres molar a pH 5,2 y un volumen de isopropanol, incubando a oscuras durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Teniendo en cuenta que todos los pasos hasta este momento se han llevado a cabo en un entorno con luz mínima. Luego, centrifugue la muestra a 16.100 G durante 20 minutos a temperatura ambiente. Tras la centrifugación, deseche cuidadosamente el sobrenadante SIN perturbar el botón de ADN, que es de color rosa.

Finalmente, se lavó agregando 500 microlitros de etanol al 70 % y mezclando mediante inversión suave en una centrífuga a 16 100 ×g durante cinco minutos. A temperatura ambiente, retire el sobrenadante, invierta el tubo y deje secar el precipitado durante cinco minutos. El ADNc marcado está listo para la hibridación.

Antes de comenzar la hibridación, encienda el sistema de hibridación NimbleGen y déjelo equilibrar a 42 grados Celsius. Comience disolviendo el pellet de ADN marcado en cinco microlitros de agua libre de nucleasas. Añada los componentes de hibridación del kit de hibridación Roche NimbleGen: tampón de hibridación, hibridación A y oligo de alineación, hasta un volumen total de 18 microlitros, según se indica en el protocolo escrito adjunto.

Mezcle bien y centrifugue brevemente el tubo para recoger el contenido en el fondo. A continuación, desnature el ADNc marcado colocando el tubo a 95 grados Celsius durante cinco minutos. Transfiera inmediatamente el tubo al sistema de hibridación nimble gen hasta que los microarreglos estén listos.

Tenga en cuenta que los microarreglos requieren manipulación y almacenamiento cuidadosos. Los arreglos Roche NimbleGen se almacenan en la oscuridad con desecante a temperatura ambiente. Coloque el arregle en la herramienta de alineación del mezclador de precisión.

Cargue la mezcla de PMA T en el mezclador X sobre el PMA T y retire la tira adhesiva con pinzas. Con el conjunto y el mezclador colocados, cierre el PMA T firmemente. A continuación, separe el conjunto y el mezclador del PMA T aplicando presión sobre el mezclador a través del orificio en el PMA t.

Finalmente, utilice un rodillo para aplicar presión alrededor del exterior del mezclador con el fin de asegurar que la matriz esté sellada y eliminar cualquier burbuja. A continuación, coloque el complejo de mezclador y matriz en el sistema de hibridación para calentar y cargar la muestra de ADNc en la matriz. Use el desplazamiento progresivo lentamente y con presión constante.

Agregue 15 microlitros de la muestra marcada en el orificio de llenado en el centro del mezclador. Retire cualquier exceso de muestra de los orificios y séllelos con tiras adhesivas. Luego cierre la palanca.

Ahora comience a mezclar la solución de hibridación utilizando el programa B en el sistema de hibridación nimble gen. Permita que la micromatriz se hibride durante 16 a 20 horas. Después de la hibridación, la micromatriz será lavada y escaneada cuando la hibridación esté casi finalizada. Prepárese para el escaneo encendiendo el escáner de matrices gene picks 4,000 B y déjelo calentar durante aproximadamente 15 minutos.

A continuación, prepare los tampones de lavado uno A, uno B dos y tres según se describe en el protocolo escrito adjunto. Precaliente el tampón de lavado uno A a 42 grados Celsius, pero mantenga los otros tampones a temperatura ambiente. Cuando el tampón de lavado uno A se haya calentado, viértalo en un recipiente.

Sumerja un portaobjetos con porta en el tampón de lavado uno B. Ahora retire el complejo del mezclador de matriz del sistema de hibridación nimble gen e introdúzcalo en el soporte. Comience el lavado sumergiendo el conjunto en el tampón de lavado uno A previamente calentado y retire cuidadosamente el mezclador separándolo del portaobjetos. Luego, retire la matriz del soporte y agite durante 15 segundos en el tampón de lavado uno A. Transfiera rápidamente la matriz a un portaobjetos sumergido en el tampón de lavado uno B y agite vigorosamente el portaobjetos durante dos minutos.

Luego, transfiera el portaobjetos al tampón de lavado dos y agite durante un minuto. Por último, transfiera el portaobjetos al tampón de lavado tres y agite durante 15 segundos. Finalice los lavados transfiriendo el portaobjetos al centrífugo de secado y gire durante dos minutos tras la centrifugación.

Escaneé inmediatamente la matriz, ya que el D es sensible a la luz y al ozono; inicie el escaneo cargando el código de barras de la matriz hacia abajo en el escáner de matriz gene picks 4,000 B. En el cuadro de diálogo de configuración de hardware, establezca el láser de 532 nanómetros con un valor de PMT de 500, la potencia al 100 %, el tamaño de píxel en cinco micrones, el número de líneas a promediar en uno y la posición de enfoque en cero micrones. Cuando la configuración esté completa, visualice una vista previa de la matriz.

Seleccione un área para escanear y luego escanéela. Una vez completado el escaneo, revise el histograma de la imagen. Idealmente, una cuenta normalizada de E menos cinco debe estar en el límite de saturación de 65.000, lo que significa que aproximadamente del 1 al 2% de las características están saturadas.

Si las cuentas normalizadas son menores a uno E menos cinco, aumente la ganancia del PMT y vuelva a escanear la lámina. Si las cuentas normalizadas son mayores a uno E menos cinco, disminuya la ganancia del PMT, vuelva a escanear la lámina, guarde la imagen y utilice un programa de análisis de datos para la normalización de los datos y el cálculo de los valores de intensidad. La reacción de marcado habitualmente produce al menos 10 microgramos de ADNc marcado.

La incorporación del colorante se puede calcular utilizando una simple relación básica del colorante, donde la relación de nucleótido a SI tres equivale a la relación de A dos 60 a A cinco 50 multiplicada por 23,15. Una reacción adecuada dará como resultado un valor entre 50 y 80. Una hibridación aceptable presentará del 1 al 2 % de las características saturadas.

Un E menos cinco de recuentos normalizados en el límite de saturación de 65.000. Con el valor del PMT ajustado, la calidad de hibridación también se puede evaluar cualitativamente mediante la visualización de la imagen escaneada del microarreglo y la evaluación de la intensidad de los oligonucleótidos alineados respecto a otras características en el arreglo. La imagen escaneada también debe evaluarse para detectar manchas particulares o de polvo dentro del área del arreglo.

En análisis posteriores, un diagrama de dispersión puede utilizarse para representar visualmente sus datos analizados y determinar los niveles relativos de expresión génica en las muestras, así como para identificar genes que se expresan de manera diferencial. Los genes que se expresan de manera diferencial se desviarán significativamente de la línea de mejor ajuste en un procedimiento complementario. Hemos mostrado cómo extraer ARN de embriones de pez cebra para sintetizar ADNc. Aquí simplemente le hemos mostrado cómo marcar e hibridar ADNc en una plataforma de micromatriz de oligonucleótidos para estudiar perfiles globales de expresión génica.

Al realizar este procedimiento, recuerde siempre utilizar ADN de alta calidad y evitar exponer el colorante SYBR Green III a la luz directa. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.