Una evaluación cuantitativa de la Lipidome levadura utilizando la espectrometría de masas de ionización por electrospray
21 de agosto de 2009
Se describe un nuevo método cuantitativo para la identificación de lipidómica numerosas especies de lípidos en la levadura con la encuesta de exploración de ionización electrospray espectrometría de masas (ESI / MS). Este método supera actualmente los métodos disponibles para la identificación y cuantificación de los lípidos en la capacidad de resolver diferentes formas moleculares de los lípidos, la sensibilidad y la velocidad.
Este protocolo permite analizar rápidamente los principales componentes de la levadura lipídica. Comienza cosechando y lavando las células de levadura. Las células lavadas se colocan en una mezcla de cloroformo y metanol de uno a dos y se lisan con perlas de vidrio.
La adición de cloroformo y agua separa las dos fases. La fase orgánica se recoge, se seca y la película lipídica se disuelve en cloroformo para su almacenamiento antes de la espectroscopia de masas. Los lípidos extraídos se diluyen en cloroformo y metanol con hidróxido de amonio y se añade una mezcla de patrones internos.
La solución lipídica ahora se puede inyectar directamente en el espectrómetro de masas. Hola, soy Simon Bork y trabajo del laboratorio de Vladimir Teco en el Departamento de Biología de la Universidad de Concordia. Hoy os voy a enseñar un método para cuantificar los lípidos de las levaduras mediante espectroscopia de masas.
Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar los cambios de los lípidos de la levadura en diferentes condiciones de crecimiento. Así que comencemos. Para comenzar este procedimiento, suspenda los gránulos de levadura congelada previamente preparados en 1,6 mililitros de hielo, agua destilada fría y transfiera 1,6 mililitros de la suspensión celular a tubos de centrífuga de vidrio de alta velocidad.
Tenga en cuenta que a lo largo de este procedimiento, todas las manipulaciones con lípidos extraídos se realizan utilizando pipetas de vidrio o jeringas. Dado que los plásticos crearán una gran señal de fondo, si entran en contacto con el cloroformo, comience la extracción de lípidos agregando seis mililitros de una mezcla de metanol de cloroformo en una proporción de uno a dos y 0,8 mililitros de perlas de vidrio medidas en un tubo de einor a la suspensión celular. Los volúmenes exactos no son críticos siempre que se mantenga la proporción de uno a dos a 0,8 para el cloroformo, el metanol y la levadura suspendida en agua. Vórtice.
La suspensión celular y las perlas de vidrio se mezclan dos veces durante un minuto cada vez, continúe agregando dos mililitros de cloroformo y mezcle suavemente, luego incube durante cinco minutos a temperatura ambiente con mezclas ocasionales. Después de los cinco minutos de incubación, agregue dos mililitros de agua destilada y mezcle suavemente. Por otra parte, incube durante cinco minutos a temperatura ambiente con mezclas ocasionales.
También en este caso, es más importante mantener la proporción de dos a dos a 1,8 para el cloroformo, el metanol y el agua en lugar de un volumen específico. Cuando se complete la segunda incubación. Centrifugar durante cinco minutos a 3000 Gs a temperatura ambiente, recoger todo el sobrenadante de esta primera extracción en un nuevo tubo de centrífuga de vidrio de alta velocidad y añadir 3,2 mililitros de cloroformo a los gránulos de células restantes para una segunda extracción de lípidos.
Agite los gránulos de la célula con el cloroformo agregado dos veces durante un minuto cada vez. Luego centrifugar durante cinco minutos a 3000 Gs A temperatura ambiente, agregue el sobrenadante de esta segunda extracción al sobrenadante recolectado después de la primera extracción. A continuación, centrifugar los sobrenadantes recogidos durante cinco minutos.
A 3000 Gs a temperatura ambiente, los lípidos extraídos se disuelven ahora en la fase orgánica inferior. Deseche la fase acuosa superior y transfiera la fase inferior a un nuevo tubo de centrífuga de vidrio de alta velocidad. Para producir espectros más limpios en la centrífuga del espectrómetro de masas, la fase orgánica durante cinco minutos a 3000 Gs a temperatura ambiente y para transferir todo el sobrenadante a un vial de vidrio.
Secar los lípidos disueltos bajo nitrógeno, disolver la película lipídica seca en 500 microlitros de cloroformo y almacenar a menos 20 grados centígrados hasta que esté listo para analizar las muestras por espectrometría de masas. Comience por preparar una mezcla estándar de los lípidos en el cloroformo como se enumera en la tabla uno que se encuentra en el protocolo escrito adjunto. Cada lípido representa una clase diferente.
Esta solución puede almacenarse a menos 20 grados centígrados para su uso posterior antes de la inyección de los lípidos extraídos en el espectrómetro de masas. Se combinaron 10 microlitros de la muestra con 10 microlitros de la mezcla estándar de lípidos. Tenga en cuenta que la relación entre el estándar y la muestra se puede cambiar según sea necesario.
Resuelva la muestra y la mezcla de lípidos estándar utilizando un espectrómetro de dos masas de micro masa Q a F, equipado con una fuente de nano electrospray que funciona a un caudal de un microlitro por minuto. Los ajustes se detallan en la tabla dos del protocolo escrito adjunto. Aunque el uso de la alta resolución de un espectrómetro de masas Q a F es ventajoso, no es un requisito obligatorio.
Los parámetros exactos del instrumento variarán entre los espectrómetros de masas. Después de la adquisición de datos, los espectros de masas se suavizan, el fondo se resta y los picos se centran. Finalmente, exporte la lista de picos a Excel.
A continuación, normalice los picos de cada vidrio lipídico a su estándar interno. Dependiendo de la aplicación, puede ser necesario realizar un procesamiento posterior adicional, como el deisótopo y la deconvolución. Este método permite la determinación rápida y en profundidad de los principales componentes de la levadura lipídica.
Aquí hemos destacado un lípido, que ha sido desisótopo de enrevesado y normalizado a su patrón interno. Acabamos de mostrarle cómo aislar los lípidos de la levadura y cómo determinar el lípido de la levadura mediante espectroscopía de masas de ionización con pantalla eléctrica. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que debe evitar el uso de plásticos y mantener su muestra en el rango lineal de concentraciones.
Este método es bastante flexible y en muchos de los volúmenes se puede cambiar según sea necesario. Este protocolo de extracción también es adecuado para otros métodos de análisis de lípidos, como la cromatografía en capa fina y la espectroscopia de masas multidimensional. Así que eso es todo.
Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.
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Visión general
Este artículo presenta un método cuantitativo de lipidómica novedoso para identificar varias especies de lípidos en levaduras utilizando espectrometría de masas con ionización por electrospray de barrido (ESI/MS). Este método mejora significativamente las técnicas existentes en términos de identificación de lípidos, cuantificación, sensibilidad y velocidad.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Lipidómica
- Espectrometría de masas
- Biología de la levadura
Fundamentos
- La lipidómica es crucial para entender las funciones celulares.
- Los métodos tradicionales para el análisis de lípidos tienen limitaciones en sensibilidad y resolución.
- El ESI/MS de barrido ofrece una alternativa prometedora.
- Este estudio tiene como objetivo mejorar la identificación y cuantificación de lípidos en levaduras.
Propósito del estudio
- Desarrollar un método rápido y eficiente para el análisis de lípidos.
- Mejorar la resolución de la identificación de especies de lípidos.
- Aumentar la sensibilidad de la cuantificación de lípidos.
Métodos utilizados
- Recolección y lavado de células de levadura.
- Lisi de células utilizando cuentas de vidrio en una mezcla de cloroformo y metanol.
- Separación de fases de lípidos utilizando cloroformo y agua.
- Preparación de muestras de lípidos para el análisis por espectrometría de masas.
Resultados principales
- El nuevo método permite la identificación de numerosas especies de lípidos.
- Demuestra una sensibilidad superior en comparación con las técnicas existentes.
- La velocidad del análisis se mejora significativamente.
Conclusiones
- Este método representa un avance significativo en la lipidómica.
- Puede aplicarse a varias áreas de investigación que involucren el análisis de lípidos.
- Estudios futuros pueden expandir su aplicación a otros organismos.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Quantitative lipidomics using electrospray ionization mass spectrometry (ESI/MS) enables rapid, high-sensitivity profiling of yeast lipidomes, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. This workflow accelerates lipid identification and quantification, providing robust data for pathway interrogation and functional studies. The approach is directly relevant for biopharma teams seeking scalable, reproducible lipidomic analyses to inform discovery-stage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables comprehensive profiling of lipid species to clarify metabolic pathways.
- Supports functional validation of lipid-related targets in genetically tractable yeast models.
- Facilitates mechanistic de-risking by quantifying lipid changes under different conditions.
- Provides quantitative data to inform go/no-go decisions in target selection.
Screening & Assay Development
- Delivers validated, reproducible lipid quantification suitable for assay standardization.
- Reduces sample preparation time by eliminating chromatographic separation steps.
- Supports high-throughput screening readiness with rapid sample analysis.
- Enables reliable comparison of compound effects on lipid profiles.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant lipidomic studies by enabling organelle-specific lipid analysis.
- Provides continuity from yeast model findings to higher eukaryotic systems.
- Supports risk-adjusted advancement by quantifying lipid biomarkers.
- Enhances predictive confidence in translational lipid biology research.
Pipeline & Workflow Integration
This ESI/MS lipidomics method fits from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis-driven and screening workflows.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification via quantitative lipid profiling.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible lipid measurements for compound evaluation.
- Analytics: Generates normalized, quantitative outputs for robust statistical comparison.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and preclinical continuity when extending findings beyond yeast.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, scalable platform adaptable to various lipidomic research needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in lipid biology.
- Operational Value: Streamlines workflows with rapid, standardized sample processing and analysis.
- Strategic Value: Improves decision-making efficiency and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of lipid-targeted programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mass spectrometry and lipid extraction protocols.
- Needs access to high-resolution mass spectrometry instrumentation and analytical software.
- Demands strict standardization of sample handling to ensure reproducibility.
- Adaptable to other model systems with protocol optimization.
- Plasticware must be avoided to prevent background signal interference.
