Name: Preparación y Cultura de la lente explantes Rata epiteliales para el estudio de la diferenciación terminal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 2 s
Description: Aprende a preparar y cultivar explantes de epitelio de lente de rata recién nacida para estudiar la diferenciación terminal inducida por FGF-2. Este método permite analizar la expresión génica mediante inmunofluorescencia y comprender los eventos de señalización celular.

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La preparación de los explantes epiteliales de la lente ha sido adaptado de los métodos se originó en el laboratorio del Dr. John McAvoy 9. Este trabajo está financiado por el National Eye Institute, Programa de Investigación Intramural Z01-EY000238-22

Parte 1: La eliminación de las lentes Materiales y reactivos: <ol><li> Micro-Tijeras de disección, puntas curvas, romas, (por ejemplo as.RS-5983, Roboz quirúrgica Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD), micro-disección pinzas, punta curva (como Roboz # RS5137). </li><li> Medio de suspensión: Medio 199 conteniendo 0,1% de albúmina de suero bovino, 100 unidades / ml de penicilina, estreptomicina 100μg/ml, 2,5 mg / ml Reactivos anfotericina B. están disponibles a partir de Invitrogen, Carlsbad, CA. </li></ol> Procedimiento: <ol><li> La eutanasia a las ratas recién nacidas (de 2-4 días), de conformidad con las directrices de los Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD. </li><li> Eliminar los párpados con una tijera quirúrgica. Presione suavemente con unas pinzas curvas en los lados opuestos de la órbita del ojo para forzar el ojo pared hacia afuera. Haga una pequeña incisión en la parte posterior del ojo con las tijeras. Pulsando con pinzas contra el lado del ojo frente a la incisión, la lente y una pequeña cantidad de vítreo adjunta a continuación, se puede forzar a través de la ruptura, lo que permite la lente para ser recogidos con pinzas curvas. Se debe tener cuidado de no romper la cápsula del cristalino. </li><li> Utilice las pinzas curvas para la transferencia de las lentes de 60 mm a un plato de plástico de 5 ml de cultivo de tejidos que contienen medio caliente, suspensión estéril. </li></ol> Parte 2: Microdisección de explantes Materiales y reactivos: <ol><li> Micro pinzas de disección, 0,1 mm de consejos, (como Roboz RS-4976). Usamos aleación Dumostar debido a la flexibilidad de la punta, pero otras aleaciones de acero también son aceptables. Pinzas con puntas de 0,1 mm más delgado que no son recomendables, ya que tienden a romperse o doblarse durante este procedimiento. </li><li> Suspensión medio (véase la Parte 1) </li><li> Sin suplementar F12 de Ham o medio 199 (Invitrogen, Carlsburg, CA) </li></ol> Procedimiento: <ol><li> Los siguientes pasos deben realizarse en un lugar limpio, sin corrientes de aire ambiente utilizando herramientas de disección estéril y medio estéril. </li><li> Utilizando un microscopio de disección estéreo, limpiar las lentes de los tejidos adheridos con la punta de pinzas 0,1 mm y transferirlos a una placa de cultivo con medio segundo de 60 mm 5 ml de suspensión estéril (este paso ayuda a reducir la contaminación). Con las pinzas, la transferencia de la cantidad deseada de lentes para una placa de cultivo de 35 mm que contiene 5 ml medio estéril, sin suplemento. (A menudo utilizamos F12 de Ham (Invitrogen) para este paso, porque la concentración de colorante más baja hace una disección más fácil, sin embargo, Medio 199 también es aceptable ningún antibiótico o cualquier otro tipo son necesarias en este paso..) Hasta 12 explantes se puede hacer en el centro de un plato de este tamaño. Sin embargo, un plato de 35 mm se debe utilizar, aunque menos explantes se deben hacer, ya que las herramientas de disección no se puede manipular con facilidad en un plato más pequeño. La transferencia de la cápsula que contiene las lentes restantes a un cultivo de tejidos incubadora a 37 ° C hasta que se necesiten. </li><li> Identificar la parte posterior de la lente. Hay muchas maneras de reconocer esto: 1) La parte posterior es más redonda que la anterior, que es ligeramente achatada, 2) las lentes de recién nacidos de ratas forman cataratas en frío cuando se enfrían a temperatura ambiente durante la disección. Si la catarata fría no ha llenado completamente el objetivo, la parte posterior es la parte más alejada de la zona opaca. Si la opacidad ha llenado la lente, el calentamiento de la placa a 37 ° C durante unos minutos lo contrario. El lado posterior se puede identificar como las reformas de cataratas en la refrigeración. 3) Los vestigios de la túnica vascular del cristalino pueden ser visibles en la parte posterior. 4) La sutura posterior puede ser visible en la parte posterior. La identificación de la parte posterior correctamente es esencial, ya que es donde la cápsula se abrió. Apertura de la lente en la parte anterior se rompa el epitelio. </li><li> Una vez que la parte posterior se ha identificado, que a su vez hacia arriba y captar el lente de las pinzas de la izquierda (para un trabajador de la derecha). A continuación, una pizca de la cápsula posterior con las pinzas adecuadas para producir un pequeño pliegue. </li><li> Mientras mantiene la cápsula posterior con las pinzas derecha, sujete la tapa de la cápsula con las pinzas a la izquierda y tirar de los dos pares de pinzas en direcciones opuestas para hacer un pequeño desgarro en la cápsula. </li><li> Mientras sujeta el borde de la cápsula retráctil con las pinzas, tire de él hacia abajo, primero en un lado y luego por la otra, presionando en el plástico de la cápsula con las pinzas. Repita esto varias veces, moviendo todo alrededor del ecuador de la lente, hasta que la cápsula esté bien conectado a la placa en muchos puntos. De la cápsula en su lugar con las pinzas de la izquierda, agite suavemente la masa de las fibras con las pinzas derecho de romper la unión entre las células de las fibras y células epiteliales en el ecuador del cristalino. Luego empuje la masa de fibra de distancia, rodar fuera de la cápsula / epitelio, que permanece unido a la parte inferior de laplato. Continuar este proceso con todos los objetivos en el plato. Retire y deseche las masas de fibra (o guardarlos congelados como fuente de proteínas del cristalino para otros estudios). </li></ol> Parte 3: Microdisección y la cultura de los explantes centrales Materiales y reactivos: <ol><li> Desechable estéril de bisturí, hoja n. º 15, (Cincinnati quirúrgica Co. Cincinnati, OH) </li><li> Fosfato de solución salina estéril tamponada con calcio y magnesio (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> Medio de cultivo: medio de suspensión que contiene 100ng/ml FGF-2 (Sigma-Aldrich, Inc. de St. Louis, MO). </li></ol> Procedimiento: <ol><li> Con un bisturí estéril, recortar el epitelio periférico (PE), que contiene las células en las primeras etapas de diferenciación (Figura 1), dejando una plaza central alrededor de 2,0 mm de lado, que consiste en el centro de las células epiteliales sólo (CE) (Figura 1B). </li><li> Transferir el plato que contiene los explantes central para un gabinete de bioseguridad. Lavar 3 veces con PBS estéril que contiene calcio y magnesio, y una vez con 1 ml de medio fresco, equilibrado y suspensión (37 ° C CO, 5% 2). Estas soluciones reducen en gran medida la probabilidad de contaminación. </li><li> Añadir 2 ml de medio de cultivo para inducir la diferenciación de una, y el lugar de los explantes en un humidificado, cultivo de tejidos incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2. Períodos de la cultura puede ser tan corto como unas pocas horas o extenderse hasta dos o tres semanas, dependiendo del parámetro en estudio. Medio debe ser cambiado cada dos o tres días. </li></ol> Parte 4: La recolección de los explantes para el análisis de los acontecimientos relacionados con la diferenciación 1. Explantes de recolección para el análisis de proteínas o ARN Materiales: <ol><li> Pinzas Microdissecting </li><li> Tampón de lisis SDS o ARN más tarde- </li></ol> Procedimiento: <ol><li> Al final del período de incubación, se elimina el medio de cultivo. </li><li> Con el microscopio de disección estéreo, extraiga con cuidado los bordes de cada explante. </li><li> Levante cada explante con las pinzas y transferirlo a un tubo que contiene buffer de lisis SDS 100μl (para el análisis de proteínas) o ARN más tarde (para el análisis de ARN). Agite la punta de las pinzas en la solución para asegurar que el explante no se pegue a las pinzas. </li></ol> 2. Explantes de la cosecha de inmunofluorescencia Materiales y reactivos: <ol><li> Tampón fosfato salino con calcio y magnesio (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> Tampón fosfato salino (sin calcio y magnesio) (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li> Paraformaldehído al 4% (Bioproducts Boston, Worcester, MA) </li><li> Pinzas Microdissecting </li><li> Pluma hidrofóbicas marca </li><li> Portaobjetos de vidrio </li><li> 0,25% de Triton X-100 en tampón fosfato salino. </li></ol> Procedimiento: <ol><li> Enjuague explantes brevemente en PBS que contenía calcio y magnesio. </li><li> Para reparar tejidos mediante la adición de 4% de paraformaldehído durante 30 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Retire el fijador y reemplazar con tampón fosfato salino. Explantes se fija un poco rígida, lo que les permite ser levantado y trasladado a las diapositivas de cristal para inmunotinción. </li><li> Coloque una pequeña gota de PBS (sin calcio y magnesio) en la diapositiva para ayudar a posicionar el tejido y evitar que se ondulen. Con unas pinzas microdissecting, levante el explante y la inserta en la caída en la diapositiva. Sin tocar el explante, retire con cuidado el líquido con una mecha de papel para aplanar el explante en el cristal y dejar que el tejido seco en el aire a temperatura ambiente durante 3 a 5 minutos. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1519/fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1 A. El epitelio periférico expresa una diferenciación específica de las proteínas. El explante mostró fue immunostained para N-cadherina inmediatamente después de microdisección. Expresión se ve en una banda de células en el epitelio periférico, lo que indica que las células de esta región han empezado a diferenciarse. B. El epitelio periférico puede ser recortada para eliminar las células que expresan N-cadherina y otras proteínas de diferenciación específica. El anillo de color rojo representa la ubicación de las células que expresan N-cadherina, mientras que la pequeña plaza que se indica en gris representa el cuadrante del epitelio muestra en el panel 1A. El epitelio periférico puede ser removido por cuatro cortes de bisturí, dejando una plaza central que contiene las únicas células que todavía no han empezado a diferenciarse.

<ol><li>McAvoy, J. W., Chamberlain, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+%28FGF%29+induces+different+responses+in+lens+epithelial+cells+depending+on+its+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor (FGF) induces different responses in lens epithelial cells depending on its concentration.</a> Development. 107 (2), 221-228 (1989).</li>
<li>Campbell, M. T., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+of+fibre+differentiation+in+cultured+rat+lens+epithelium+under+the+influence+of+neural+retina-conditioned+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Onset of fibre differentiation in cultured rat lens epithelium under the influence of neural retina-conditioned medium.</a> Exp Eye Res. 39 (1), 83-94 (1984).</li>
<li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+lens+epithelial+explants+induced+to+differentiate+into+fibres+by+fibroblast+growth+factor+%28FGF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of lens epithelial explants induced to differentiate into fibres by fibroblast growth factor (FGF).</a> Exp Eye Res. 49 (3), 479-494 (1989).</li>
<li>Golestaneh, N., Fan, J., Fariss, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens+major+intrinsic+protein+%28MIP%29%2Faquaporin+0+expression+in+rat+lens+epithelia+explants+requires+fibroblast+growth+factor-induced+ERK+and+JNK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Lens major intrinsic protein (MIP)/aquaporin 0 expression in rat lens epithelia explants requires fibroblast growth factor-induced ERK and JNK signaling.</a> J Biol Chem. 279 (30), 31813-31822 (2004).</li>
<li>Saravanamuthu, S. S., Gao, C. Y., Zelenka, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+is+required+for+lateral+induction+of+Jagged1+during+FGF-induced+lens+fiber+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Notch signaling is required for lateral induction of Jagged1 during FGF-induced lens fiber differentiation.</a> Dev Biol. 332 (1), 166-176 (2009).</li>
<li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-induced+lens+cell+proliferation+and+differentiation+is+dependent+on+MAPK+%28ERK1%2F2%29+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF-induced lens cell proliferation and differentiation is dependent on MAPK (ERK1/2) signalling.</a> Development. 128 (24), 5075-5084 (2001).</li>
<li>Dirks, R. P., Kraft, H. J., Van Genesen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cooperation+between+two+silencers+creates+an+enhancer+element+that+controls+both+the+lens-preferred+and+the+differentiation+stage-specific+expression+of+the+rat+beta+B2-crystallin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The cooperation between two silencers creates an enhancer element that controls both the lens-preferred and the differentiation stage-specific expression of the rat beta B2-crystallin gene.</a> Eur J Biochem. 239 (1), 23-32 (1996).</li>
<li>Yang, Y., Stopka, T., Golestaneh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+alphaA-crystallin+via+Pax6%2C+c-Maf%2C+CREB+and+a+broad+domain+of+lens-specific+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Regulation of alphaA-crystallin via Pax6, c-Maf, CREB and a broad domain of lens-specific chromatin.</a> The EMBO journal. 25 (10), 2107-2118 (2006).</li>
<li>McAvoy, J. W., T, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+retinas+promote+cell+division+and+fibre+differentiation+in+lens+epithelial+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Neural retinas promote cell division and fibre differentiation in lens epithelial explants.</a> Curr Eye Res. 3 (6), 827-834 (1984).</li>
</ol>

El objetivo de la rata sistema de explante ha sido utilizado con éxito por una serie de laboratorios para estudiar la diferenciación terminal de las células epiteliales de la lente de las fibras del cristalino 21,3,4,5. Cuando se expone a FGF-2 en 100ng/ml los explantes comenzará a mostrar cambios en la señalización dentro de 6 minutos, con cambios en la morfología y la expresión de genes que aparecen de forma secuencial durante varios días 3,4,5. Las culturas permanecen viables durante 2-3 semanas si se tiene cuidado para evitar la contaminación. Los explantes central descrito en este protocolo son especialmente útiles para el estudio de la secuencia de eventos asociados con la diferenciación, ya que contienen pocas o ninguna las células que expresan marcadores de diferenciación antes de FGF-2 se añade 1,5. Las células se diferencian de forma sincrónica, como un grupo, por lo que es posible seguir la evolución temporal de las señales y los eventos asociados con la diferenciación de la transcripción. Explantes de cultivo para diferentes periodos de tiempo por lo tanto proporciona información precisa acerca de los eventos temporales de secuencia. Inhibidores específicos se pueden añadir al medio de cultivo para identificar las vías de señalización correspondiente. Los explantes se puede utilizar para analizar la expresión de proteínas por electroforesis en gel de SDS e inmunoblotting o para analizar la expresión de ARNm específicos por RT-PCR. Proteínas gama rendimientos 20-50 mg / explante y el rendimiento de ARN es de aproximadamente 200 a 600 ng / explante, dependiendo de la duración del período de cultivo. Por lo general, encontramos que 6.5 explantes por plato proporcionará suficientes proteínas o ARN de varios ensayos. ARN a partir de explantes también se puede utilizar para preparar cDNA para la evaluación de la expresión génica mediante análisis de microarrays, que permiten identificar nuevos genes que pueden ser críticos para la diferenciación. Los explantes pueden ser transfectadas. A pesar de la eficiencia de transfección es generalmente bajo, es suficiente para el ensayo de genes indicadores 4, 7, 8. Microscopio de inmunofluorescencia de los explantes proporciona un complemento útil a los métodos bioquímicos para determinar la localización subcelular de las proteínas de interés. Por lo tanto, la preparación y la cultura de los explantes lente rata ofrece un potente sistema para el estudio de la diferenciación terminal de lentes en los mamíferos, que pueden complementar las técnicas in vivo, tales como la generación de ratones transgénicos y knock-out.

preparación y cultura de la lente explantes rata epiteliales para el estudio de la diferenciación terminal

Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation

La superficie anterior del cristalino ocular está cubierta por una monocapa de células epiteliales, que proliferan en una zona anular subyacente del cuerpo ciliar. Después de la división, estas células migran posteriormente, en la difusión de la retina FGF induce a diferenciarse en una amplia posterior alargada de las células del cristalino fibras que componen el grueso de la lente. Diferenciación de las células epiteliales de la lente en las fibras del cristalino puede ser inducida in vitro por cultivo de explantes de la región central del epitelio anterior en presencia de FGF-2. Explantes son preparados a partir de las lentes de ratas recién nacidas por la extirpación del cristalino del ojo y agarrar la cápsula del cristalino en la parte posterior con unas pinzas de disección. La cápsula posterior es suavemente desgarrado y se presiona hacia abajo en la parte inferior de plástico de un plato de cultivo de tejidos. Las regiones periféricas del explante se quitan con un bisturí y la zona central luego se cultiva en presencia de 100ng/ml FGF-2 durante el tiempo de 2-3 semanas, dependiendo de los parámetros a estudiar. Dado que las células epiteliales en explantes cultivados diferenciar en sincronía aproximada durante un período de días o semanas, el curso temporal de la señalización y la expresión génica se puede determinar mediante técnicas moleculares, bioquímicos y farmacológicos. La inmunofluorescencia es un auxiliar poderoso de estos métodos, ya que demuestra la localización subcelular de las proteínas de interés y puede revelar las consecuencias fisiológicas de manipulaciones experimentales de las vías de señalización.

Explantes de la región central de la lente de la rata epitelio diferenciar sincrónicamente cuando se cultivan en presencia de FGF-2. Microscopio de inmunofluorescencia de esas culturas puede ofrece información novedosa sobre la expresión génica y la señalización de eventos relacionados con la diferenciación terminal.

Preparación y Cultura de la lente explantes Rata epiteliales para el estudio de la diferenciación terminal

La superficie anterior del cristalino está cubierta por una monocapa de células epiteliales, que proliferan en una zona anular situada bajo el cuerpo ciliar.

Este procedimiento comienza con la extracción de los cristalinos de ratas de dos a cuatro días de edad y su limpieza para eliminar cualquier tejido adherido. Se identifica el lado posterior del cristalino y se realiza un pequeño desgarro en la cápsula. Luego, la cápsula se desprende hacia abajo y se presiona contra el fondo del recipiente.Este proceso se repite alrededor de toda la lente. La masa de fibras del cristalino se elimina moviéndola lateralmente. El epitelio periférico se corta y luego se cultivan.Finalmente, se transfieren a un tubo de ensayo para análisis bioquímico o a una lámina de vidrio para microscopía. Hola, soy Peggy Lanka en el laboratorio de Biología Molecular y del Desarrollo del Instituto Nacional del Ojo en los NIH. Hola, soy Al Tu, también del Laboratorio de Biología Molecular y del Desarrollo del Instituto Nacional del Ojo.Soy Chung Ga, también del mismo laboratorio del NEI. Hoy les mostraremos un procedimiento para extraer y cultivar epitelio lensar de ratas recién nacidas. Les mostraremos cómo eliminar la región periférica del epitelio, que contiene células en las primeras etapas de diferenciación.Luego le mostraremos cómo inducir a las células epiteliales centrales del cristalino restantes a diferenciarse y formar fibras del cristalino exponiéndolas a FGF. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la cronología de los eventos implicados en la diferenciación terminal. Recoleccionamos el EXPLAN en diversos momentos tras añadir FGF al medio de cultivo.Luego analizamos la expresión proteica mediante inmunotransferencia, la expresión de ARN mediante R-T-P-C-R o microarreglos e inmunotincionamos el explante para determinar la localización subcelular de las proteínas de interés. Comencemos moviendo los cristalinos de ratas recién nacidas. Para iniciar, use tijeras de disección microquirúrgicas para extraer los cristalinos de los ojos de ratas sacrificadas de dos a cuatro días de edad realizando una pequeña incisión posterior y presionando desde el lado opuesto.Transfiera las lentes a una placa de cultivo tisular plástica de 60 milímetros que contenga cinco mililitros de medio de suspensión estéril tibio, utilizando pinzas con punta de 0,1 milímetros. Limpie cualquier tejido adherido de las lentes y transfiéralas a una segunda placa de cultivo de 60 milímetros que contenga cinco mililitros de medio de suspensión estéril. Esto ayuda a reducir la contaminación con las pinzas.Transfiera el número deseado de lentes a una placa de cultivo de 35 milímetros que contenga dos mililitros de medio estéril sin suplemento. Se pueden realizar hasta 12 x explantes en el centro de una placa de este tamaño. Cualquier lente adicional puede almacenarse en la segunda placa de 60 milímetros del paso anterior y colocarse en un incubador de cultivo de tejidos a 37 grados Celsius hasta una hora antes de utilizarlos para hacer X explantes.Ahora identifique el lado posterior del cristalino. Estos dos, puedo decir que están colocados con su lado anterior hacia arriba. Voy a colocarlo de canto para que pueda mirar a lo largo de él y verá la catarata fría, que es un área opaca en el centro.El lado más alejado del centro opaco es el lado posterior. Por lo tanto, lo giro hacia el lado posterior. En el lado posterior, también pueden observarse estas estrías, que son los restos de esta tenal vasculitis.Es un patrón de vasos sanguíneos alrededor de la periferia del cristalino que también marca el lado posterior. Correcto. La identificación es fundamental, ya que aquí es donde se abrirá la cápsula. Abrir el cristalino por el lado anterior provocará el desgarro del epitelio.Existen varias formas de identificar el lado posterior. Primero, es más redondeado que el lado anterior, que está ligeramente aplanado. Segundo, los cristalinos de ratas recién nacidas forman cataratas frías al enfriarse a temperatura ambiente durante la disección.Si la catarata fría aún no ha llenado completamente el cristalino, el lado posterior es el más alejado de la región opaca. Si la opacidad ha llenado el cristalino, calentar el recipiente a 37 grados Celsius durante unos minutos revertirá el efecto. El lado posterior puede identificarse cuando la catarata se vuelve a formar al enfriarse.Pueden ser visibles terceros vestigios de las VASIs de la túnica en el lado posterior. Finalmente, la sutura posterior puede ser visible en el lado posterior. Una vez que se ha identificado el lado posterior, colóquelo hacia arriba y sostenga la lente con la pinza izquierda.Luego, pellizque la cápsula posterior con la pinza derecha para producir un pequeño pliegue mientras sostiene la cápsula posterior con la pinza derecha; agarre el pliegue de la cápsula con la pinza izquierda y tire de ambos pares de pinzas en direcciones opuestas para hacer una pequeña rotura en la cápsula. Mientras sostiene el borde de la cápsula retráctil con las pinzas, tire hacia abajo primero en un lado y luego en el otro, presionándola contra el plástico del recipiente con las pinzas. Repita este procedimiento varias veces, moviéndose alrededor de todo el ecuador del cristalino hasta que la cápsula quede firmemente adherida a la placa. En muchos puntos, sosteniendo la cápsula en su lugar con la pinza izquierda, mueva suavemente la masa de fibras con la pinza derecha para romper la unión entre las células fibrilares y las células epiteliales en el ecuador del cristalino.Ahora tire suavemente de la masa de fibras, enrollándola fuera de la cápsula, que permanece unida al fondo del platillo. Repita este proceso con todas las lentes en el platillo. Las masas de fibras pueden descartarse o congelarse y conservarse como fuente de proteínas de lente para otros estudios con microdisección de todo el explante epitelial completo.Veamos la microdiseción y el cultivo del explante central. Con un escalpelo estéril, retire el epitelio periférico, que contiene células en las primeras etapas de diferenciación. Deje un cuadrado central, de aproximadamente dos milímetros por cada lado, que consiste en células epiteliales centrales.Transfiera únicamente el recipiente que contiene el explante central a una cabina de seguridad biológica. Lave las berenjenas tres veces con PBS estéril y una vez con un mililitro de medio de suspensión fresco y equilibrado. A continuación, agregue dos mililitros de medio de cultivo para inducir la diferenciación y coloque el explante en un incubador de cultivo de tejidos humedecido a 37 grados Celsius, 5 % de dióxido de carbono.El período de cultivo puede durar desde unas pocas horas hasta dos o tres semanas, dependiendo del parámetro que se esté estudiando. El medio debe cambiarse cada dos o tres días con microdisección y Turing complete. Comencemos a recolectar los explantes para su análisis.Al final del período de incubación, retire el medio de cultivo utilizando pinzas microquirúrgicas. Suelte suavemente los bordes de cada explante. Sujete cada explante con las pinzas y transfiéralo a un tubo que contenga aproximadamente 100 microlitros de tampón de lisis SDS para análisis de proteínas o RNA later para análisis de ARN, y agite la punta de las pinzas en la solución para asegurarse de que el explante no se adhiera a las pinzas.Los explantes ya están listos para el análisis de proteínas o ARN; los explantes también pueden analizarse mediante inmunofluorescencia. Para comenzar, enjuague brevemente los explantes en PBS. Fije los tejidos añadiendo paraformaldehído al 4 % durante 30 minutos.A temperatura ambiente, retire el fijador y sustitúyalo por PBS. Los explantes se volverán algo rígidos, lo que permite levantarlos y transferirlos a portaobjetos de vidrio para la inmunotinción. Coloque una pequeña gota de PBS sin calcio ni magnesio sobre el portaobjetos para ayudar a posicionar el tejido y evitar que se enrolle. Utilizando pinzas para disección microscópica, levante el explante e insértelo en la gota sobre el portaobjetos sin tocarlo; use cuidadosamente una mecha de papel para eliminar el líquido y aplanar el explante sobre el vidrio.Deje que el tejido se seque al aire a temperatura ambiente durante tres a cinco minutos. Los implantes ya están listos para el análisis de inmunofluorescencia. Aquí se muestra un ejemplo de un explante epitelial completo microdiseccionado que ha sido inmunomarcado para NCO, un marcador de adherencia celular.En las primeras etapas de la diferenciación, solo las células en la región periférica del epitelio presentan tinción positiva para esta proteína en corte. El epitelio periférico, tal como se describe en este protocolo, deja un explante central que contiene pocas, si es que hay, células que expresan y son coherentes. Esto se muestra mediante inmunotransferencia, analizando los tejidos epiteliales central y periférico para y coherente; la inmunotransferencia para GA.DH se utilizó para confirmar que las muestras de proteína se cargaron de manera equitativa.El momento de los eventos asociados con la diferenciación puede determinarse cultivando el explante central durante diferentes períodos de tiempo. Los explantes centrales se cultivaron durante 2, 5, 24 y 48 horas en medio con o sin 100 nanogramos por mililitro de FGF. Los explantes X se recolectaron en los tiempos indicados y se transfirieron al tampón de muestra SDS para su análisis mediante inmunotransferencia western.Los resultados muestran que la expresión del proteína recombinante se induce entre 24 y 48 horas después. En cultivo. La inmunotransferencia para GA DH demuestra que las muestras de proteína se cargaron en cantidades iguales.Inmunotinción de explantes centrales cultivados durante cuatro días en ausencia o presencia de 100 nanogramos por mililitro de FGF, que muestra que la inmunofluorescencia de la N-cadherina está fuertemente elevada en los explantes expuestos a FGF. La inmunofluorescencia también muestra la localización subcelular de la N-cadherina en los límites entre célula y célula.Así que acaban de mostrarle cómo preparar epitelios lenticulares en cultivo para estudiar la diferenciación. La ventaja principal de este sistema es que las células se diferencian de manera sincrónica. Esto hace posible determinar la secuencia de los eventos.Además, podemos añadir factores de crecimiento o inhibidores específicos al medio para activar o bloquear vías de señalización particulares. Al realizar este procedimiento, es importante recordar prevenir la contaminación mediante la disección y el uso de medio estéril en un ambiente limpio, así como observar minuciosamente el explante antes de su cultivo. Eso es todo.Gracias por ver este video. Buena suerte con su experimento. Adiós. Adiós.

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Se describe un método para diseñar un retineano tejido compuesto de células epiteliales del pigmento retiniano derivadas de las células de vástago pluripotent humanas cultivadas sobre las membranas amnióticas humanas y su preparación para injerto en modelos animales.

Ingeniería del tejido epitelio pigmentario de la retina trasplante adecuado derivado de células madre embrionarias humanas

Presentamos un modelo in vitro para evaluar la capacidad neurorregenerativa olfativa ensheathing glia (OEG), después de una lesión neuronal. Se basa en un cocultivo de neuronas ganglionas de retina adultas axotomizadas (RGN) en monocapas OEG y posterior estudio de regeneración axonal, mediante el análisis de marcadores axoales y somatodendriáticos RGN.

Cocultura de neuronas ganglionas retinal de rata axotomizada con glia olfativa, como modelo in vitro de regeneración axonal adulta

El protocolo describe explantes organotípicos de ratón neuroretina,cultivados junto con su epitelio pigmentario retiniano (EPR), en medio definido R16, libre de suero y antibióticos. Este método es relativamente simple de realizar, menos costoso y lento en comparación con los experimentos in vivo, y se puede adaptar a numerosas aplicaciones experimentales.

A largo plazo, Cultivo Sin Suero De Explantes Organotípicos De La Retina De Ratón Con Epitelio Pigmento Retiniano Intacto

Este estudio tiene como objetivo desarrollar un nuevo modelo de cultivo de retina organotípico humano (HORC) que evite comprometer la integridad de la retina durante el manejo del explante. Esto se logra cultivando la retina con el vítreo resbanante y el epitelio-coroides pigmentario retiniano subyacente (RPE-coroides) y esclerótica.

Caracterización de una nueva técnica de cultivo de retina organotípica humana

Este protocolo, que fue reportado originalmente por Fernandez-Godino et al. en 20161,describe un método para aislar eficientemente y cultivo de células RPE del ratón, que forman una monocapa RPE funcional y polarizada dentro de una semana en las placas Transwell. El procedimiento dura aproximadamente 3 horas.

Disección eficiente y cultivo de células epiteliales de pigmento retiniano de ratón primario

Este protocolo presenta y describe los pasos para el aislamiento, disección, cultivo y tinción de explantes de retina obtenidos de un ratón adulto. Este método es beneficioso como modelo ex vivo para estudiar diferentes enfermedades neurovasculares de la retina como la retinopatía diabética.

Explante retiniano de la retina de ratón adulto como modelo ex vivo para el estudio de enfermedades neurovasculares retinianas

Este manuscrito describe un protocolo de video detallado para el cultivo de células epiteliales del cristalino primario (LEC), con el objetivo de mejorar la reproducibilidad y ayudar a la investigación en cataratas y opacificación de la cápsula posterior (PCO). Ofrece instrucciones paso a paso sobre la disección de lentes, el aislamiento de LEC y la validación, lo que sirve como una guía valiosa, especialmente para los recién llegados al campo.

Optimización del cultivo de células epiteliales del cristalino primario de ratón: una guía completa para la tripsinización

Desarrollamos un modelo de rata de inflamación corneal severa a través de legrado de epitelio corneal combinado con suturas corneales. El estudio evaluó los patrones de inflamación de la córnea, la proliferación epitelial y los cambios en las células madre limbales en condiciones inflamatorias.

Establecimiento de un modelo de inflamación corneal severa en ratas basado en legrado del epitelio corneal combinado con suturas corneales

Este protocolo detalla la separación del epitelio del cristalino ocular del ratón y la masa a granel de las células de fibra, seguida del aislamiento de ARN y el análisis de qPCR. Este método permite separar los compartimentos de las células del cristalino para un análisis más detallado del transcriptoma y los procesos biológicos en las células epiteliales frente a las células de fibra diferenciadas.

Aislamiento de ARN del epitelio del cristalino ocular de ratón y masas masivas de células de fibra

Aprende a preparar y cultivar explantes de epitelio de lente de rata recién nacida para estudiar la diferenciación terminal inducida por FGF-2. Este método permite analizar la expresión génica mediante inmunofluorescencia y comprender los eventos de señalización celular.

Preparación y Cultura de la lente explantes Rata epiteliales para el estudio de la diferenciación terminal

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