Name: Poliacrilamida electroforesis en gel de urea (urea PÁGINA) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-29T07:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Aprende electroforesis en gel de poliacrilamida con urea para separar ADN o ARN monocatenario según su peso molecular. Este método esencial en biología molecular permite analizar oligonucleótidos sintetizados y productos de reacciones de escisión enzimática con alta resolución.

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Este trabajo fue apoyado por el consejo de investigación académica de Singapur (ARC) [número de concesión 90/07]. Damos las gracias por el apoyo radiodurans.

El protocolo de texto completo y detallado de este procedimiento experimental está disponible en los protocolos actuales en biología molecular. Detalladas paso a paso las instrucciones para el montaje del bocadillo de gel y gel para los aparatos se pueden encontrar en el sitio web BioRad 3. Equipo necesario: Placas de vidrio (interior y exterior) 10 cm de células: 10,1 x 7,3 cm (placa interior), 10,1 x 8,2 cm (la placa exterior), BioRad 20 cm de células: 20 x 20 cm (placa interior), 20 x 22,3 cm (placa exterior), BioRad 0.5-1.5 mm peine de gel y espaciadores Gel de pie de fundición Gel aparato con tapa y cables Suministro de alta tensión El bloque de calentamiento o baño de agua Pipetas serológicas y la ayuda de pipetas Pipeta y puntas de pipeta Gel secador o un escáner Reactivos y soluciones: Urea (ultrapura) 40% de poliacrilamida solución (29:1) 10 x TBE solución (Tris-Borato, EDTA) Agua desionizada, destilada TEMED 30% (w / v) de persulfato de amonio 0,5 x TBE solución Formamida EDTA Cyanol xileno Azul de bromofenol Metanol Etanol <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Volumen </td><td colspan="3" style="text-align:center;"> 50 ml </td><td colspan="3" style="text-align:center;"> 60 ml </td><td colspan="3" style="text-align:center;"> 10 ml </td></tr><tr><td> Acrilamida concentración </td><td> 10% </td><td> 12,5% </td><td> 15% </td><td> 10% </td><td> 12,5% </td><td> 15% </td><td> 10% </td><td> 12,5% </td><td> 15% </td></tr><tr><td> g de urea </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 28.8 </td><td> 28.8 </td><td> 28.8 </td><td> 4.8 </td><td> 4.8 </td><td> 4.8 </td></tr><tr><td> ml 40% acrílico (29:1) </td><td> 12.5 </td><td> 15.625 </td><td> 18.75 </td><td> 15 </td><td> 18.75 </td><td> 22.5 </td><td> 2.5 </td><td> 3.125 </td><td> 3.75 </td></tr><tr><td> UL 30% de APS </td><td> 166 </td><td> 166 </td><td> 166 </td><td> 199.2 </td><td> 199.2 </td><td> 199.2 </td><td> 33 </td><td> 33 </td><td> 33 </td></tr><tr><td> ul TEMED </td><td> 20 </td><td> 20 </td><td> 20 </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 24 </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> 10 x TBE </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 6 </td><td> 6 </td><td> 1 </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td colspan="10"> Llenar el volumen con agua desionizada, destilada </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Reactivos y soluciones necesarias para los diferentes concentraciones de acrilamida y los volúmenes para la resolución de un solo varados oligonucleótidos Gel de montaje sandwich y gel de preparación <ol><li> Montar el gel de acuerdo a la descripción de los fabricantes y fijar el gel en la cámara de gel-casting 3. Utilice separadores de 0.5-1.5 mm de espesor. </li><li> Prepare la solución de poliacrilamida apropiada de acuerdo con los protocolos actuales en biología molecular o como se indica en la Tabla 1. Para un gel de acrilamida desnaturalizante de 20 cm x 22 cm x 1,5 mm, 60 ml de solución de gel y un 10,1 x 8,2 cm x 1 mm de gel de solución al 5 ml de gel es suficiente. Mayor geles se utilizan cuando los productos esperados / las bandas están dentro del rango de unas pocas bases, a continuación, un gel ya se resolverán las bandas con una diferencia de un solo nucleótido. Si las bandas se espera difieren en más de 10 nucleótidos, más pequeños geles se permite la resolución de los fragmentos. Elegir el porcentaje de poliacrilamida que se adapte a sus necesidades de separación, una mayor concentración de poliacrilamida resolverá menor fragmentos de peso molecular. El uso de urea ultrapura y se mezclan con la cantidad deseada de la acrilamida. Añadir tampón TBE a la mezcla de gel para conseguir una concentración final de 0,5 a 1 x TBE y llenar el volumen con agua desionizada, destilada. Se calienta la solución durante 20 segundos en el microondas y mezclar suavemente. Para grandes volúmenes de gel repetir este paso hasta que la solución es la mano caliente. </li><li> Verter el gel inmediatamente con una pipeta serológica y una pipeta automática de la ayuda entre las dos placas de vidrio. Evitar la introducción de burbujas de aire. Inserte el peine y dejar polimerizar el gel durante 30-60 minutos. </li></ol> La instalación del equipo de electroforesis y el gel prerun <ol><li> Desmontar el gel de la cámara de fundición y montaje para el aparato de gel de acuerdo con las instrucciones del fabricante 3. </li><li> Llenar la cámara baja del buffer ingenio en funcionamiento (0,5-1 x TBE) que las placas de vidrio se subse fusionó con 2-3 cm de amortiguamiento. Llenar la cámara de amortiguación superior hasta la parte superior del gel con el funcionamiento de amortiguación. </li><li> Retire con cuidado el peine y lave los pocillos con tampón en ejecución mediante una pipeta y puntas de carga de gel. </li><li> Fijar la tapa del sistema de gel y conectar los cables a una fuente de alimentación de alta tensión. Antes de poder cargar las muestras que tiene que prerun el gel por lo menos 30 minutos para calentar el gel y para eliminar la urea restante del gel. La temperatura óptima debe estar entre 45-55 ° C. Evite las temperaturas superiores a 60 ° C en forma de bandas podría manchar o las placas de vidrio se puede romper. Elija vatios constante para el prerun (15-25 W por gel). </li></ol> Preparación de la muestra <ol><li> Mientras tanto preparar las muestras. Por lo tanto, añadir la cantidad apropiada de la mezcla de carga 2 x gel de la muestra. La mezcla de carga por lo general contiene 90% formamida, EDTA 0,5%, 0,1% cyanol xileno y 0,1% azul de bromofenol. </li><li> Antes de que las muestras pueden ser cargados en el gel, las muestras deben ser el calor desnaturalizado por calentamiento de las muestras entre los 70-90 º C durante unos minutos. </li></ol> Cargar y ejecutar el gel <ol><li> Cuando el prerun haya terminado, retire la tapa y enjuagar los bolsillos bien como se describió anteriormente como la urea ha infiltrado en los pozos. </li><li> Aplicar las muestras cuidadosamente desde el fondo de la bolsa. Evitar la introducción de burbujas de aire. Tampón de carga se debe aplicar a los bolsillos vacíos para mantener la igualdad de condiciones durante la carrera. </li><li> Montar la tapa y ejecutar el gel en vatios constante para mantener una temperatura de gelificación de 55 ° C similar a la prerun. Observar la migración de los colorantes marcador hasta que el frente tinte alcanzado el extremo inferior del gel. La duración de ejecución depende del porcentaje de acrilamida usada, la fuerza iónica del buffer y grosor del gel. Una carrera puede durar entre 2-4 horas. Comprobar la temperatura del gel. Un termómetro de gel pueden ayudar a controlar la temperatura adecuada durante la carrera. </li></ol> Proceso del gel <ol><li> Cuando el frente de tinte ha llegado al final del gel se pone el gel de la cámara de amortiguación inferior. Quitar el gel de la cámara y aflojar las abrazaderas. Extraiga los separadores y cuidadosamente disimular las placas de vidrio. Si es necesario cortar la parte superior y que contiene parte del gel. </li><li> Transferir cuidadosamente el gel en un plato con una solución de gel de fijación (la misma concentración de TBE más metanol y el etanol 10.5%). Deje que el gel en la solución durante 5-10 minutos y cambiar el búfer dos veces. </li><li> El gel está listo para su posterior procesamiento con un secador de gel de vacío o de exploración directa del gel. </li></ol>

<ol><li>Maniatis, T., Jeffrey, A., van deSande, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chain+length+determination+of+small+double-+and+single-stranded+DNA+molecules+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Chain length determination of small double- and single-stranded DNA molecules by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Biochemistry. 14, 3787-3794 (1975).</li>
<li>Albright, L. M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAlbright%2C+LM+%22Curr+Protoc+Nucleic+Acid+Chem%22">Curr Protoc Nucleic Acid Chem</a>. , (2001).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22PROTEAN+II+xi+Cell+and+PROTEAN+II+xi+2-D+Cell+Instruction+Manual%22">PROTEAN II xi Cell and PROTEAN II xi 2-D Cell Instruction Manual</a>. , Biorad. (2001).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

<ol><li> La nitidez de la banda depende de varios factores. El volumen de muestra cargada de bandas de fuerte debe ser lo más pequeña posible, es decir, lo ideal es entre 1.5 l. Sin embargo, hasta 15 l puede ser cargado que todavía asegura una resolución aceptable. Menos de resultados de la muestra de volumen en las bandas más nítida. </li><li> La calidad de la banda también depende del grosor del gel. Diluyente geles, como por ejemplo 0,75 mm muestran mejores resultados que los geles 1,5 mm de espesor. </li><li> La forma de las bandas también ...

poliacrilamida electroforesis en gel de urea (urea pÁgina)

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

PÁGINA urea o desnaturalización de poliacrilamida electroforesis en gel de urea cuenta con 8.6 M de urea, lo que desnaturaliza el ADN o ARN estructuras secundarias y se utiliza para su separación en una matriz de gel de poliacrilamida en base al peso molecular. Fragmentos de entre 2 y 500 bases, con las diferencias de longitud tan pequeño como un solo nucleótido, pueden ser separados utilizando este método 1. La migración de la muestra depende de la concentración de acrilamida elegido. Un mayor porcentaje de poliacrilamida se resuelve fragmentos de menor peso molecular. La combinación de urea y temperaturas de 45-55 ° C durante la ejecución del gel permite la separación de ADN no estructurados o moléculas de ARN. En general, este método es necesario para analizar o purificar el ADN de cadena sencilla o fragmentos de ARN, tales como los oligonucleótidos sintetizados o etiqueta o de los productos de las reacciones de escisión enzimática. En este artículo de vídeo que muestran cómo preparar y ejecutar los geles de poliacrilamida desnaturalizantes urea. Consejos técnicos se incluyen, además de los 1,2 del protocolo original.

Poliacrilamida electroforesis en gel de urea se utiliza para separar una sola cadena de ADN o ARN, hasta un límite de 500 nucleótidos. Urea en combinación con el calor desnaturaliza las muestras y no estructurados cadenas simples migrar dentro de la matriz de gel de acuerdo a su peso molecular.

Poliacrilamida electroforesis en gel de urea (urea PÁGINA)

La electroforesis en gel de poliacrilamida con urea o electroforesis de poliacrilamida desnaturalizante con urea emplea urea 6-8 M, la cual desnaturaliza las estructuras secundarias de ADN o ARN y se utiliza para su...

En general, este tipo de gel se requiere para separar fragmentos de ADN o ARN de cadena sencilla, como oligonucleótidos sintetizados o marcados, o productos de reacciones de escisión enzimática. El rango de separación depende de la concentración de poliamida, la urea en combinación con calor desnaturaliza la muestra y las moléculas de cadena sencilla migran dentro de la matriz del gel según su peso molecular. Este video presenta la preparación, corrida y procesamiento de un gel típico.Hola, me llamo Haki. Estoy en la Universidad Tecnológica Nang. En esta demostración, voy a mostrarles cómo realizar una electroforesis en gel desnaturalizante.Utilice placas de vidrio limpias y ensamble el sándwich de gel según la descripción del fabricante. Fije el gel en la cámara estándar para moldeado de geles. Desmoldee las placas de vidrio de geles grandes si el gel tiende a adherirse a las placas de vidrio.Seleccione un tamaño y grosor de gel según sus requisitos de separación. Prepare la solución de gel. De acuerdo con los protocolos actuales en biología molecular.Elige una concentración de poliamida que se adapte a tus requisitos de separación. Un porcentaje más alto de acrilamida permitirá resolver fragmentos de menor peso molecular. Usa Alta pure UIA y mézclalo con la cantidad deseada de poliacrilamida en un vaso de precipitados o botella.Añada 10 de tampón XTBE a la solución y complete hasta el volumen requerido con agua. Caliente la solución durante 20 segundos en el microondas y mézclela suavemente hasta que todo el UIA se disuelva. Puede almacenar la solución si es necesario para volúmenes mayores de gel.Repita el paso de microondas hasta que la solución esté tibia al tacto. Evite calentar demasiado la solución. No sobrecaliente porque la urea comenzará a degradarse después de los 60 grados.El centígrado se puede detectar por el olor a amoníaco. Cuando la solución esté clara y se haya enfriado hasta aproximadamente la temperatura ambiente, agregue PS y tamid a la solución de gel y mézclela suavemente. Si la solución de gel está demasiado caliente, el gel se polimerizará dentro de la pipeta.Vierta el gel utilizando una pipeta serológica y luego una ayuda para pipeteo entre las dos placas de vidrio. Evite introducir burbujas de aire. Inserte el peine con cuidado.Intente no atrapar burbujas de aire y deje que el gel se polimerice durante 30 a 60 minutos. Desmonte el gel del soporte de moldeo y ensámblelo en la cámara superior de tampón. Según el protocolo del fabricante, coloque el gel en la cámara inferior de tampón y llene el depósito inferior con tampón de electroforesis, que normalmente es TBE 0,5 a 1X.Con la misma concentración que para el gel, llene la cámara superior de tampón con tampón de electroforesis hasta el borde de la placa de vidrio. Antes de cargar sus muestras, debe precorrer el gel durante al menos 30 minutos para calentar el gel y eliminar la urea residual del gel. La temperatura óptima debe estar entre 45 y 55 grados centígrados, como en la electroforesis real del gel.Evite temperaturas superiores a 60 grados, ya que las bandas podrían difuminarse o las placas de vidrio podrían agrietarse cuidadosamente. Retire el tampón sin perturbar los bordes y enjuague los pocillos a través de él para eliminar la urea que haya filtrado hacia ellos. Utilice puntas para carga de geles y pipetee arriba y abajo varias veces.Para cada uno, coloque la tapa del sistema de gel y conecte los cables a una fuente de alimentación de alto voltaje. Seleccione vatios constantes para la precorrer, aproximadamente de 15 a 20 vatios por gel. Cuando se enciende la fuente de alimentación, la formación de burbujas de aire indica una buena conductividad.Mientras tanto, prepare sus muestras, agregando por lo tanto la cantidad adecuada de dos veces el tampón de carga para geles a su muestra. Cuando finalice la precorrída, retire la tapa y lave minuciosamente el pocillo como se describió anteriormente; es muy importante enjuagar cuidadosamente los pocillos del gel para eliminar residuos de urea, ya que la urea formará una capa densa que impedirá que la muestra entre en el gel.Justo delante de usted. Aplique el calentamiento de la muestra, incubando su muestra a al menos 70 grados centígrados durante varios minutos. Aplique las muestras cuidadosamente desde la parte inferior del bolsillo.Para algunas aplicaciones, el colorante interfiere con su muestra y puede causar bandas difusas, o el colorante muestra la señal fluorescente. Entonces, es útil eliminar un colorante o todos los colorantes y cargar el tampón que contiene el colorante estándar. En un pocillo vacío, un patrón de tamaños, la cantidad de muestra que debe cargarse para obtener bandas nítidas está idealmente entre uno y cinco microlitros, aunque también se pueden cargar volúmenes más altos hasta 15 microlitros.Un menor volumen de muestra da como resultado bandas más nítidas. Evite introducir burbujas de aire y deje que la muestra se asiente lentamente en el pocillo para que se forme una capa uniforme. Si utiliza una etiqueta fluorescente, envuelva el sistema de electroforesis en papel de aluminio para evitar la exposición a la luz, ya que esto podría causar fotoblanqueo de su muestra.Monte la tapa y encienda la fuente de alimentación. Corra el gel hasta que el frente de DIA alcance el extremo inferior del gel. La duración de la corrida depende del porcentaje de acrilamida.Usted elige la fuerza iónica de su tampón, el grosor y la longitud del gel. Una corrida puede durar entre una y varias horas. Observe la migración del marcador para determinar la duración de la electroforesis.Utilice vatios constantes y verifique la temperatura del gel. Un termómetro para geles puede ayudar a monitorear la temperatura adecuada durante la corrida, o consulte el manual del equipo de electroforesis para saber cuándo el dron ha llegado al final. Apague la fuente de alimentación y retire la tapa del equipo de gel.A continuación, retire el sándwich del gel de la cámara de tampón inferior. Deseche el tampón de la cámara de tampón superior. Llene un recipiente con solución fijadora para geles.Esta solución debe tener la misma concentración de TB y entre un 5% y un 10% de metanol y ácido acético. Retire el sándwich de gel del aparato y afloje las abrazaderas. Retire los espaciadores y desarme cuidadosamente las placas de vidrio utilizando una espátula. Si es necesario, corte el gel en un pocillo que contenga parte de gel o en la parte inferior vacía del gel, y deseche los trozos innecesarios de gel, como las bandas que contienen colorante.Para muestras fluorescentes, retire cuidadosamente el gel de la placa de vidrio y transfiéralo a un recipiente lleno de solución fijadora para geles. Deje el gel en la solución durante cinco a diez minutos y cambie el tampón dos veces. Agite suavemente el recipiente para lavar la urea del gel o coloque el gel en la solución de tinción según su aplicación.La calidad del gel también depende del grosor del gel. Los geles más delgados, como los de 0,75 milímetros, muestran mejores resultados que los geles de 1,5 milímetros de grosor, pero son más difíciles de manipular. La nitidez de las bandas depende de varios factores.Un voltaje bajo al comienzo de la corrida puede ayudar a obtener bandas más definidas, ya que la muestra ingresa suavemente al frente del gel, evitando así que los pocillos del gel colapsen debido a un voltaje elevado. Un gel de concentración (stacking gel) breve con un porcentaje bajo de acrilamida puede tener el mismo efecto de afilado de bandas; además, incluir glicerol al 10 % también facilita la carga del gel y hace que la muestra se hunda en el pocillo. Aplique con mayor facilidad tampón de carga en los pocillos vacíos para mantener condiciones uniformes durante la corrida.Cuando su gel esté en la solución de fijación, puede secarlo utilizando un secador de geles al vacío para obtener imágenes adicionales o escanear el gel directamente, dependiendo de la etiqueta o tinción que esté utilizando. Esta página U es útil para analizar o aislar muestras de ADN de cadena sencilla o ARN. Los geles pueden almacenarse a temperatura ambiente.Por lo tanto, envuelva el gel en una toalla de papel y súbelo con agua o tampón de corrida. Coloque el gel envuelto y humedecido en una bolsa de plástico hermética y utilícelo dentro de las 48 horas. Un problema frecuente es la sonrisa del gel.Esto se debe a una distribución desigual del calor a través del gel. Si el gel no está rodeado por tampón, la colocación de una placa metálica puede mejorar la calidad del gel. Hola, soy Hi Kasam.Estoy con la Universidad Tecnológica N Yang. Les mostré cómo realizar una polimerización con desnaturalización. Hasta la próxima.

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