Name: Escalable neumático matrices inyector para Viral focalización de los circuitos cerebrales intactas en 3-D (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Aprende a construir un inyector neumático paralelo para la focalización viral de circuitos cerebrales en 3D. Este método permite la manipulación óptica de circuitos neuronales con precisión en modelos animales.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ESB reconoce financiación Premio a la Innovación Nuevo Director del NIH (DP2 OD002002-01), NIH subvención-desafío 1RC1MH088182-01, NIH Gran oportunidades de becas 1RC2DE020919-01, NIH 1R01NS067199-01, la NSF (0835878 y 0848804), el McGovern Instituto el Programa de Premios Neurotechnology , el Departamento de Defensa, NARSAD, la Fundación Alfred P. Sloan, Jerry y Marge Burnett, el Premio de Investigación SFN para la Innovación en Neurociencia, el Media Lab del MIT, la Fundación Benesse, y la Fundación Wallace H. Coulter.

1. La construcción de Clamp estereotáxica <ol><li> La pinza estereotáxica se usa para sujetar el conjunto inyector a la stereotax, de modo que los inyectores estén paralelos al brazo estereotáxica. </li><li> Cada laboratorio sólo necesita una pinza, a menos que se prevé que más de una cirugía puede llevarse a cabo de forma simultánea. En este caso, hacer el mismo número que el número máximo previsto de cirugías simultáneas. También puede ser recomendable hacer un extra, en caso de daños a la primera. </li><li> Para hacer la pinza estereotáxica, en primer lugar, un diámetro de 1,5 mm exterior (OD) cánula de acero se reduce a 2 pulgadas de largo, y uno de los extremos hacia abajo hasta que se Dremeled plana. </li><li> A continuación, una pequeña porción (aproximadamente 0,5 x 0,5 cm) se corta de PCB proto-board, para ser utilizado como separador. </li><li> Usando un cortador láser para asegurar que los recortes hechos son perpendiculares a la superficie del material, dos rectángulos iguales (1 / 2 &quot;x 3 / 8&quot;) se cortan de 1 / 8 &quot;láminas de acrílico, cada rectángulo que tiene dos agujeros circulares en esquinas opuestas del rectángulo. El primer agujero tiene un diámetro de 1,5 mm, y es lo suficientemente grande como para mantener la cánula de metal bien. El segundo agujero tiene un diámetro de 1 / 16 &quot;(fig. 1C). </li><li> La cánula de metal se inserta en el orificio de 1,5 mm de un rectángulo, y luego a través del agujero de 1,5 mm de la segunda. El extremo inferior de la cánula está alineado con la cara inferior del rectángulo inferior, adoptando la forma de un palo de hockey. </li><li> Manteniendo el separador firmemente sostiene, entre los dos rectángulos, esta estructura es unirse entre sí por el uso de pegamento caliente alrededor de los agujeros y cánula de 1,5 mm, teniendo cuidado de evitar pegar el separador de los rectángulos. Plastilina puede ser útil para mantener las cosas en este proceso. </li><li> Después de que el pegamento se haya secado, un tornillo de 1-72 se inserta en el orificio de 1 / 16 de la parte superior de los rectángulos. A continuación, una tuerca hexagonal 1-72 se enrosca en el extremo del tornillo de 1-72, y se aprieta. El tornillo y la tuerca que sujetan la abrazadera. </li><li> Para colocar la tuerca de la cara inferior del rectángulo de fondo, una pequeña cantidad de epoxi de 5 minutos se dejan caer por el borde de la tuerca hexagonal, sin permitir que el epoxi para entrar en los hilos de la tuerca hexagonal o tornillo. Cualquier arcilla se extrae, y se confirma que el separador puede ser sostenido firmemente en su lugar apretando el tornillo. </li></ol> 2. Preparación del sistema para la medida amplia de inyección: Hamilton bomba y stereotax <ol><li> El sistema de matriz de inyección pueden ser personalizados para casi cualquier conjunto de coordenadas en el cerebro. </li><li> El primer usuario localiza las coordenadas de los puntos de inyección deseada en un ratón (o de otras especies) atlas del cerebro, convirtiendo a las coordenadas utilizadas en los stereotax (en este caso, X, Y, y Z-coordenadas). El número de sitios de inyección (tres en las figuras 1A y 1B) en adelante se llamará k. </li><li> número k de 10 l jeringas Hamilton se colocan en una bomba de jeringa de inyección / retiro como este aparato de la Universidad de Harvard. </li><li> A continuación, tres metros de largo, pedazos de tubo de polietileno están firmemente adherido a la aguja de cada jeringa Hamilton. </li><li> Por cada pieza de tubo de polietileno, un F-252 tubos de manga Upchurch Científico se desliza sobre el extremo abierto y conectado a un adaptador de tubo P-627 con la tuerca y el casquillo incluye, además de Upchurch Científico. </li></ol> 3. La construcción de la matriz a medida inyector <ol><li> Cada matriz de inyección se adapta al conjunto de coordenadas que el usuario elija. Sin embargo, para conjuntos de coordenadas que sólo difieren en la traducción y / o rotación, la misma variedad de inyección se pueden utilizar. </li><li> Considerando sólo el X relativa y las coordenadas Y de los sitios de inyección, los agujeros k se perforan en un PCB proto-board de espesor 1 / 32 &quot;, con la misma distancia relativa. Estos agujeros son perforados con un molino de Modela mini y un .011&quot; de diámetro de broca de McMaster-Carr. Asegúrese de utilizar un ritmo lento de la perforación (Z-velocidad) para evitar la rotura o desgaste de la broca. Antes de retirar la placa de la planta, un rectángulo es perforado alrededor de los agujeros pequeños, con una broca de mayor diámetro de 1 / 32 &quot;, para evitar el uso de la más pequeña del Código para la fábrica de Mini se puede generar fácilmente utilizando MATLAB;. Muestras código se proporciona en los siguientes archivos. <ol class="lroman"><li> generate.m - código de MATLAB para generar código Modela de coordenadas deseadas </li><li> holes_ex.rml - Modela el código de patrón de timbre de perforación (ocho agujeros) en el proto-board </li><li> outline_ex.rml - Modela el código de rectángulo alrededor de los agujeros de perforación </li></ol></li><li> 245 m OD/100 micras de diámetro interior (ID) tubo capilar de sílice fundida, disponible en las tecnologías de Polymicro, se corta en número k de 3 pedazos de una pulgada. Estos comprenden los inyectores individuales. Una pieza desechable de tubos capilares se asomó a través decada uno de los agujeros, para limpiar los residuos sin obstruir los inyectores real. Los inyectores se inserta a mitad de camino en cada agujero, de modo que se mantienen firmes y paralelas entre sí. Los inyectores son epóxico a la junta, que forman la estructura de la matriz del inyector. Todo lo que queda es ajustar los inyectores a la longitud correcta. </li><li> La matriz de inyección se une a la pinza estereotáxica mediante la colocación de una esquina de la proto-board entre los rectángulos de acrílico, y luego apretando el tornillo de la abrazadera estereotáxica. A continuación, la cánula metálica de la abrazadera se une a la stereotax, utilizando el mecanismo de fijación de la stereotax. </li><li> Todos los siguientes se realiza bajo un microscopio. Para uno de los inyectores exterior (es decir, que puede ser abordado desde el lado con un borde recto, sin chocar con alguno de los inyectores de otro tipo), la punta se extiende más allá de la parte inferior de la proto-board se corta con unas tijeras. Para las inyecciones cortical, es apropiado para que el inyector se extiende aproximadamente 5 mm más allá de la superficie de la proto-board. Para más inyecciones, este número puede ser aumentado por el incremento correspondiente en profundidad. La punta es aplanada con una herramienta Dremel. Consejos inyector también puede ser suelo en un ángulo como medida de precaución adicional contra la obstrucción, si la precisión en la profundidad es menos importante. </li><li> A continuación, un punto de referencia estable que se elija dentro del alcance del brazo estereotáxica, y el conjunto inyector se mueve de manera que la punta plana del exterior del inyector, es en este punto de referencia. </li><li> Un segundo inyector es elegido, junto con sus correspondientes coordenadas. En cuenta es la diferencia relativa de la altura (z) entre las coordenadas inyector primero y segundo. La matriz de inyección se mueve a lo largo del eje Z en esta distancia relativa. El inyector segundos se corta y Dremeled a la longitud correcta, de modo que la punta del inyector segundo plano y ahora es a la altura del punto de referencia. La matriz de inyección se pueden mover en las direcciones X e Y para facilitar la comparación de la punta del inyector con el punto de referencia. </li><li> Este proceso de recorte se repite para el resto de los inyectores. </li></ol> 4. Montaje de todo el sistema <ol><li> La pinza estereotáxica y personalizado conjunto inyector, ambos ya construidos, se requieren para esta parte. </li><li> La parte de atrás de cada inyector (el extremo que no ha sido recortada) se inserta en un azul F-240 y la tubería de manga, con un P-235 tuerca y P-200 casquillos de Upchurch Científico, es conectado al adaptador de rosca ya está conectado a la bomba de Hamilton por la tubería de polietileno. Las instrucciones del fabricante se pueden consultar para más detalles. </li><li> Usando una aguja de calibre 27, aceite de silicona se inyecta en la parte posterior de las jeringas de Hamilton para que el sistema entero está lleno de la jeringa Hamilton a la punta del inyector, sin burbujas de aire en absoluto. </li><li> Como las jeringas Hamilton se vuelven a colocar en la bomba de Hamilton, el mayor volumen posible de aceite de silicona se mantiene en las jeringas. </li><li> Si el experimento requiere más jeringas que la bomba está diseñada para (dos en este caso), las jeringas se pueden colocar pequeños trozos de plástico (por ejemplo, tapas de aguja) para mantenerlos paralelos entre sí, y para asegurarse de que todas las piezas son impulsado por la bomba en la misma medida. O bien, un conjunto de bastidor multi-upgrade se pueden comprar en Harvard Apparatus para almacenar hasta 10 jeringas a la vez. </li></ol> 5. Inyecciones / cirugía <ol><li> El proceso de inyección con inyector de un paralelo es muy similar a la de la inyección con una pipeta única. </li><li> Es esencial el uso de recarga lenta / infundir las tasas a lo largo de este proceso, ya que rápidamente el bombeo podría poner presión sobre la articulación entre la tubería de grandes y pequeños. Peso máximo recomendado de la tasa: 2 l / min para la carga de virus, y 0,1 l / min para infundir virus. </li><li> Un ratón anestesiado se coloca en el stereotax, y permanece anestesiado durante todo el experimento. </li><li> Prepare el ratón, según sea necesario. Por ejemplo, con un bisturí, un solo corte se realiza por la línea media de la piel, de entre los ojos entre las orejas. La piel se estira hacia atrás para exponer el cráneo, y la fascia se limpia. Una pipeta de vidrio tirado se une a la stereotax. Las posiciones de las barras de la oreja se ajustan hasta bregma y lambda están alineados a la misma altura, y para que la línea que conecta ellos es paralelo al eje de la stereotax. Los ejes de la stereotax se orientan de acuerdo con el sistema de coordenadas en el que las coordenadas de la inyección se han calculado. El estereotáxica se pone a cero con la punta de la pipeta de vidrio en el bregma, y ​​luego la punta se coloca ligeramente por encima del cráneo, en la X e Y las coordenadas de uno de los sitios de inyección. </li><li> Usando un taladro dental, el cráneo debajo de la punta es cuidadosamente comparación de distancia hasta que queda una capa muy delgada de hueso. La pipeta de vidrio puede ser menored y se crió para comprobar que el agujero se perfora se centra en la posición correcta. Usando una aguja de calibre 30, un pequeño trozo de la capa es suave interceptado, en el X-y corregir las coordenadas, de modo que la duramadre se expone. Este agujero debe ser lo suficientemente grande como para ajustarse a uno de los inyectores (0,25 mm de ancho). Ver Figura 1 D para el diagrama. De esta manera, los pequeños agujeros, ancho de 0,25 mm se hacen en el cráneo, en la X e Y las coordenadas correspondientes a cada sitio de la inyección. </li><li> La pipeta de vidrio se desecha en un contenedor de objetos punzantes, y la medida amplia de inyección se une a la stereotax con la abrazadera estereotáxica. </li><li> Con el fin de ajustar correctamente el ángulo de la matriz de inyección, inyectores dos exteriores son elegidos para ser calibrados a un punto de referencia determinado, de la siguiente manera. Después de uno de los inyectores se corresponde con el punto de referencia, tenga en cuenta la relación X e Y las distancias entre los puntos de inyección en relación con este inyector y el otro. Los ejes de la stereotax se ajustan de manera que todo el conjunto inyector se mueve en la X e Y las direcciones de estas distancias relativas. Si el inyector segundo no está alineado con el punto de referencia, la cánula de metal se afloja y se gira. Este proceso se repite iterativamente hasta que la matriz de inyección tiene un ángulo correcto. </li><li> Antes de llenar los inyectores con el virus, los inyectores están llenos de aceite de silicona hasta que las jeringas se encuentran en el punto 2 l (o superior). Esto proporciona una zona de amortiguamiento, por lo que las burbujas de aire o la obstrucción en la punta se puede quitar fácilmente empujando hacia adelante con aceite de la bomba de Hamilton, sin tener que volver a llenar el sistema con aceite de silicona de la parte posterior de las jeringas, como se describe anteriormente. </li><li> Un trozo de Parafilm estéril se coloca en el cráneo, y los inyectores son ligeramente baja en el Parafilm. Para las coordenadas con profundidades muy variables, una costumbre elaborado: una parte (por ejemplo, un objeto con forma de escalera) pueden facilitar la carga. </li><li> Las partes siguientes se supone que uno de l virus se va a cargar en cada lugar (las siguientes cantidades deben reducirse si se desean cantidades más pequeñas). Con el fin de garantizar que&gt; 1 l de virus se inyecta en cada sitio, de 1,5 l de virus es pipeta en el Parafilm o escalera en la punta de cada inyector. </li><li> Con la tasa de recambio de la bomba de Hamilton pone a 1 l / min, 1,2 l de que el virus se vuelve a llenar en cada inyector. </li><li> La punta de los más largos del inyector se pone a cero en el bregma, a continuación, la matriz de inyección se desplaza a la X e Y las coordenadas de ese inyector. Si la obstrucción es un problema, dicen que si muchos objetivos profundos están involucrados: incluso antes de insertar las puntas de inyección en el cerebro, a veces es aconsejable comenzar la infusión de la bomba, hasta que el virus se puede ver que salen de todos los consejos del inyector. Esto elimina las burbujas de aire en la punta del inyector, y también asegura que no se atasque. En el caso de la obstrucción, la bomba de Hamilton se encuentra a infundir un breve pulso a una velocidad mayor de 2 l / min, para limpiar suavemente la obstrucción. </li><li> La matriz de inyección se hace descender, a través de los pequeños orificios hechos con las agujas de calibre 30, a la correcta Z-profundidad. </li><li> 1 l de virus es inyectado a través de cada inyector, a 0,1 l / min. </li><li> Las inyecciones se quedan solos durante 30 minutos. </li><li> Después de la matriz inyector extrae lentamente desde el cerebro, la bomba de Hamilton está en infundir a la misma tasa de 0,1 l / min, con el fin de comprobar si la obstrucción en cada inyector. </li><li> A continuación, los inyectores se limpian por la reposición y la infusión de 1,5 l de etanol a 2 l / min. </li><li> Finalmente, los inyectores se rellenan con aceite de silicona para mantener la zona de amortiguación 2 l de cada jeringa Hamilton. </li><li> Todo el equipo debe ser esterilizado antes y después del procedimiento, de acuerdo con la bioseguridad de su institución y los protocolos de uso animal. </li></ol> 6. Resultados representante El paralelo conjunto inyector acelera una cirugía más o menos por un factor igual a la cantidad de inyectores, sin contar la instalación y el tiempo de recuperación, aunque los tiempos individuales dependerá de la habilidad del médico. Para una inyección de 1 microlitro, por lo general ver la expresión de lentivirus en una esfera de aproximadamente 1 mm de diámetro (Fig. 1E). La precisión de la inyección era tal que la variabilidad en el posicionamiento de la punta, a partir de los ensayos, fue de aproximadamente 45 micras (desviación estándar de la distancia desde la posición de la punta a la posición de punta de la intención). <img src="/files/ftp_upload/1489/1489fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Diseño, implementación y uso de un virus en paralelo serie inyector. Un esquema, del sistema de matriz paralela inyector, mostrando una triple configuración de los inyectores, por tres inyecciones simultáneas. B, la fotografía de una matriz de tres paralelos de inyección como en el diagrama de un . <stRong&gt; C, abrazadera estereotáxica, que se muestra en líneas generales desde la parte superior D, la ilustración de la técnica para una eficiente, minimizando el daño-, la apertura de agujeros en el cráneo para inyector de inserción en el cerebro:. con un taladro dental, delgada del cráneo hasta espesor de ~ 50 micrones, a continuación, utilizar la punta de una aguja para abrir una pequeña craneotomía. E, que muestra imágenes de fluorescencia canalrodopsina-2 (ChR2)-GFP-etiquetados células en tres regiones corticales del ratón, como se había previsto por la triple serie de inyección se muestra en la B.

<ol><li>Chow, B., Han, X., Qian, X., Boyden, E. S. High-performance halorhodopsin variants for improved genetically-targetable optical neural silencing. Frontiers in Systems Neuroscience. 2009 Feburary 26, Slat Lake City, Utah, , Computational and systems neuroscience. (2009).</li>
<li>Bi, A., Cui, J., Ma, Y. P., Olshevskaya, E., Pu, M., Dizhoor, A. M., Pan, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+a+microbial-type+rhodopsin+restores+visual+responses+in+mice+with+photoreceptor+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration.</a> Neuron. 50, 23-33 (2006).</li>
<li>Han, X., Qian, X., Bernstein, J., Zhou, H., Franzesi, G., Stern, P., Bronson, R., Graybiel, A., Desimone, R., Boyden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-Timescale+Optical+Control+of+Neural+Dynamics+in+the+Nonhuman+Primate+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Millisecond-Timescale Optical Control of Neural Dynamics in the Nonhuman Primate Brain.</a> Neuron. 62 (2), 191-198 (2009).</li>
<li>Zhang, F., Wang, L. P., Brauner, M., Liewald, J. F., Kay, K., Watzke, N., Wood, P. G., Bamberg, E., Nagel, G., Gottschalk, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Han, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-color+optical+activation%2C+silencing%2C+and+desynchronization+of+neural+activity%2C+with+single-spike+temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution.</a> PLoS ONE. 2, e299-e299 (2007).</li>
<li>Szobota, S., Gorostiza, P., Del Bene, F., Wyart, C., Fortin, D. L., Kolstad, K. D., Tulyathan, O., Volgraf, M., Numano, R., Aaron, H. L., Scott, E. K., Kramer, R. H., Flannery, J., Baier, H., Trauner, D., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+neuronal+activity+with+a+light-gated+glutamate+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor.</a> Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).</li>
<li>Lima, S. Q., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+behavior+through+genetically+targeted+photostimulation+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons.</a> Cell. 121 (1), 141-152 (2005).</li>
<li>Zhang, F., Wang, L. P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2+and+optical+control+of+excitable+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells.</a> Nat. Methods. 3, 785-792 (2006).</li>
<li>Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+evaluation+of+photosensitivity+in+genetically+engineered+neurons+expressing+green+algae+light-gated+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels.</a> Neurosci Res. 54 (2), 85-94 (2006).</li>
<li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57 (5), 634-660 (2008).</li>
</ol>

Todos los procedimientos fueron realizados de acuerdo con la Guía del NIH para animales de laboratorio y aprobado por el Cuidado de Animales del MIT y el empleo y los Comités de Seguridad de la Biotecnología.

En los últimos años, una serie de organismos genéticamente codificados sensibilizadores óptica han permitido a las neuronas que se activan y silenciados en vivo de una manera temporal, precisa, en respuesta a breves pulsos de luz (por ejemplo, 1,4,5,6,7,8 , 11). Un método clave con la que las neuronas se han sensibilizado a la luz en el cerebro de los mamíferos, es a través de virus como lentivirus y virus adeno-asociados (AAV), que pueden entregar los genes que codifican para opsinas a los cerebros de los animales que van desde los ratones a los monos, en un forma segura y duradera (por ejemplo, 2,9,10). Los virus más rápido tiempo de respuesta permite que los transgénicos, especialmente para los organismos que no son organismos genética modelo como las ratas y monos, y por opsinas pueden permitir altos niveles de expresión que no puede ser posible en los escenarios de transgénicos. Aquí se demuestra una serie paralela de inyección capaz de crear, en un plazo de tiempo rápido &quot;, circuito a nivel de los transgénicos&quot;, que permite todo en 3 dimensiones las estructuras del cerebro que se forma viral dirigida a un gen, en un paso quirúrgico. La matriz de inyección comprende una o más bombas de desplazamiento que cada unidad de un conjunto de jeringas, cada uno de los que se alimenta en una de sílice fundida de poliamida / capilar a través de un conector de alta presión de alta disponibilidad. Los capilares son de tamaño, y después se inserta en, lugares deseados especificados por la costumbre, el fresado de una placa de posicionamiento estereotáctica, permitiendo así que los virus u otros reactivos que se entregarán al conjunto deseado de las regiones del cerebro. Para utilizar el dispositivo, el primer cirujano llena el subsistema de fluidos en su totalidad con petróleo, rellenos de los capilares con el virus, se inserta el dispositivo en el cerebro, e infunde reactivos lentamente (&lt;0,1 l / min). Esta tecnología permitirá que una amplia variedad de nuevos tipos de experimentos, como la escala de tiempo de milisegundos cierre de forma compleja en forma de estructuras (tales como el hipocampo) en momentos precisos en el comportamiento, la inactivación temporal, precisa de estructuras bilaterales que pueden actuar de forma redundante (como la izquierda y la amígdala derecha), y la perturbación de múltiples regiones cerebrales discretas (por ejemplo, conducir dos regiones conectados fuera de fase para estudiar cómo cruzada región sincronía depende de la actividad dentro de cada región, o estimular las entradas a una región, mientras que el silenciamiento de un subconjunto de los objetivos a fin de comprender cuál de los varios objetivos son fundamentales para la mediación de los efectos de los insumos). Para los grandes cerebros como los de los primates, en el que hemos demostrado recientemente óptico tipo de célula específica de activación neural 3, perturbando la actividad en un área de comportamiento relevantes pueden requerir el etiquetado viral de las estructuras grandes y complejas. Tomamos nota de que en paralelo matrices de inyección puede ser utilizado para inyectar casi cualquier carga - drogas, neuromoduladores, los neurotransmisores, o incluso células - en el complejo de 3-D los patrones en el cerebro, de manera temporal, precisa. Por último, desde el punto de vista de traslación, es posible que el rápido, el paciente a medida terapia génica o dispositivos de administración de fármacos puede ser rápidamente diseñados y fabricados para que coincida con geometrías individuales del cerebro, el apoyo a nuevos tratamientos para una variedad de patologías, posiblemente mediante el uso de moléculas de control óptico. Las matrices de inyección están diseñados para ser más precisos, tanto espacial como volumétrica. En la X e Y las direcciones, esto se logra mediante la perforación de los agujeros con gran precisión puesto con un mini-molino de bajo costo, con los agujeros lo suficientemente grande como para ajustarse a los inyectores, de modo que los inyectores se mantienen paralelos entre sí, y de manera precisa ubicación. En la dirección Z, los inyectores se cortan con un aparato estereotáxico, lo que permite un nivel de precisión equivalente a la de la cirugía estereotáxica en sí. La precisión volumétrica surge de la precisión de la bomba de Hamilton, así como la casi nula volúmenes muertos conectores, una adaptación de la cromatografía líquida de alta presión (HPLC) sobre el terreno. Los inyectores son obtenidos de un tubo capilar de sílice fundida, que es fuerte y lo suficientemente rígido que mantiene la forma precisa y el espacio bajo presión, sin que el espesor de la pared más grande de alternativas tales como cánulas de acero. Pequeñas modificaciones se pueden hacer fácilmente para adaptar el conjunto inyector paralelo a una variedad de experimentos. Por ejemplo, si un menor volumen de virus o espaciamiento más fino se requiere, más pequeño tubo capilar puede ser empleado, junto con una broca correspondiente más pequeño. Dispositivos en el futuro podrán utilizar canales de microfluidos y bombas, para aumentar el número de inyectores en paralelo, para reducir al mínimo el tamaño (tal vez permita a estos dispositivos para ser montado en la cabeza de libertad de movimiento de los animales).

<table><tbody><tr><td>Herramienta Dremel</td><td>Herramienta</td><td>Dremel</td><td>3956-02</td><td></td></tr><tr><td>Cortadora láser</td><td>Herramienta</td><td>Universal Laser Systems</td><td>VLS2.30</td><td></td></tr><tr><td>Pistola de pegamento caliente</td><td>Herramienta</td><td>Stanley Bostitch</td><td>GR20</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de jeringa para inyección/retirada (bomba Hamilton)</td><td>Herramienta</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702001</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas Hamilton de 10 &amp;mu;l</td><td>Herramienta</td><td>Hamilton Co</td><td>701N</td><td>Se necesita una por sitio de inyección</td></tr><tr><td>Estereotáxico para ratón</td><td>Herramienta</td><td>Stoelting Co.</td><td>51725D</td><td></td></tr><tr><td>Fresadora mini Modela</td><td>Herramienta</td><td>Roland</td><td>MDX-15</td><td></td></tr><tr><td>Broca de diámetro 0.011&quot; para fresadora mini</td><td>Herramienta</td><td>McMaster-Carr</td><td>8915A12</td><td></td></tr><tr><td>Broca de diámetro 1/32&quot; para fresadora mini</td><td>Herramienta</td><td>McMaster-Carr</td><td>8848A35</td><td></td></tr><tr><td>Broca dental de alta velocidad</td><td>Herramienta</td><td>Lynx</td><td>333</td><td></td></tr><tr><td>Accesorios para broca dental</td><td>Herramienta</td><td>Pearson Assessments</td><td>F 35-08-25 F 35-07-10 P 86-02-38</td><td></td></tr><tr><td> </td><td> </td><td></td><td></td><td> </td></tr><tr><td>Cánula de acero inoxidable con diámetro exterior (DE) de 1,5 mm</td><td>Material</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>HTX-15R</td><td></td></tr><tr><td>Tornillo máquina ranurado de sujeción 1-72</td><td>Material</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>MX-0172B</td><td></td></tr><tr><td>Tuerca hexagonal 1-72</td><td>Material</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>HNX-0172</td><td></td></tr><tr><td>Placa de circuito impreso (proto-board), grosor de 1/32&quot;</td><td>Material</td><td>Digi-Key</td><td>PC57-T-ND</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de acrílico, grosor de 1/8&quot;</td><td>Material</td><td>McMaster-Carr</td><td>8560K239</td><td></td></tr><tr><td>Conectores HPLC</td><td>Material</td><td>Upchurch Scientific</td><td>F-252, P-627, P-200, P-235, F-240 (algunos de estos se pueden comprar en paquetes de 10; simplemente agregue una &amp;#8216;x&amp;rsquo; al final del número de pieza)</td><td>Se necesita uno por inyección por sitio, excepto F-252, P-627 y P-235, que pueden reutilizarse</td></tr><tr><td>Tubo capilar de sílice fundida, DE: 245 &amp;mu;m, DI: 100 &amp;mu;m</td><td>Material</td><td>Polymicro Technologies</td><td>2000022-10M</td><td></td></tr><tr><td>Epoxi de uso general de 5 minutos</td><td>Material</td><td>Permatex</td><td>84101</td><td>Epoxi de uso general de 5 minutos</td></tr><tr><td>Tubo de polietileno de 0,066 x 0,095 pulgadas</td><td>Material</td><td>VWR international</td><td>63018-827</td><td></td></tr></tbody></table>

escalable neumático matrices inyector para viral focalización de los circuitos cerebrales intactas en 3-d

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Nuestra comprensión de los circuitos neuronales - cómo mediar en los cálculos que la sensación subserve, pensamiento, emoción y acción, y la forma en que están dañados en enfermedades neurológicas y psiquiátricas - se vería enormemente facilitada por una tecnología para la rápida selección de genes complejo 3 - dimensiones circuitos neuronales, lo que permite la rápida creación de &quot;nivel de circuito transgénicos.&quot; Recientemente hemos desarrollado métodos de codificación en el que los virus sensibles a la luz de las proteínas pueden sensibilizar a los tipos específicos de células a escala de tiempo de milisegundos de activación y silenciamiento en el cerebro intacto. Presentamos aquí el diseño e implementación de una matriz de inyección capaz de entregar los virus (y otros líquidos) a docenas de puntos definidos dentro de la estructura 3-dimensional del cerebro (<strong&gt; Figura. 1A, 1B</strong&gt;). La matriz de inyección comprende una o más bombas de desplazamiento que cada unidad de un conjunto de jeringas, cada uno de los que se alimenta en una de sílice fundida de poliamida / capilar a través de un conector de alta presión de alta disponibilidad. Los capilares son de tamaño, y después se inserta en, lugares deseados especificados por la costumbre, el fresado de una placa de posicionamiento estereotáctica, permitiendo así que los virus u otros reactivos que se entregarán al conjunto deseado de las regiones del cerebro. Para utilizar el dispositivo, el primer cirujano llena el subsistema de fluidos en su totalidad con petróleo, rellenos de los capilares con el virus, se inserta el dispositivo en el cerebro, e infunde reactivos lentamente (&lt;0,1 microlitros / min). La naturaleza paralela de la matriz de inyección facilita el etiquetado rápido, preciso, robusto y de toda circuitos neuronales con capacidades de carga viral tal como sensibilizadores óptica para permitir que la luz de activación y el silenciamiento de los circuitos cerebrales definidos. Junto con otras tecnologías, como las matrices de fibra óptica para la entrega de la luz a los conjuntos deseados de las regiones del cerebro, que esperamos crear una caja de herramientas que permite a la sistemática exploración de causal funciones neuronales en el cerebro intacto. Esta tecnología no sólo puede abrir tales métodos sistemáticos para circuito centrado en la neurociencia en los mamíferos, y de facilitar el etiquetado de las regiones del cerebro en los animales grandes, como los primates no humanos, pero también puede abrir un camino de traslación clínica de células específicas de prótesis de control óptico , cuya precisión puede permitir un mejor tratamiento de los trastornos cerebrales intratables. Finalmente, los dispositivos como se describe aquí puede facilitar precisamente el momento oportuno suministro de fluidos de otras cargas, como las células madre y los agentes farmacológicos, a tres dimensiones de estructuras, de manera fácilmente personalizable por el usuario.

Control y análisis de circuitos neuronales<em&gt; In vivo</em&gt; Se vería facilitada por una tecnología para la entrega de los virus y otros reactivos que desee en 3 dimensiones conjuntos de las regiones del cerebro. Demostramos a medida de fluidos de fabricación de serie del inyector, y la entrega de forma viral codificada sensibilizadores óptica, que permite la manipulación óptica de los circuitos cerebrales complejas.

Escalable neumático matrices inyector para Viral focalización de los circuitos cerebrales intactas en 3-D

Nuestra comprensión de los circuitos neuronales —cómo median los cómputos que sustentan la sensación, el pensamiento, la emoción y la acción, y cómo se ven alterados...

Dos piezas rectangulares de acrílico se cortan con láser y luego se ensamblan para formar la pinza estereotáxica, que sirve para sujetar firmemente la matriz de inyección con respecto a las estereotácticas. Una bomba de jeringa se carga con jeringas conectadas a tubos de polietileno para un circuito cerebral deseado. Se utiliza una fresadora para perforar orificios a través de los cuales se inserta tubo de sílice fundida, formando así los inyectores.Los inyectores se montan de forma reversible en la pinza y luego se recortan para dirigirse a los circuitos cerebrales de interés. Cada inyector se une a un canal de polietileno individual. La preparación del sistema para su uso implica llenar el sistema a través de las jeringas con aceite de silicona y luego cargar los reactivos fluidos en los inyectores.El inyector paralelo se inserta luego en los objetivos cerebrales y se infunden los reactivos. Hola, soy Stephanie Chan del Grupo de Neurobiología Sintética del MIT. Hasta ahora, la expresión de genes en circuitos cerebrales espacialmente complejos ha requerido ya sea la creación lenta y costosa de animales transgénicos o el minucioso proceso de inyecciones virales, que deben realizarse un lado a la vez.Hoy les vamos a mostrar cómo construir y utilizar una matriz de inyectores paralelos que puede entregar fluidos en patrones tridimensionales complejos en el cerebro. Utilizamos esta matriz para generar rápidamente ratones transgénicos específicos para circuitos, entregando virus en paralelo a través del conjunto de inyectores para alcanzar todos los objetivos simultáneamente. Nuestro inyector puede utilizarse para entregar cualquier reactivo fluido a una distribución compleja de sitios cerebrales.Nuestro objetivo hoy es entregar virus que codifican proteínas sensibles a la luz para poder activar y desactivar de manera temporalmente precisa tipos celulares específicos en circuitos específicos. En nuestro laboratorio, utilizamos esta tecnología junto con matrices de fibras ópticas que suministran luz de manera específica al circuito. Así que comencemos.Primero construimos una pinza estereotáxica que sostiene el arreglo de inyectores y que puede montarse en el estereotaxia. Para fabricar la pinza se necesitan estos elementos: una cánula de acero de dos pulgadas con un diámetro externo u OD de 1,5 milímetros, con un extremo aplanado, un pequeño trozo de protoboard PCB de aproximadamente 0,5 por 0,5 centímetros y dos rectángulos idénticos.Un corte de media pulgada por tres octavos de pulgada, realizado en una lámina de acrílico de un octavo de pulgada, en cada uno de los dos rectángulos de acrílico. Corte dos orificios circulares en esquinas opuestas. El primer orificio debe tener un diámetro de 1,5 milímetros y ser lo suficientemente pequeño como para sujetar firmemente la cánula metálica.El segundo orificio debe tener un diámetro de una dieciseisava parte de pulgada. Inserte la cánula metálica en el orificio de 1,5 milímetros de un rectángulo, luego a través del orificio de 1,5 milímetros del segundo rectángulo, alinee el extremo inferior de la cánula con la cara inferior del rectángulo inferior para formar la forma de un palo de hockey, coloque el espaciador entre los dos rectángulos. La arcilla de modelar es útil para mantener las piezas juntas durante este proceso, al tiempo que mantiene el espaciador firmemente sujeto entre los dos rectángulos.Cierre esta estructura utilizando pegamento caliente alrededor de la cánula y los orificios de 1,5 milímetros. Tenga cuidado de no pegar el espaciador a los rectángulos después de que el pegamento se haya secado en el centro. Coloque una tuerca hexagonal de 1/72 sobre el orificio de 1/16, y luego enrosque un tornillo de 1/72 desde el lado opuesto de los rectángulos.Coloque pequeñas cantidades de epoxi de cinco minutos alrededor de los bordes de la tuerca para fijarla al rectángulo. Tenga cuidado de no permitir que el epoxi entre en la rosca de la tuerca o del tornillo. Una vez que el epoxi haya endurecido, inserte un tornillo de 1 72 en el orificio de un dieciseisavo de pulgada desde el lado superior de los rectángulos y enrósquelo en la tuerca.Retire la arcilla modeladora y confirme que el espaciador puede mantenerse firmemente en su lugar apretando el tornillo. El sistema de matriz de inyectores puede personalizarse para prácticamente cualquier conjunto de coordenadas en el cerebro. Primero, localice las coordenadas de los sitios de inyección deseados en un atlas cerebral de la especie de interés y conviértalas a las coordenadas apropiadas utilizadas por los estereotácticos.En esta demostración, utilizaremos un ratón y habrá tres sitios de inyección, y por lo tanto habrá tres tubos para los inyectores. Las coordenadas X, Y y Z corresponderán a las coordenadas mediales, anteriores, posteriores y/o ventrales de un atlas del cerebro de ratón. A continuación, coloque tres jeringas Hamilton de 10 microlitros en una bomba de jeringas de inyección y retracción, como esta de Harvard Apparatus, y sujete firmemente tres tramos de tubo de polietileno de un pie de longitud a la aguja de cada jeringa Hamilton para cada tramo de tubo de polietileno.Deslice un manguito de tubo F 2 52 sobre el extremo abierto y conéctelo a un adaptador de tubo P 6 27 utilizando la tuerca P 2 35 y el P 200 fal. Para construir la matriz de inyectores personalizada, utilice una fresadora modelo mini y una broca de 0,011 pulgadas de diámetro para perforar tres orificios en un espacio de protoboard PCB de un treintaidosavo de pulgada de espesor. Los tres orificios según las coordenadas X e Y relativas de los sitios de inyección antes de retirar la placa de la fresadora, taladre un rectángulo alrededor de los orificios pequeños usando una broca de diámetro de un treintaidosavo de pulgada.A continuación, se insertan individualmente los inyectores a la mitad en cada orificio de modo que queden sujetos firmemente y paralelos entre sí. Fíjelos con epoxi al tablero para formar la matriz de inyectores. Para fijar la matriz de inyectores al pinza estereotáxica.Coloque una esquina de la protoboard entre los rectángulos de acrílico y apriete el tornillo de la pinza estereotáxica. A continuación, fije la cánula metálica de la pinza al estereotaxia mediante el mecanismo de sujeción de los estereotipos. Estos pasos siguientes se realizan bajo un microscopio para uno de los inyectores externos que puede ser accedido desde el lateral con una arista recta sin chocar con ninguno de los otros inyectores.Corte la punta que sobresale por debajo de la base del protoboard. Aplane la punta con una herramienta dremel. A continuación, elija un punto de referencia estable dentro del rango del brazo estereotáxico y mueva el conjunto de inyectores de modo que la punta aplanada del inyector externo quede en este punto de referencia.Seleccione un segundo inyector junto con sus coordenadas correspondientes. Mueva el conjunto de inyectores a lo largo del eje Z según la diferencia relativa de altura o dirección Z entre las coordenadas del primer y segundo inyector. Recorte este segundo inyector para que su punta quede ahora a la altura del punto de referencia y nivélelo con una herramienta Dremel.La matriz de inyectores puede moverse en las direcciones X e Y para facilitar la comparación entre la punta del inyector y el punto de referencia. Después de repetir este proceso de recorte para los inyectores restantes, la matriz de inyectores está lista para ser ensamblada en todo el sistema. El ensamblaje de todo el sistema requiere la pinza estereotáctica previamente construida y la matriz de inyectores personalizada.Después de esterilizar la matriz de inyectores, inserte el extremo posterior de cada inyector, es decir, el extremo que no ha sido recortado, en un manguito azul F240. Utilizando una tuerca P235 y un P200 freal, conecte el extremo posterior del inyector al adaptador roscado que ya está unido a la bomba Hamilton mediante un tubo de polietileno. Con una aguja de calibre 27, inyecte aceite de silicona estéril en la parte posterior de las jeringas Hamilton hasta que todo el sistema quede lleno, desde las jeringas Hamilton hasta las puntas de los inyectores.Tenga mucho cuidado para no introducir burbujas de aire, ya que de lo contrario el volumen de virus inyectado será incorrecto o el virus podría no inyectarse en absoluto. Al reemplazar las jeringas Hamilton en la bomba Hamilton, se mantiene el volumen máximo posible de aceite de silicona en las jeringas. Si el experimento requiere más de dos jeringas, se pueden colocar espaciadores en la bomba Hamilton, como lo hemos hecho aquí.Alternativamente, se puede adquirir un kit de actualización de múltiples soportes de Harvard Apparatus para sostener hasta 10 jeringas simultáneamente. Para inyectar el virus en el cerebro del ratón, comience administrando analgésicos según lo indicado en su protocolo para animales. Coloque el ratón anestesiado en el estereotáctico y confirme, mediante un pellizco en el dedo del pie, que el animal está suficientemente anestesiado.Luego, realice una incisión única en la línea media de la piel, desde entre los ojos hasta entre las orejas. Retire la piel para exponer el cráneo y limpie la fascia. Fije una pipeta de vidrio estirada al estereotáctico.Ajuste las posiciones de las barras auriculares hasta que bgma y lambda estén alineados a la misma altura y la línea que los conecta sea paralela al eje Y del estereotáctico. Ponga a cero el estereotáctico con la punta de la pipeta de vidrio en bgma, y luego coloque la punta ligeramente por encima del cráneo en las coordenadas x e Y de uno de los sitios de inyección. Con un taladro dental, taladre cuidadosamente el cráneo por debajo de la punta hasta que quede una capa extremadamente delgada de hueso; con una aguja de calibre 30, retire suavemente un pequeño fragmento de esta capa en las coordenadas x e y correctas para exponer la duramadre.Este orificio debe ser lo suficientemente grande como para que quepa uno de los inyectores de esta manera. Se hacen orificios pequeños de 0,25 milímetros de ancho en el cráneo en las coordenadas x e y correspondientes a cada sitio de inyección. Tras finalizar la perforación, deseche la pipeta de alineación de vidrio y fije la matriz de inyectores personalizada al estereotáxico utilizando la pinza estereotáxica.Para ajustar correctamente el ángulo de la matriz de inyectores, seleccione dos inyectores exteriores que se calibrarán respecto a un punto de referencia determinado. Una vez que uno de los inyectores coincida con el punto de referencia, considere las distancias relativas en las direcciones X e Y entre los sitios de inyección de este inyector y del otro. Mueva la matriz de inyectores en las direcciones X e Y según estas distancias relativas. Si el segundo inyector no está alineado con el punto de referencia, se afloja la cánula metálica y se gira. Repita este proceso de forma iterativa hasta que la matriz de inyectores esté orientada correctamente. Establezca la velocidad de recarga de la bomba Hamilton en un microlitro por minuto y rellene los inyectores con aceite de silicona hasta que las jeringas alcancen el punto de dos microlitros o más. Esto proporciona una cantidad de aceite de reserva para que cualquier burbuja de aire o obstrucción en la punta pueda eliminarse fácilmente empujando el aceite hacia adelante mediante la bomba Hamilton, sin necesidad de recargar todo el sistema con aceite de silicona desde la parte trasera de las jeringas, como se describió anteriormente.Coloque un trozo limpio de paraformo sobre el cráneo y baje suavemente los inyectores sobre el paraformo. Si se pretende administrar un microlitro de virus a cada sitio, pipetee 1,5 microlitros de virus sobre el paraformo por cada sitio, con la misma velocidad de recarga de un microlitro por minuto. Recargue 1,2 microlitros del virus en cada inyector.Coloque en cero la punta del inyector más largo en bgma, y luego desplace la matriz de inyectores a las coordenadas X e Y de ese inyector. Baje la matriz de inyectores a través de los pequeños orificios hechos con las agujas de calibre 30 hasta alcanzar la profundidad Z correcta. Inyecte un microlitro de virus a través de cada inyector a una velocidad de 0,1 microlitros por minuto o más lenta.Deje las inyecciones durante 30 minutos para que se difundan. Después de 30 minutos, extraiga lentamente la matriz de inyectores del cerebro. Luego, configure la bomba Hamilton para infundir al mismo ritmo de 0,1 microlitros por minuto con el fin de verificar obstrucciones en cada inyector.Después de eso, limpie los inyectores rellenándolos e infundiendo dos microlitros de etanol a una velocidad de dos microlitros por minuto. Finalmente, rellene los inyectores con aceite de silicona para mantener la zona de amortiguación de dos microlitros en cada jeringa Hamilton. Esta figura muestra el resultado del uso de la matriz de inyección mostrada anteriormente, que contiene tres cánulas, para administrar reactivos virales a partes distribuidas del cerebro del ratón.En este caso, la carga genética del virus contiene la molécula fluorescente GFP, lo que resulta en tres volúmenes fluorescentes de células marcadas en un solo paso. En principio, se puede utilizar un número arbitrario de cánulas para construir una matriz de inyectores virales. Aquí, por ejemplo, se muestra una matriz de inyectores adecuada para el objetivo bilateral del CA1 del hipocampo con 16 inyectores.Mediante el protocolo que les hemos mostrado hoy, podrán administrar un virus en un patrón tridimensional al cerebro, creando eficazmente transgénicos a nivel de circuito. Además, la matriz de inyectores paralelos puede utilizarse para administrar cualquier reactivo fluido al cerebo, lo que posiblemente permita, por ejemplo, entregar agonistas dopaminérgicos de manera patrón a circuitos neuronales específicos en un animal con la cabeza fija que se encuentra en actividad. Gracias por vernos y buena suerte con sus experimentos.

scalable-fluidic-injector-arrays-for-viral-targeting-intact-3-d-brain

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

En este artículo, se muestra un método para fabricar agujas capilar de vidrio con una luz de 50 micras. Esta técnica reduce significativamente el daño cerebral, minimiza la difusión pasiva de las drogas y permite una segmentación precisa en el cerebro de roedores.

Focalización de estructuras profundas del cerebro con microinyecciones de entrega de medicamentos, vectores virales, o trasplantes de células

Aquí presentamos la inyección intracraneal de vectores AAV de marcaje fluorescente de las neuronas y la glía en la corteza visual.

Inyección intracraneal de adeno-asociado vectores virales

Fuente: Pereira, M. et. al., Reprogramación directa in vivo de células gliales residentes en interneuronas mediante inyección intracerebral de vectores virales. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra la inyección estereotáxica de un virus adenoasociado en la corteza cerebral de un ratón transgénico para administrar genes reporteros fluorescentes y de reprogramación neuronal dependientes de Cre en células gliales.

Inyección estereotáxica de vectores virales para la reprogramación de células gliales en un modelo de ratón

Aquí demostramos una técnica para la transducción neuronal generalizada mediante inyección intraventricular de virus adenoasociados en el cerebro de ratón neonatal.  Este método proporciona una manera rápida y fácil de lograr la expresión de por vida de los transgenes administrados viralmente.

Inyección Viral Intracerebroventricular de Neonatología del ratón Cerebro de transducción neuronal persistente y generalizada

El cerebro es un sitio único con cualidades que no están bien representados por los análisis in vitro o ectópicos. Modelos ortotópico de ratón con la ubicación y características de crecimiento reproducibles se pueden crear de forma fiable con inyecciones intracraneales utilizando un instrumento de fijación estereotáxica y una bomba de inyección de baja presión.

Crear anatómicamente exactos y reproducibles intracraneal xenoinjertos de tumores cerebrales humanos

El sistema / Cas9 CRISPR ofrece el potencial para que la edición del genoma específico accesible y asequible para la comunidad científica. Este protocolo está destinado a demostrar cómo crear virus que Knockout un gen de interés utilizando el sistema / Cas9 CRISPR y, a continuación, inyectarlos estereotáxica en el cerebro del ratón adulto.

Proyectos, Embalaje y Entrega de alto título de CRISPR Retro y lentivirus vía estereotáxica Inyección

Aquí, demostramos la convección guiada por resonancia magnética (RM) entrega mejorada (CED) de vectores virales en la corteza como un enfoque eficiente y simplificado para lograr la expresión optogenética a través de grandes áreas corticales en el cerebro macaco.

Convección Mejorada Entrega de Vector Viral Asociado a Adeno Optogenético a la Corteza de Rhesus Macaque Bajo Guía de Imágenes de RMN en Línea

Aquí se describe un procedimiento estereotáctico que puede apuntar a regiones cerebrales desafiantes y difíciles de alcanzar (debido a limitaciones espaciales) utilizando un enfoque coronal en ángulo. Este protocolo es adaptable tanto a modelos de ratón como de rata y se puede aplicar a diversas aplicaciones neurocientíficas, incluida la implantación de cánulas y microinyecciones de construcciones virales.

Enfoque estereotáctico en ángulo adaptable para técnicas versátiles de neurociencia

Este protocolo demuestra el uso de una plataforma robótica para la microinyección en células madre y neuronas neuronales individuales en las rebanadas cerebrales. Esta técnica es versátil y ofrece un método de seguimiento de células en tejido con alta resolución espacial.

Manipulación de células madre y neuronas neuronales únicas en las rebanadas cerebrales mediante la microinyección robótica

Tal como se implementa actualmente, la optogenética en primates no humanos requiere la inyección de vectores virales en el cerebro. Un método de inyección óptimo debe ser confiable y, para muchas aplicaciones, capaz de dirigirse a sitios individuales de profundidad arbitraria que se identifican de manera fácil e inequívoca en la histología postmortem. Se presenta un método de inyección con estas propiedades.

Inyecciones de vectores AAV para optogenética en cerebro de primates no humanos anestesiados y despiertos

El miniscopio de imágenes de calcio in vivo es una técnica poderosa para estudiar la dinámica neuronal y los microcircuitos en ratones que se comportan libremente. Este protocolo describe la realización de cirugías cerebrales para lograr buenas imágenes de calcio in vivo utilizando un miniscopio.

Inyección viral estereotáxica e implantación de lentes de índice de gradiente para imágenes de calcio in vivo en el cerebro profundo

Aprende a construir un inyector neumático paralelo para la focalización viral de circuitos cerebrales en 3D. Este método permite la manipulación óptica de circuitos neuronales con precisión en modelos animales.

Escalable neumático matrices inyector para Viral focalización de los circuitos cerebrales intactas en 3-D

Explorar más videos