Name: Una evaluación cuantitativa de la Lipidome levadura utilizando la espectrometría de masas de ionización por electrospray (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-21T12:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Aprende un método de lipidómica cuantitativa para identificar lípidos en levadura mediante espectrometría de masas ESI/MS. Esta técnica mejora la sensibilidad, velocidad y resolución en el análisis de especies lipídicas celulares.

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Damos las gracias a Alain Tessier de valiosos consejos, discusiones, y soporte técnico. Reconocemos el Centro de Aplicaciones Biológicas de la Espectrometría de Masas en la Universidad Concordia por servicios distinguidos. Este trabajo fue apoyado por becas de los CIHR y NSERC de Canadá. VIT es un investigador de Nueva CIHR y Concordia Cátedra de Investigación de la Universidad de genómica, biología celular y el envejecimiento.

Materiales y métodos <ol><li> Cepas de levadura y las condiciones de crecimiento La cepa de tipo salvaje BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0) fue cultivada en medio rico en YEPD (1% extracto de levadura, 2% de peptona, 2% de glucosa). Las células fueron cultivadas a 30 ° C con rotación agitación a 200 rpm en frascos de Erlenmeyer en un &quot;frasco de volumen / volumen medio de&quot; proporción de 5:1. </li><li> Almacenamiento de las células de levadura para la extracción de lípidos <ol><li> Un cultivo de 50 ml de células se recogieron por centrifugación a 3000 xg durante 5 minutos. </li><li> Lavaron dos veces con agua fría. <ol style=" list-style-type:lower-alpha;"><li> Resuspender el pellet en 25 ml de agua con hielo frío </li><li> Pellet células de centrifugar a 3000 xg durante 5 minutos </li></ol></li><li> Resuspender el precipitado y traslado al tubo eppendorf </li><li> Pellet por centrifugación, 16.000 xg durante 2 minutos, retire el sobrenadante y congelar a -80 ° C hasta su uso. (Se utiliza un vaso de alcohol isopropílico en el congelador -80, nitrógeno líquido también se puede utilizar) </li></ol></li><li> Reactivos Cloroformo y metanol grado de biotecnología fueron de Sigma-Aldrich. Los ácidos grasos libres y triglicéridos fueron adquiridos de Larodan (Malmö, Suecia). Varias especies de fosfolípidos - incluyendo fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, fosfatidilserina, ácido fosfatídico, y cardiolipinas - se obtuvieron a partir de lípidos Avanti Polar (Alabaster, AL, EE.UU.). De alta velocidad tubos de centrífuga de vidrio con tapas de teflón eran de Fisher. </li></ol> Extracción de lípidos Esta es una modificación del protocolo descrito por Bligh y Dyer 8. Todas las manipulaciones con lípidos extraídos se debe hacer uso de pipetas de vidrio o las jeringas, los plásticos, se creará una gran señal de fondo, si entran en contacto con cloroformo. Los volúmenes exactos no son críticos, siempre y cuando las razones de 1:2:0.8 de cloroformo - metanol - H 2 O en el paso 3 y 2:2:1.8 de cloroformo - metanol - H 2 O en el paso 7 se conservan. <ol><li> Resuspender las células congeladas en 1,6 ml de helado destilada H 2 O. </li><li> La transferencia de 1,6 ml de la suspensión celular a alta velocidad centrífuga de tubos de vidrio. </li><li> Agregar 6 ml de cloroformo y metanol (1:2) y mezclar 0,8 ml de perlas de vidrio a la suspensión celular. </li><li> Vortex la suspensión celular con cuentas de vidrio dos veces durante 1 min. </li><li> Añadir 2 ml de cloroformo y mezclar suavemente. </li><li> Incubar durante 5 min a temperatura ambiente con mezcla ocasional. </li><li> Añadir 2 ml de H 2 O destilada y mezclar suavemente. </li><li> Incubar durante 5 min a temperatura ambiente con mezcla ocasional. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 3000 xg a temperatura ambiente. </li><li> Recoger la fase líquida entera en una nueva de alta velocidad tubo de centrífuga de vidrio. </li><li> Añadir 3,2 ml de cloroformo a los gránulos de las células desde el paso 9. </li><li> Vortex dos veces durante 1 min. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 3000 xg a temperatura ambiente. </li><li> Añadir el sobrenadante a la fase líquida a partir del paso 10. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 3000 xg a temperatura ambiente. </li><li> Deseche la parte superior (acuosa) y la fase de transferencia de la parte inferior (fase orgánica), en una nueva de alta velocidad tubo de centrífuga de vidrio. </li><li> Centrifugar durante 5 minutos a 3000 xg a temperatura ambiente. </li><li> Transferir el sobrenadante todo en un frasco de vidrio y en atmósfera de nitrógeno seco. </li><li> Disolver la película de lípidos en 500 l de cloroformo y almacenar a -20 ° C. </li></ol> El análisis de los lípidos por espectrometría de masas Una mezcla de valores de las normas de lípidos en cloroformo deben estar preparados de antemano según la Tabla 1, así como una solución de metanol - cloroformo (1:1) con el 0,1% (v / v) de hidróxido de amonio. <ol><li> Antes de la inyección, se combinan 10 l de una muestra con 10 l de la mezcla estándar de los lípidos en la Tabla 1. En 200μL de 1:1 cloroformo: metanol con 0,1% de NH 4 OH. <ul><li> El estándar de proporción de la muestra se puede cambiar según sea necesario. </li></ul></li><li> Resolver los lípidos con un Micromass Q-TOF 2 espectrómetro de masas equipados con un operativo de código nano-electrospray con un caudal de 1 l / min. <ul><li> Parámetros exactos de instrumentos varían de un instrumento a otro. Ver Tabla 2 para la configuración de un Micromass Q-TOF 2 (Waters, Milford, MA, EE.UU.) equipado con una fuente nano-electrospray. A pesar de que han tomado ventaja de la alta resolución de un tipo Q-TOF de espectrómetro de masas, no es un requisito obligatorio. </li></ul></li><li> Después de la adquisición de los espectros de masas se suavizan, resta fondo y centrado, a continuación, la lista de pico exportados a Excel. Los picos de cada clase de lípidos se normalizan a su estándar interno. Dependiendo de la aplicación, puede ser necesario realice más de post-procesamiento, tales como deisotoping y deconvolución. </li></ol> Normas de la Tabla 1. Internos de lípidos, su concentración enla mezcla estándar y el modo de MS para su análisis. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Lípidos clase </td><td> Composición estándar de la cadena </td><td> La masa del patrón </td><td> Concentración (mg / ml) </td><td> MS modo </td></tr><tr><td> Ácido fosfatídico </td><td> 14:0 / 14:0 </td><td> 591,40 </td><td> 100 </td><td> Negativo </td></tr><tr><td> Fosfatidiletanolamina </td><td> 14:0 / 14:0 </td><td> 634,45 </td><td> 200 </td><td> Negativo </td></tr><tr><td> Fosfatidilinositol </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> Negativo </td></tr><tr><td> Fosfatidilserina </td><td> 14:0 / 14:0 </td><td> 622,37 </td><td> 40 </td><td> Negativo </td></tr><tr><td> Cardiolipina </td><td> 4x14: 0 </td><td> 619,92 </td><td> 100 </td><td> Negativo </td></tr><tr><td> Los ácidos grasos libres </td><td> 19:00 </td><td> 297,28 </td><td> 100 </td><td> Negativo </td></tr><tr><td> Fosfatidilcolina </td><td> 14:0 / 14:0 </td><td> 650,48 </td><td> 100 </td><td> Positiva </td></tr><tr><td> Triacilgliceroles </td><td> 13:0 / 13:0 / 13:0 </td><td> 698,63 </td><td> 200 </td><td> Positiva </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Ajuste del equipo para un Micromass Q-TOF 2 (Waters, Milford, MA, EE.UU.) equipado con una fuente nano-electrospray. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td></td><td> Caudal </td><td> Cono de tensión </td><td> Tensión capilar </td><td> Colisión de gas </td></tr><tr><td> Modo positivo </td><td> 1μl/min </td><td> -28 V </td><td> 3.0 kv </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Modo negativo </td><td> 1μl/min </td><td> 30 v </td><td> -3,2 Kv </td><td> 10 </td></tr></tbody></table>

<ol><li>Cao, H., Gerhold, K., Mayers, J. R., Wiest, M. M., Watkins, S. M., Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+lipokine%2C+a+lipid+hormone+linking+adipose+tissue+to+systemic+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a lipokine, a lipid hormone linking adipose tissue to systemic metabolism.</a> Cell. 134, 933-944 (2008).</li>
<li>Claypool, S. M., Oktay, Y., Boontheung, P., Loo, J. A., Koehler, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiolipin+defines+the+interactome+of+the+major+ADP%2FATP+carrier+protein+of+the+mitochondrial+inner+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cardiolipin defines the interactome of the major ADP/ATP carrier protein of the mitochondrial inner membrane.</a> J. Cell Biol. 182, 937-950 (2008).</li>
<li>Guo, T., Gregg, C., Boukh-Viner, T., Kyryakov, P., Goldberg, A., Bourque, S., Banu, F., Haile, S., Milijevic, S., San, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+signal+from+inside+the+peroxisome+initiates+its+division+by+promoting+the+remodeling+of+the+peroxisomal+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A signal from inside the peroxisome initiates its division by promoting the remodeling of the peroxisomal membrane.</a> J. Cell Biol. 177, 289-303 (2007).</li>
<li>Russell, S. J., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+regulation+of+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endocrine regulation of ageing.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 681-691 (2007).</li>
<li>Czabany, T., Athenstaedt, K., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+storage+and+degradation+of+neutral+lipids+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Synthesis, storage and degradation of neutral lipids in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1771, 299-309 (2007).</li>
<li>Br&uuml, gger, Erben, B., Sandhoff, G., Wieland, R., &amp, F. T., Lehmann, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+biological+membrane+lipids+at+the+low+picomole+level+by+nano-electrospray+ionization+tandem+mass+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of biological membrane lipids at the low picomole level by nano-electrospray ionization tandem mass spectroscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94, 2339-2344 (1997).</li>
<li>Schneiter, R., Brügger, B., Sandhoff, R., Zellnig, G., Leber, A., Lampl, M., Athenstaedt, K., Hrastnik, C., Eder, S., Daum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry+%28ESI-MS%2FMS%29+analysis+of+the+lipid+molecular+species+composition+of+yeast+subcellular+membranes+reveals+acyl+chain-based+sorting%2Fremodeling+of+distinct+molecular+species+en+route+to+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) analysis of the lipid molecular species composition of yeast subcellular membranes reveals acyl chain-based sorting/remodeling of distinct molecular species en route to the plasma membrane.</a> J. Cell Biol. 146, 741-754 (1999).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).</li>
</ol>

Este método permite una rápida evaluación cuantitativa de la lipidome levadura utilizando fácilmente disponibles, materiales de bajo costo. El método permite la identificación de la mayoría de las especies de lípidos en las células de levadura con la excepción de diacilgliceroles, ergosterols y ésteres ergosteryl, a pesar de estos lípidos pueden ser identificados mediante la sustitución de hidróxido de amonio con hidróxido de litio. El método descrito permite la identificación y cuantificación de los lípidos en las conc...

una evaluación cuantitativa de la lipidome levadura utilizando la espectrometría de masas de ionización por electrospray

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Los lípidos son una de las principales clases de biomoléculas y desempeñan funciones importantes en la dinámica de la membrana, el almacenamiento de energía, y la señalización<sup&gt; 4.1</sup&gt;. La levadura en ciernes<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;, Una genéticamente y bioquímicamente eucariotas unicelulares manipulable con genoma anotado lipidome y muy simple, es un valioso modelo para el estudio de las funciones biológicas de las especies de lípidos en diversos eucariotas multicelulares<sup&gt; 2,3,5</sup&gt;.<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Cuenta con 10 principales clases de lípidos con longitudes de cadena, principalmente de 16 o 18 átomos de carbono y cero o un grado de insaturación<sup&gt; 6,7</sup&gt;. Los métodos existentes para la identificación y cuantificación de los lípidos - tales como la cromatografía líquida de alto rendimiento, cromatografía en capa fina, la microscopía de fluorescencia, y la cromatografía de gases seguida por los Estados miembros - están bien establecidos, pero tienen una baja sensibilidad, no lo suficientemente separadas las diversas formas moleculares de los lípidos, requieren derivatización lípidos antes para el análisis, o puede ser bastante lento. Aquí se presenta una descripción detallada de nuestro enfoque experimental para resolver estas limitaciones inherentes al uso de la encuesta de exploración ESI / MS para la identificación y cuantificación de la dotación completa de los lípidos en las células de levadura. El método descrito no requiere la separación cromatográfica de mezclas de lípidos complejos se recuperó de las células de levadura, por lo tanto acelerar considerablemente el proceso de adquisición de datos. Este método permite la identificación y cuantificación de los lípidos en las concentraciones tan bajas como g / ml y se ha aplicado con éxito para evaluar lipidomes de células de levadura entero y sus orgánulos purificada. Extracción de los lípidos de las células de levadura todo para el uso de este método de análisis de los lípidos lleva de dos a tres horas. Se tarda sólo cinco a diez minutos para ejecutar cada muestra de los lípidos extraídos y desecados en un espectrómetro de masa Q-TOF equipado con una fuente nano-electrospray.

Se describe un nuevo método cuantitativo para la identificación de lipidómica numerosas especies de lípidos en la levadura con la encuesta de exploración de ionización electrospray espectrometría de masas (ESI / MS). Este método supera actualmente los métodos disponibles para la identificación y cuantificación de los lípidos en la capacidad de resolver diferentes formas moleculares de los lípidos, la sensibilidad y la velocidad.

Una evaluación cuantitativa de la Lipidome levadura utilizando la espectrometría de masas de ionización por electrospray

Los lípidos son una de las principales clases de biomoléculas y desempeñan funciones importantes en la dinámica de las membranas, el almacenamiento de energía y la señalización1-4. La levadura en gemación...

Este protocolo permite analizar rápidamente los componentes principales del lípido de levadura. Comienza con la recolección y lavado de las células de levadura. Las células lavadas se colocan en una mezcla de cloroformo y metanol uno a dos, y se lisaron con perlas de vidrio.La adición de cloroformo y agua separa las dos fases. Se recoge la fase orgánica, se seca y luego se disuelve la película lipídica en cloroformo para su almacenamiento antes de la espectrometría de masas. Los lípidos extraídos se diluyen en cloroformo y metanol con hidróxido de amonio, y se añade una mezcla de estándares internos.La solución lipídica ya puede inyectarse directamente en el espectrómetro de masas. Hola, soy Simon Bork del laboratorio de Vladimir Teco en el Departamento de Biología de la Universidad Concordia. Hoy les mostraré un método para cuantificar lípidos de levadura utilizando espectrometría de masas.Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar los cambios en los lípidos de levadura bajo diferentes condiciones de crecimiento. Así que comencemos. Para iniciar este procedimiento, resuspenda los pellet de levadura previamente preparados y congelados en 1,6 mililitros de ag

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Aquí se describe una nueva técnica de proteómica cuantitativa para la identificación de complejos de proteínas en Saccharomyces cerevisiae. En este estudio, hemos utilizado el método de SILAC junto con la purificación de afinidad seguida de espectrometría de masas para identificar con una alta especificidad de la unión de compañeros de una proteína del RE, Scs2p.

Identificación de los complejos de proteínas con la proteómica cuantitativa en S. cerevisiae

Descripción de un procedimiento de fosforilación cuantitativos utilizando cryolysis, solubilziation urea, fraccionamiento HILIC y enriquecimiento IMAC de péptidos fosforilados.

Phosphoproteomics cuantitativo de ácidos grasos estimulada Saccharomyces cerevisiae</em

gotitas de lípidos son orgánulos importantes para la replicación de varios patógenos, incluyendo el virus de la hepatitis C (VHC). Se describe un método para aislar las gotas de lípidos para la espectrometría de masas cuantitativa de proteínas asociadas; se puede utilizar bajo una variedad de condiciones, tales como infección por el virus, el estrés ambiental, o tratamiento con fármacos.

Aislamiento gotas de lípidos para el análisis cuantitativo de Espectrometría de Masas

Aquí, presentamos una implementación de MATLAB de detección automatizada y descripción cuantitativa de gotas de lípidos en imágenes de microscopía de fluorescencia de fission y células de levadura en ciernes.

Análisis del contenido de gotas de lípidos en fesión y levaduras en ciernes mediante el procesamiento automatizado de imágenes

Presentamos un protocolo que utiliza cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en tándem para identificar y cuantificar los principales lípidos celulares en Saccharomyces cerevisiae. El método descrito para una evaluación cuantitativa de las principales clases de lípidos dentro de una célula de levadura es versátil, robusto y sensible.

Análisis cuantitativo del lipidomo celular de Saccharomyces Cerevisiae utilizando cromatografía líquida junto con espectrometría de masas en tándem

Presentamos un protocolo para la identificación y cuantificación de las principales clases de metabolitos solubles en agua en la levadura Saccharomyces cerevisiae. El método descrito es versátil, robusto y sensible. Permite la separación de isómeros estructurales y formas estereoisoméricas de metabolitos solubles en agua entre sí.

Metabolómica cuantitativa de Saccharomyces cerevisiae mediante cromatografía líquida combinada con espectrometría de masas en tándem

Aquí, se presenta un protocolo para el etiquetado metabólico de levaduras con ácido 14C-acético, que se combina con cromatografía de capa delgada para la separación de lípidos neutros.

Análisis de síntesis de lípidos neutros en Saccharomyces cerevisiae mediante etiquetado metabólico y cromatografía en capa delgada

Este video demuestra la preparación de un diseño ultra-delgado de matriz / analito capa para el análisis de péptidos y proteínas por láser asistida por matriz de desorción ionización espectrometría de masas (MALDI-MS).

MALDI preparación de la muestra: el método de ultra capa fina

Normas de isótopos estables y de captura de anticuerpos anti-péptido (SISCAPA) enriquecimiento de las parejas de afinidad de los péptidos con una dilución de isótopos estables de espectrometría de masas (MRM-MS) para proporcionar una medición cuantitativa de los péptidos como sustitutos de sus respectivas proteínas. A continuación se describe el protocolo de uso de partículas magnéticas en un formato parcialmente automatizado.

La cuantificación de proteínas mediante el enriquecimiento de inmunoafinidad péptido acoplado a espectrometría de masas

MALDI-TOF espectrometría de masas fue utilizada con éxito para controlar la amida hidrógeno / deuterio cambio en la activación de proteína quinasa Pak2.

Amida de hidrógeno / deuterio intercambio y MALDI-TOF análisis de espectrometría de masas de Pak2 activación

Aprende un método de lipidómica cuantitativa para identificar lípidos en levadura mediante espectrometría de masas ESI/MS. Esta técnica mejora la sensibilidad, velocidad y resolución en el análisis de especies lipídicas celulares.

Una evaluación cuantitativa de la Lipidome levadura utilizando la espectrometría de masas de ionización por electrospray

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