Imágenes in vivo de Deep capas corticales con un microprisma

En ángulo recto microprismas insertado en la corteza cerebral del ratón permite obtener imágenes profundas de múltiples capas corticales con un punto de vista típicamente se encuentran en el segmento. De un milímetro microprismas ofrecen un campo de visión amplio (~ 900 m) y resolución espacial suficiente para resolver las espinas dendríticas. Demostramos capa de imagen V neuronal y vascular mediante imágenes neocortical microprismas.

Las técnicas de microscopía de fluorescencia tienen una capacidad limitada para obtener imágenes de estructuras profundas dentro del tejido, especialmente en materiales altamente dispersos de luz, como el tejido cerebral. Incluso en el caso de la microscopía de dos fotones, puede ser muy difícil producir imágenes in vivo de alta calidad de estructuras neuronales que están a más de 500 micras de la superficie neocortical. Aquí, la línea verde indica una profundidad de 500 micras.

En general, las capas neocorticales cuatro, cinco y seis están a más de 500 micras de la superficie. Mostraremos cómo un microprisma de vidrio de un milímetro insertado en el neocórtex puede transmitir luz dentro y fuera de las capas corticales superficiales y profundas. Usando esta técnica en un ratón, es posible tener un campo de visión de un milímetro y visualizar las seis capas corticales simultáneamente en una perspectiva de imagen, que generalmente se encuentra solo en el tejido cerebral cortado.

Los microprismas ofrecen un amplio campo de visión capaz de visualizar los cuerpos celulares parametálicos de la capa cinco con sus largas dendritas apicales y la compleja red de vasos sanguíneos en el neocórtex, al tiempo que mantienen resoluciones espaciales capaces de resolver las espinas dendríticas y el flujo de glóbulos rojos a través de los microcapilares. Mi nombre es Thomas Chia y soy estudiante de posgrado en el laboratorio del profesor Michael Levine en el Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad de Yale. El protocolo que discutiremos en este video será sobre cómo usar micro prismas de vidrio de ángulo recto de un milímetro para generar imágenes de fluorescencia de estructuras de un milímetro de profundidad en un neocórtex de ratón.

Los micro prismas que utilizamos son prismas de ángulo recto de un milímetro hechos de vidrio BK seven comprado a Opto Sigma Corporation. Los microprismas se manipulan con pinzas siempre que sea posible. La hipotenusa del microprisma está recubierta con plata mejorada para proporcionar una reflectividad superior al 97% de 400 a 2000 nanómetros.

Esto proporciona una reflexión interna tanto de la luz de excitación del láser como de la fluorescencia admitida. Utilizamos un microscopio de dos fotones hecho a medida capaz de obtener imágenes de animales pequeños. El animal conectado a un dispositivo estereotáctico se coloca en una plataforma motorizada de tres ejes.

El microscopio está conectado a un PC con Windows que ejecuta la imagen de escaneo. Software scan image es un software de adquisición de imágenes escrito en MATLAB por Polo Gudo, et al. Para la obtención de imágenes de microprismas, recolectamos imágenes con una resolución de 10 24 por 10 24 o cinco de 12 por cinco 12 píxeles.

Además, normalmente escaneamos a dos milisegundos por línea o cuatro milisegundos por línea. Un aspecto importante de este protocolo es el tipo de objetivos de microscopio utilizados junto con los microprismas. En los experimentos se utilizan dos tipos de objetivos.

El objetivo de la izquierda es un objetivo aéreo de baja apertura numérica para imágenes de amplios campos de visión, en este caso, un objetivo Olympus de cuatro x 0,28 NA. El objetivo de la derecha es un objetivo de aire NA de 40 x 0,60 de altura con un collar corrector de vidrio capaz de minimizar las aberraciones esféricas inducidas por cero a dos milímetros de vidrio. Con el fin de preparar al ratón para la cirugía y la inserción del microprisma, el primer paso es anestesiar adecuadamente al animal a un nivel adecuado para procedimientos quirúrgicos.

En primer lugar, se registra el peso del animal en función de la dosis establecida. Un volumen apropiado de un cóctel de ketamina y xilacina se introduce en una jeringa. Los fármacos anestésicos se administran a través de una inyección IP con una aguja de calibre 28.

Una vez que el ratón está en un plano de anestesia adecuado para procedimientos quirúrgicos, la mayor parte del pelo de la cabeza del animal se afeita mediante un temblor con una cuchilla número 40. A continuación, se aplica una capa a los pelos restantes de la cabeza para ayudar a crear una superficie libre de pelos que puedan interponerse en el camino del microprisma. Durante la toma de imágenes, después de cinco minutos, el NA se limpia con un hisopo con punta de algodón, el animal anestesiado se coloca correctamente en un dispositivo estereotáctico de ratón.

Durante los procedimientos quirúrgicos y las sesiones de imagen, el animal se mantiene en una almohadilla térmica llena de agua a 36 grados centígrados. Con la cabeza del animal correctamente fijada en su lugar, se hace una incisión limpia a lo largo de la línea medial del cráneo. Para separar la piel, se coloca una pequeña cantidad de peróxido de hidrógeno al 3% en un hisopo con punta de algodón y se aplica sobre el cráneo para eliminar las membranas entre el cráneo y la piel.

El peróxido de hidrógeno también ayuda a revelar BMA, un hito importante para saber dónde realizar la craneotomía e insertar el microprisma. Antes de comenzar la craneotomía, las barras de las orejas y la barra de mordida se ajustan correctamente para inclinar el cráneo expuesto de manera que esté básicamente al nivel de la mesa. Esto proporciona una mejor plataforma para la craneotomía.

Una pequeña fresa dental se conecta a una herramienta Dremel para craneotomías. Establecemos la velocidad de aproximadamente 7,000 a 10,000 RPM. La fresa dental se desliza a lo largo del cráneo hasta que se establece un surco cuadrado en el hueso.

Los lados del cuadrado miden aproximadamente dos o tres milímetros de largo y están centrados, 1,5 milímetros mimosos y un milímetro lateral continúan adelgazando el hueso hasta que se hace una pequeña abertura a través del cráneo. Un par de pinzas pueden levantar el colgajo óseo.

La duramadre debe ser removida antes de que el micro prisma pueda ser insertado en la corteza. El sangrado se controla mejor dejando que la sangre se coagule en la superficie durante varios minutos. Posteriormente, la sangre coagulada se extrae con una esponja quirúrgica para ayudar a la alineación del prisma con la corteza.

La cara vertical del microprisma está alineada paralelamente a las manijas de las pinzas. Con el prisma correctamente sujeto, se inserta todo el microprisma hasta que la parte superior del prisma queda al ras de la superficie neocortical. Aquí podemos ver el prisma descansando en el neocórtex.

Cuando se inserta correctamente, el microprisma debe permanecer en la posición correcta. Cualquier sangrado que resulte es mínimo y se puede absorber con una pequeña esponja quirúrgica. Una vez que el prisma está en su lugar, el animal está listo para tomar imágenes con el animal.

Bajo un objetivo de bajo aumento, se puede ver el escaneo de trama láser sobre el micro prisma en la superficie del cerebro. A continuación se presentan algunos ejemplos representativos de imágenes tomadas de ratones transgénicos que expresan proteína fluorescente amarilla. En las neuronas corticales de la capa cinco, utilizando microprismas, se puede ver una colección de grandes cuerpos celulares parametálicos en la capa cinco, casi un milímetro por debajo de la superficie cortical.

También se ven las dendritas apicales que se extienden a través de todas las capas superficiales antes de divergir en Tufts utilizando un objetivo de apertura numérica alta con el collar de corrección de vidrio, es posible resolver las espinas dendríticas en este caso. En las dendritas apicales de las neuronas parametálicas de la capa cinco, las espinas dendríticas son estructuras submicrónicas y varias se identifican en la imagen utilizando puntas de flecha amarillas. También se pueden marcar los vasos sanguíneos corticales con un tinte fluorescente, como la fluoresceína dextrano, utilizando técnicas de inyección de venas de cola establecidas.

Con esta técnica, se pueden ver los vasos de mayor calibre desde capas profundas que se extienden hacia el PIA y se ramifican para formar la red de microcapilares. Esta delicada red de microcapilares en el neocórtex se aprecia mejor utilizando un objetivo de apertura numérica alta. Además, es posible medir la velocidad y el flujo de los glóbulos rojos de los capilares neocorticales profundos mediante escaneo lineal.

La línea roja indica el patrón de escaneo de líneas en la imagen capilar a través del microprisma. Dado que los glóbulos rojos no absorben el tinte fluorescente, aparecerán como rayas oscuras. La imagen de la parte inferior es el resultado de un escaneo lineal con una dimensión espacial en un AE y una dimensión temporal en el otro.

A partir de este se puede calcular el flujo y la velocidad de los glóbulos rojos a través del capilar. Después de que se ha utilizado un microprisma en un animal, se puede reutilizar varias veces. Sin embargo, es necesario limpiarlo adecuadamente para eliminar cualquier material biológico restante.

Esto se puede lograr sumergiendo el prisma en un pequeño volumen de ácido clorhídrico, seguido de una inmersión en metanol. A continuación, el microprisma limpio se puede envolver en papel para lentes hasta el uso de la función. Con esto concluye nuestro protocolo sobre el uso de microprismas para la obtención de imágenes corticales in vivo en ratones.

El uso de microprismas en un experimento de imagen es relativamente sencillo y ofrece muchas ventajas cuando se trata de estudios in vivo en el neocórtex. Esperamos que haya encontrado esta técnica interesante y que pueda utilizar en su laboratorio en el futuro. Gracias por mirar y buena suerte.