Name: Imágenes in vivo de Deep capas corticales con un microprisma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-27T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Aprende a realizar imágenes in vivo de capas profundas de la corteza cerebral en ratones utilizando microprismas de vidrio. Esta técnica permite visualizar las seis capas corticales simultáneamente con amplio campo de visión y resolución suficiente para observar espinas dendríticas.

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Damos las gracias a Anthony J. Koleske, PhD de proporcionar a los ratones YFP.

Parte 1: Óptica microprismas y configuración del microscopio <ol><li> El microprismas que utilizamos son de 1 mm, en ángulo recto a partir de prismas de cristal BK7 comprados a la Corporación Optosigma (Figura 1). Microprismas se manejan con las pinzas siempre que sea posible. </li><li> La hipotenusa del microprism está recubierta con plata mejorado para proporcionar una reflectividad superior a 97% 400 a 2000 nm. Esto proporciona la reflexión interna de los dos la luz de excitación láser y la fluorescencia emitida. </li><li> Microprismas siempre son manejados con pinzas si es posible. Se usan guantes en todo momento para mantener el prisma limpio. </li><li> Utilizamos una costumbre-construido de dos fotones microscopio capaz de pequeños animales de imagen. El animal, que se adjunta al dispositivo de estereotaxia, se coloca en un escenario de 3 ejes motorizados. </li><li> El microscopio está conectado a un PC con Windows con software scanimage. Scanimage es un software de adquisición de imágenes en Matlab por Pologruto et al 1. </li><li> Para obtener imágenes de microprismas, recopilamos las imágenes con una resolución de 1024 x 1024 o 512 x 512 píxeles. Además, típicamente escanean a los 2 ms / línea y 4 ms / línea. </li><li> Hay dos tipos de objetivos son utilizados en los experimentos: <ul><li> A la baja apertura numérica (NA) de aire para todo el objetivo de imágenes de campo de visión (ver la tabla de reactivos y equipos). </li><li> Un alto NA objetivo de aire con un collar de corrección de vidrio capaz de minimizar las aberraciones esféricas inducidas por 0-2 mm de vidrio (véase la tabla de reactivos y equipos). </li></ul></li><li> Cuando el animal está listo para la imagen en un objetivo de bajo aumento, alinear el patrón de trama cuadrada de escaneo de láser con la parte superior de la microprism. Esto le ayudará a orientar a la imagen y hacer un uso eficiente de la potencia del láser. </li><li> El uso de un mayor objetivo de NA con un collar de cristal de corrección, ajuste el collar de corrección para corregir aproximadamente 1 mm de vidrio. Una vez que una imagen fluorescente aparece durante el experimento, un cuidado puede alcanzar en el interior del microscopio con el fin de optimizar el collar de corrección para maximizar la resolución de imagen. </li></ol> Parte 2: la supervivencia Cirugía Animal e Inserción microprisma <ol><li> La duración del procedimiento, desde la incisión inicial hasta la finalización de la imagen, depende de los objetivos del experimento. Sin embargo, la colocación no la supervivencia de procedimiento quirúrgico y microprism se puede esperar que tomará aproximadamente 30 a 40 minutos para completar. </li><li> Ratones (P30-P60) se pesan y se anestesiaron con una inyección adecuada de propiedad intelectual de la ketamina (100 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg) a un plano adecuado para procedimientos quirúrgicos. </li><li> A lo largo de todo el experimento, el animal debe ser revisado cada 15-20 minutos para evaluar su nivel de anestesia. Si el animal reacciona a una empresa puntera de sujetador, una dosis suplementaria de ketamina / xilazina es necesario. Normalmente, una dosis suplementaria es de un tercio de la dosis inicial y se puede preparar de antemano en una jeringa para inyección IP inmediata si es necesario. </li><li> Una vez que el ratón está bien anestesiado, la mayoría de los pelos de la cabeza del animal se afeita con un condensador de ajuste con una cuchilla # 40. </li><li> Nair ® se aplica a los pelos que queda en la cabeza para ayudar a crear una superficie libre de pelos que se pueden obtener en el camino de la microprism durante la exploración. Después de 5 minutos, el Nair ® se limpia con un hisopo de algodón. </li><li> El animal anestesiado se coloca correctamente en un dispositivo de estereotaxia ratón. Durante los procedimientos quirúrgicos y sesiones de formación de imágenes del animal se mantiene en un agua llena de almohadilla térmica a 36 grados Celsius. </li><li> Con la cabeza del animal bien colocado en su lugar, una incisión limpia se realiza con un bisturí en la línea media del cráneo para separar la piel. </li><li> Una pequeña cantidad de peróxido de hidrógeno al 3% se coloca en un bastoncillo de algodón y se aplica en el cráneo para eliminar las membranas entre el cráneo y la piel. </li><li> El peróxido de hidrógeno también ayuda a revelar bregma, un hito importante en saber dónde realizar la craneotomía y la inserción microprism. </li><li> Antes de la craneotomía se inicia, las barras de bar morder la oreja y estén debidamente ajustados a la inclinación del cráneo expuesto de tal manera que es, básicamente, al nivel de la mesa. Esto proporciona una mejor plataforma para la craneotomía. Además, esto hace que la superficie superior de la perpendicular de prisma con la luz de excitación de entrada. Esto ayudará a minimizar las aberraciones ópticas, mientras que la imagen. </li><li> Una pequeña fresa dental (~ 0,8 mm tamaño de la cabeza) está conectado a una herramienta Dremel ® utilizando un brazo de extensión flexible. Para craneotomías, que establece la velocidad a aproximadamente entre 7.000 y 10.000 revoluciones por minuto. </li><li> La fresa dental es desnatada a lo largo del cráneo hasta una ranura cuadrada se establece en el hueso. Los lados de la plaza es de aproximadamente 2-3 mm de longitud y caudal centrada 1,5 mm y 1 mm lateral a bregma. </li><li> Continuando con el adelgazamiento del hueso hasta una pequeña abertura se realiza a través del cráneo. Un par de pinzas de can levantar el colgajo óseo fuera del cráneo. </li><li> La duración debe ser eliminado antes de la microprism puede ser insertado en la corteza. El sangrado se controla mejor al permitir que la sangre coagule en la superficie durante varios minutos. Después, la sangre coagulada se retira con una esponja quirúrgica antes de insertar el microprism. </li><li> Para ayudar a ayudar a la alineación del prisma con la corteza, la cara vertical de la microprism es alineadas en paralelo con las asas de las pinzas. </li><li> Con el prisma de considerar adecuadamente, el microprism todo se inserta hasta la parte superior del prisma esté al ras con la superficie neocortical. </li><li> Cuando se inserta correctamente, el microprism debe permanecer en la posición correcta. Cualquier sangrado que se produce es mínima y puede ser absorbido con una esponja quirúrgica pequeña. Una vez que el prisma está en el lugar que el animal está listo para su imagen. </li><li> Después de un microprism se ha utilizado en un animal, se puede volver a utilizar varias veces. Sin embargo, tiene que ser limpiado para eliminar cualquier resto de material biológico. Esto se puede lograr mediante la inmersión del prisma en un pequeño volumen de HCl ácido, seguido de un baño en metanol. El microprism limpieza puede ser envuelto en papel de la lente hasta su uso futuro. </li></ol> Parte 3: Resultados de Representante <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Imágenes de la microprism en ángulo recto. Prismas utilizados en este experimento son de un milímetro, prismas de vidrio BK7 con una capa de plata mejora de la hipotenusa para que la reflexión interna de la excitación y de emisión de luz. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: Imagen de la capa de neuronas piramidales V YFP. Amplio campo de visión de imágenes con la microprism revela una gran población de cuerpos de las células piramidales ~ 800 a 900 m de profundidad desde la superficie cortical. Además, las dendritas apical se extiende hacia la capa I también se puede resolver. Barra de escala = 200 micras. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3: Un objetivo mayor apertura numérica que se utiliza en conjunción con el microprismas ofrece una resolución espacial suficiente para resolver las espinas dendríticas en las dendritas apicales en la capa V neuronas piramidales. Barra de escala = 10 micras. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4: Una imagen obtenida con el microprism y una inyección de cola vena de un colorante fluorescente. La imagen muestra los vasos vertical, de gran calibre que se extiende desde las regiones profundas del cerebro y pequeños capilares se desvía a través del volumen cortical. Barra de escala = 200 micras. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5: El uso de un objetivo de mayor apertura numérica, la red de capilares en la neocorteza se pueden crear imágenes con mayor detalle. Barra de escala = 50 micras. <img src="/files/ftp_upload/1509/1509fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6: microprismas también permite que las células de imágenes rojos (GR) que fluye por los vasos. Los glóbulos rojos no absorben el colorante fluorescente y por lo tanto se ven como rayas oscuras en todo el buque. Por línea de exploración a través de la nave, se pueden obtener mediciones de flujo de glóbulos rojos y la velocidad. Barra de escala = 10 micras (barra horizontal en la imagen superior e inferior) y 250 ms (barra vertical en la imagen inferior).

<ol><li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed Eng Online. 2, 13-13 (2003).</li>
<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-41 (2000).</li>
<li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15741-15741 (1998).</li>
</ol>

Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por IACUC la Universidad de Yale.

El uso de un microprism en un experimento de imágenes es relativamente sencillo y ofrece muchas ventajas para los estudios in vivo en el neocórtex. Ejemplos representativos de esta técnica incluyen imágenes tomadas de ratones transgénicos que expresan la proteína amarilla fluorescente en la capa de neuronas corticales V. Usando microprismas se puede ver una colección de grandes cuerpos de las células piramidales de la capa V, cerca de 1 mm por debajo de la superficie cortical. También se ve son las dendritas apicales qu...

<table><tbody><tr><td>Con recubrimiento reflectante de plata mejorada-(R77)</td><td>OptoSigma Corp. (Santa Ana, CA)</td><td>055-0010</td><td>Con recubrimiento reflectante de plata mejorada-(R77)</td></tr><tr><td>Dextrano-fluoresceína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD70</td><td>70 kDa </td></tr><tr><td>Objetivo seco de 4x, 0,28 NA</td><td>Olympus Corporation</td><td>XLFLUOR 4x/340</td><td></td></tr><tr><td>Objetivo seco de 40x, 0,60 NA</td><td>Olympus Corporation</td><td>LUCPLFLN</td><td>Con corrección para cubreobjetos de 0-2 mm</td></tr></tbody></table>

imágenes in vivo de deep capas corticales con un microprisma

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Se presenta un protocolo de imágenes in vivo del tejido cortical mediante una sonda de imagen cerebral profunda en la forma de un microprism. Microprismas son de 1 mm de tamaño y tienen una capa reflectante de la hipotenusa para que la reflexión interna de la excitación y de emisión de luz. La sonda microprism simultáneamente múltiples imágenes de las capas corticales con una perspectiva general, visto sólo en los preparativos de división. Las imágenes se recogieron con un gran campo de visión (~ 900 m). Además, se proporcionan detalles sobre el procedimiento quirúrgico no la supervivencia y la configuración del microscopio. Los resultados representativos incluyen imágenes de la capa V neuronas piramidales de Thy-1-H YFP ratones que muestran sus dendritas apicales se extiende a través de la capa cortical superficial y se extiende a mechones. Resolución fue suficiente para las espinas dendríticas de imágenes cerca de la soma de la capa de neuronas V. Una inyección de cola vena de un colorante fluorescente revela la intrincada red de vasos sanguíneos en la corteza. De exploración lineal de los glóbulos rojos (GR) que fluye a través de los capilares revela la velocidad de glóbulos rojos y las tasas de flujo se pueden obtener. Esta sonda microprism novela es un método elegante, el nuevo y potente de visualizar profundidad las estructuras celulares y la función cortical en vivo.

En ángulo recto microprismas insertado en la corteza cerebral del ratón permite obtener imágenes profundas de múltiples capas corticales con un punto de vista típicamente se encuentran en el segmento. De un milímetro microprismas ofrecen un campo de visión amplio (~ 900 m) y resolución espacial suficiente para resolver las espinas dendríticas. Demostramos capa de imagen V neuronal y vascular mediante imágenes neocortical microprismas.

Imágenes in vivo de Deep capas corticales con un microprisma

Presentamos un protocolo para la obtención de imágenes in vivo de tejido cortical mediante una sonda de imagen cerebral profunda con forma de microprisma. Los microprismas tienen un tamaño de 1 mm...

Las técnicas de microscopía de fluorescencia tienen una capacidad limitada para obtener imágenes de estructuras profundas dentro del tejido, especialmente en materiales con alta dispersión de la luz, como el tejido cerebral. Incluso en el caso de la microscopía de dos fotones, puede ser muy difícil producir imágenes in vivo de alta calidad de estructuras neuronales que se encuentren a más de 500 micrómetros de profundidad desde la superficie del neocórtex. Aquí, la línea verde indica una profundidad de 500 micrómetros.En general, las capas cuatro, cinco y seis de la neocorteza se encuentran a más de 500 micrones de la superficie. Mostraremos cómo un microprisma de vidrio de un milímetro de longitud, insertado en la neocorteza, puede transmitir luz hacia dentro y hacia fuera de las capas corticales superficiales y profundas. Mediante esta técnica en un ratón, es posible obtener un campo de visión de un milímetro y visualizar simultáneamente las seis capas corticales desde una perspectiva de imagenado que normalmente solo se encuentra en tejido cerebral seccionado.Los microprismas ofrecen un amplio campo de visión capaz de visualizar los cuerpos celulares parametales de la capa cinco con sus largas dendritas apicales y la compleja red de vasos sanguíneos en la corteza cerebral, manteniendo al mismo tiempo resoluciones espaciales suficientes para distinguir espinas dendríticas y el flujo de glóbulos rojos a través de microcapilares. Mi nombre es Thomas Chia y soy estudiante de posgrado en el laboratorio del profesor Michael Levine en el Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad de Yale. El protocolo que discutiremos en este video consiste en el uso de microprismas de vidrio de un milímetro con ángulo recto para generar imágenes de fluorescencia de estructuras situadas a un milímetro de profundidad en la corteza cerebral de un ratón.Los microprismas que utilizamos son prismas de un milímetro con ángulo recto, fabricados con vidrio BK7 adquirido de la corporación Opto Sigma. Se manipulan los microprismas con pinzas siempre que sea posible. La hipotenusa del microprisma está recubierta con plata mejorada para proporcionar una reflectividad mayor al 97 % desde 400 hasta 2000 nanómetros.Esto proporciona reflexión interna tanto de la luz de excitación láser como de la fluorescencia admitida. Utilizamos un microscopio personalizado de dos fotones capaz de realizar imágenes en animales pequeños. El animal, unido a un dispositivo estereotáctico, se coloca sobre una plataforma motorizada de tres ejes.El microscopio está conectado a una PC con Windows que ejecuta el software Scan Image. Scan Image es un software de adquisición de imágenes escrito en MATLAB por Polo Gudo et al. Para la imagenología con microprisma, recolectamos imágenes con una resolución de 10 24 por 10 24 o cinco 12 por cinco 12 píxeles.Además, normalmente realizamos el escaneo a dos milisegundos por línea o a cuatro milisegundos por línea. Un aspecto importante de este protocolo es el tipo de objetivos microscópicos utilizados en conjunto con los microprismas. Se utilizan dos tipos de objetivos en los experimentos.El objetivo de la izquierda es un objetivo seco de baja apertura numérica para imágenes con campo amplio, en este caso, un objetivo Olympus de 4x y 0,28 de AN. El objetivo de la derecha es un objetivo seco de alta AN de 40x y 0,60 con un collar de corrección de vidrio capaz de minimizar las aberraciones esféricas inducidas por entre cero y dos milímetros de vidrio. Para preparar al ratón para la cirugía y la inserción del microprisma, el primer paso consiste en anestesiar adecuadamente al animal hasta un nivel adecuado para procedimientos quirúrgicos.Primero, se registra el peso del animal según la dosis establecida. Se aspira un volumen adecuado de una mezcla de ketamina y xilacina en una jeringa. Los fármacos anestésicos se administran mediante una inyección IP utilizando una aguja de calibre 28.Una vez que el ratón alcanza un plano de anestesia adecuado para procedimientos quirúrgicos, se afeita la mayor parte del pelo en la cabeza del animal utilizando una maquinilla con hoja número 40. Luego se aplica nares al pelo restante en la cabeza para ayudar a crear una superficie libre de pelos que puedan interferir con el microprisma. Durante la imagen, después de cinco minutos, se limpia la NA utilizando un hisopo con punta de algodón y se coloca adecuadamente al animal anestesiado en un dispositivo estereotáxico para ratón.Durante los procedimientos quirúrgicos y las sesiones de imagen, el animal se mantiene sobre una almohadilla de calentamiento con agua a 36 grados Celsius. Con la cabeza del animal fijada adecuadamente en su lugar, se realiza una incisión limpia a lo largo de la línea media del cráneo. Para separar la piel, se coloca una pequeña cantidad de peróxido de hidrógeno al 3 % en un aplicador de algodón y se aplica sobre el cráneo para eliminar las membranas situadas entre el cráneo y la piel.El peróxido de hidrógeno también ayuda a revelar el BMA, un punto de referencia importante para saber dónde realizar la craneotomía e insertar el prisma microscópico. Antes de comenzar la craneotomía, se ajustan adecuadamente las barras auriculares y la barra mordaza para inclinar el cráneo expuesto de manera que quede básicamente nivelado con la mesa. Esto proporciona una mejor plataforma para la craneotomía.Se conecta una pequeña fresa dental a una herramienta Dremel para realizar craneotomías. Ajustamos la velocidad a aproximadamente 7.000-10.000 RPM. La fresa dental se desliza sobre el cráneo hasta que se forma un surco cuadrado en el hueso.Los lados del cuadrado tienen aproximadamente de dos a tres milímetros de longitud y están centrados. A 1,5 milímetros de distancia, y a un milímetro lateralmente, continúe adelgazando el hueso hasta crear una pequeña abertura a través del cráneo. Un par de pinzas puede levantar el colgajo óseo.La dura debe ser removida antes de que el microprisma pueda insertarse en la corteza. El sangrado se controla mejor dejando que la sangre se coagule en la superficie durante varios minutos. Posteriormente, la sangre coagulada se elimina utilizando una esponja quirúrgica para ayudar a alinear el prisma con la corteza.La cara vertical del microprisma se alinea paralela a las manijas de la pinza. Con el prisma correctamente sostenido, se inserta completamente el microprisma hasta que la parte superior del prisma queda al ras con la superficie de la neocorteza. Aquí podemos ver el prisma reposando en la neocorteza.Cuando se inserta correctamente, el microprisma debe permanecer en la posición adecuada. Cualquier sangrado resultante es mínimo y puede absorberse con una pequeña esponja quirúrgica. Una vez que el prisma está en su lugar, el animal está listo para la obtención de imágenes.Bajo un objetivo de baja magnificación, se puede observar el barrido láser por rasterizado sobre el microprisma en la superficie del cerebro. A continuación se muestran algunos ejemplos representativos de imágenes obtenidas de ratones transgénicos que expresan la proteína verde fluorescente. En neuronas corticales de la capa cinco utilizando microprismas, se puede observar una agrupación de grandes cuerpos celulares parametales en la capa cinco, casi un milímetro por debajo de la superficie cortical.También se observan las dendritas apicales que se extienden a través de todas las capas superficiales antes de ramificarse en penachos; utilizando un objetivo de alta apertura numérica con el collar de corrección de vidrio, es posible resolver las espinas dendríticas en este caso. En las dendritas apicales de las neuronas parametales de la capa cinco, las espinas dendríticas son estructuras submicrónicas y varias se identifican en la imagen mediante puntas de flecha amarillas. Asimismo, se pueden marcar los vasos sanguíneos corticales con un colorante fluorescente, como el dextrano marcado con fluoresceína, empleando técnicas establecidas de inyección en la vena de la cola.Mediante esta técnica, se pueden observar los vasos de mayor calibre provenientes de capas profundas que se extienden hacia la PIA y se ramifican para formar la red de microcapilares. Esta red delicada de microcapilares en la neocorteza se aprecia mejor utilizando un objetivo de alta apertura numérica. Además, es posible medir la velocidad y el flujo de los glóbulos rojos en capilares neocorticales profundos mediante escaneo lineal.La línea roja indica el patrón de escaneo de línea sobre la imagen del capilar a través del microprisma. Dado que los glóbulos rojos no absorben el colorante fluorescente, aparecerán como trazos oscuros. La imagen inferior es el resultado de un escaneo de línea con una dimensión espacial en un eje y una dimensión temporal en el otro.AEs de este dispositivo se puede calcular el flujo y la velocidad de los glóbulos rojos a través del capilar. Después de que se ha utilizado un microprisma en un animal, puede reutilizarse varias veces. Sin embargo, es necesario limpiarlo adecuadamente para eliminar cualquier material biológico residual.Esto puede lograrse sumergiendo el prisma en un pequeño volumen de ácido clorhídrico, seguido de una inmersión en metanol. El microprisma limpio puede entonces envolverse en papel para lentes hasta su uso posterior. Esto concluye nuestro protocolo sobre el uso de microprismas para imágenes corticales in vivo en ratones.El uso de microprismas en un experimento de obtención de imágenes es relativamente sencillo y ofrece muchas ventajas en estudios in vivo sobre la neocorteza. Esperamos que hayan encontrado esta técnica interesante y que puedan utilizarla en su laboratorio en el futuro. Gracias por ver este video y mucha suerte.

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Investigación

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