Gene mundial y Análisis de Expresión utilizando una plataforma de microarrays de oligonucleótidos de pez cebra

Este procedimiento comienza con CDNA que se ha sintetizado a partir de un molde de ARN de alta calidad. El CDNA se marca primero con el colorante fluorescente SI tres. Una vez finalizada la reacción de etiquetado, el CDNA marcado se purifica, se aísla y se evalúa la calidad de la reacción de etiquetado.

A continuación, el CDNA marcado se hibrida en un microarray. Después de la hibridación, las matrices se analizan para determinar los niveles relativos de expresión génica en las muestras. Hola, mi nombre es Sam Peterson y trabajo en el laboratorio de la Dra. Jennifer Freeman en la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad de Purdue.

Anteriormente, te hemos mostrado cómo extraer ARN de embriones de pez cebra y convertir ese ARN en CDNA. Hoy le mostraremos el procedimiento para etiquetar e hibridar ese CDNA en una plataforma de microarrays de oligonucleótidos de pez cebra para estudiar los perfiles globales de expresión génica. Normalmente, utilizamos este procedimiento para estudiar la expresión génica diferencial en respuesta a una exposición a una toxina.

Así que comencemos. El experimento de microarrays requiere un entorno de luz mínimo para evitar la fotodegradación del colorante fluorescente SI tres utilizado en el etiquetado para comenzar a etiquetar el CD NA con sci tres haw los siguientes componentes del sistema de etiquetado genómico CGH de bio prime array: 2,5 x tampón de cebador aleatorio, mezcla 10 X-D-C-T-P y agua libre de nucleasas. Además, descongele el stock de un milimolar de la DCTP marcada con tres SI después de descongelar, centrifugar brevemente o reactivos en un tubo de pared de 0,6 mililitros de espesor combinado.

500 nanogramos de CDNA 40 microlitros, 2,5 x tampón de cebador aleatorio y agua libre de nucleasas para lograr un volumen total de 86 microlitros. Mezclar bien y centrifugar brevemente, luego incubar la reacción a cien grados centígrados en un termociclador durante cinco minutos. Al final de la incubación, transfiera inmediatamente la reacción a una suspensión en baño de hielo durante 10 minutos.

A continuación, saque la exo ADN polimerasa del congelador y colóquela en hielo. A continuación, añada al tubo de reacción, 10 microlitros de la mezcla 10 X-D-C-T-P, dos microlitros de la SI 3D CTP de un milimolar y dos microlitros de la ADN polimerasa de limpieza XO bien mezclada y centrifugar brevemente. Finalmente incubar la reacción a 37 grados centígrados durante 16 horas y un termociclador cuando se termine el etiquetado.

Proceda a limpiar y precipitar el CDNA etiquetado. Para comenzar a limpiar el CDNA etiquetado. Coloque una columna MicroCon en un tubo de 1,5 mililitros.

Agregue 300 microlitros cero 0.1 XSSC a la columna y luego agregue la reacción de etiquetado. Centrifugar la columna a 16, 100 G durante 10 minutos a cuatro grados SIUs. Observe que el flujo puede ser de color rosa claro.

Deseche el flujo y agregue otros 300 microlitros de cero 0.1 XSSE a la columna. A continuación, repita la centrifugación a 16, 100 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Nuevamente, deseche el flujo y agregue 300 microlitros adicionales T 0.1 XSSC a la columna que ahora centrifuga a 16, 100 G durante 12 minutos a cuatro grados centígrados después de este último lavado.

El flujo debe ser claro y el CDNA etiquetado en rosa es visible en la columna. Nuevamente, deseche el flujo a través de este lavado final para eludir el CD NA etiquetado. Agregue 100 microlitros de agua libre de nucleasa a la columna. Saque la columna del tubo de microcentrífuga e inviértala en un nuevo tubo.

A continuación, centrifugar la columna invertida a 2.300 g durante dos minutos a cuatro grados centígrados. El CDNA marcado se disuelve en el agua en el fondo del tubo. Compruebe el CDNA aludido utilizando un espectrofotómetro NanoDrop ND 1000 según las instrucciones del fabricante.

Calcule la concentración de ADN y evalúe la incorporación de colorante como se describe en el protocolo escrito adjunto. Si el CDNA está suficientemente marcado, coloque seis microgramos en un tubo nuevo para precipitar la mezcla de CD NA marcada en un volumen de 0,1 x de acetato de sodio de tres molares a pH 5,2 y un volumen x. Isopropanol incubando la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Teniendo en cuenta que todos los pasos hasta este punto se han llevado a cabo en un entorno de luz mínima. A continuación, centrifugar la muestra a 16,100 G durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, deseche con cuidado el nadante de SUP sin alterar la bolita de ADN, que es de color rosa.

Finalmente se lava añadiendo 500 microlitros, 70%etanol y se mezcla por centrifugación de inversión suave a 16,100 G durante cinco minutos. A temperatura ambiente, retire el supinado, invierta el tubo y deje que el pellet se seque durante cinco minutos. El CDNA etiquetado está listo para la hibridación.

Antes de comenzar la hibridación, encienda el ágil sistema de hibridación de genes y deje que se equilibre a 42 grados centígrados. Comience disolviendo el pellet de CD NA marcado en cinco microlitros de agua libre de nucleasa en el pellet disuelto. Agregue componentes de hibridación del kit de hibridación Roche Nimble Gen, tampón de hibridación, híbrido A y oligo de alineación, hasta un volumen total de 18 microlitros, como se describe en el protocolo escrito adjunto.

Mezcle bien y gire brevemente el tubo para recoger el contenido en la parte inferior. A continuación, se desnaturaliza el CDNA marcado colocando el tubo a 95 grados centígrados durante cinco minutos. Transfiera inmediatamente el tubo al ágil sistema de hibridación de generación hasta que las matrices estén listas.

Tenga en cuenta que los microarrays requieren un manejo y almacenamiento cuidadosos. Los matrices de generación ágil de Roche se almacenan en la oscuridad con desecante a temperatura ambiente. Cargue la matriz en la herramienta de alineación del mezclador de precisión.

El PMA T carga en X un mezclador sobre el PMA T y retira la tira adhesiva con pinzas. Con la matriz y el mezclador cargados, cierre el PMA T de forma segura. A continuación, desconecte la matriz y el mezclador del PMA T aplicando presión al mezclador a través del orificio del PMA t.

Finalmente, use un brayer para aplicar presión alrededor del exterior de la batidora para asegurarse de que la matriz esté sellada y eliminar las burbujas. A continuación, coloque el complejo mezclador de matriz en el sistema de hibridación para calentarlo, para cargar la muestra de CDNA en la matriz. Utilice el perpete de desplazamiento lentamente y con una presión constante.

Agregue 15 microlitros de la muestra etiquetada en el puerto de llenado en el centro de la batidora. Limpie el exceso de muestra de los orificios de los puertos y séllelos con tiras adhesivas. A continuación, cierre el pestillo.

Ahora comience a mezclar la solución de hibridación utilizando el programa B en el ágil sistema de hibridación gen. Deje que el microarray se hibride durante 16 a 20 horas Después de la hibridación, el microarray se lavará y escaneará cuando la hibridación esté a punto de completarse. Prepárese para la exploración encendiendo el escáner de matriz Gene picks 4, 000 B y deje que se caliente durante unos 15 minutos.

A continuación, prepare los tampones de lavado uno A, uno B, dos y tres como se describe en el protocolo escrito adjunto. Antes de la guerra, tampón de lavado de una A a 42 grados centígrados, pero deje los otros tampones a temperatura ambiente. Cuando el tampón de lavado uno A se haya calentado, viértalo en un plato.

Sumerja una rejilla deslizante en el tampón de lavado uno B.Ahora retire el complejo mezclador de matriz del ágil sistema de hibridación de generación y deslícelo en la plantilla. Comience el lavado sumergiendo el conjunto en el tampón de lavado precalentado uno A y retire con cuidado la batidora despegándola de la corredera. A continuación, retire la matriz de la plantilla y agite durante 15 segundos en el tampón de lavado uno A. Transfiera rápidamente la matriz a una rejilla de deslizamiento sumergida en el tampón de lavado uno B y agite la rejilla de portaobjetos vigorosamente durante dos minutos.

A continuación, transfiera la rejilla deslizante al tampón de lavado dos y agite durante un minuto. Por último, transfiera la rejilla deslizante al tampón de lavado tres y agite durante 15 segundos. Termine las arandelas transfiriendo la matriz a la centrífuga de secado por deslizamiento y centrifuga durante dos minutos después de la centrifugación.

Escanee la matriz inmediatamente, ya que la D es sensible a la luz y al ozono, inicie el escaneo cargando el código de barras de la matriz en el escáner de matriz Gene picks 4, 000 B. En el conjunto de cuadros de diálogo de configuración de hardware, el láser de 532 nanómetros tiene un valor PMT establecido en 500, establezca la potencia en 100%, el tamaño de píxel en cinco micras, las líneas en promedio en uno y la posición de enfoque en cero micras. Una vez completada la configuración, obtenga una vista previa de la matriz.

Elija un área para escanear y luego analícela. Una vez finalizado el escaneo, compruebe el histograma de la imagen. Idealmente, un E menos cinco recuentos normalizados debe estar en el límite de saturación de 65.000, lo que significa que aproximadamente del uno al 2% de las características están saturadas.

Si los recuentos normalizados son inferiores a un E menos cinco, aumente la ganancia de PMT y vuelva a escanear la diapositiva. Si los recuentos normalizados son mayores que un E menos cinco, disminuya la ganancia de PMT y vuelva a escanear la diapositiva, guarde la imagen y utilice un programa de análisis de datos para la normalización de datos y el cálculo de los valores de intensidad. La reacción de marcaje produce rutinariamente al menos 10 microgramos de CDNA marcado.

La incorporación de colorante se puede calcular utilizando una relación de colorante base simple donde la relación de nucleótidos a SI tres es igual a la relación A dos 60 a cinco 50 multiplicada por 23 punto 15. Una buena reacción dará como resultado un valor entre 50 y 80. Una hibridación aceptable tendrá un rendimiento de uno a 2% de las características saturadas.

Un E menos cinco recuentos normalizados en el límite de saturación de 65.000. Con el valor PMT establecido, la calidad de hibridación cercana a 500 también se puede evaluar cualitativamente mediante la visualización de la imagen escaneada del microarray y la evaluación de la intensidad de los oligonucleótidos alineados con otras características del array. La imagen escaneada también debe evaluarse en busca de manchas particulares o de polvo dentro del área de la matriz.

En análisis posteriores, se puede utilizar un diagrama de dispersión para obtener imágenes de los datos de análisis para determinar los niveles relativos de expresión génica en las muestras e identificar los genes que se expresan diferencialmente. Los genes que se expresan diferencialmente se desviarán significativamente de la línea de mejor ajuste en un procedimiento complementario. Te hemos mostrado cómo extraer ARN de embriones de pez cebra para sintetizar c CD NA. Aquí le mostramos cómo etiquetar e hibridar CD NA en una plataforma de microrayos de oligonucleótidos para estudiar los perfiles globales de expresión génica.

Al realizar este procedimiento, recuerde siempre utilizar CD NA de alta calidad y evite exponer el tinte del sitio a la iluminación directa. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.