La purificación de la población de células específicas de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS)

Hola, soy Hope Campbell de la especialista en citometría de flujo del Instituto de Investigación de la Sangre del Centro de Sangre de Wisconsin. Hola, soy STR Baso, estudiante de posgrado en el laboratorio de la Dra. Bonnie Dieter. También estoy en el Instituto de Investigación de la Sangre del Centro de Sangre de Wisconsin.

Hoy vamos a hacer un procedimiento de aislamiento de células mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia. Utilizamos este procedimiento en un laboratorio para estudiar la función de los linfocitos y las poblaciones de células mieloides. Empecemos.

En este procedimiento, se purificarán cuatro células T B y CD a partir de citos de ratón. El número inicial de celdas objetivo debe calcularse en función del número de celdas necesarias y la tasa de recuperación de la máquina que utiliza este método. La tasa de recuperación típica para las células T B y CD cuatro es del 85 al 90%La población inicial de citos SP es de aproximadamente 60 a 70% de células B y de 20 a 30% de células T.

Por lo tanto, si comienzas con 100 por 10 a las seis células, podrás recuperar de 50 a 60 millones de células B y de 20 a 30 millones de células T antes de comenzar los hechos. Las soluciones y los reactivos necesarios para el protocolo deben colocarse en hielo. Estos incluyen tampón de tinción que consiste en solución salina tamponada con fosfato con 3% de suero de ternera fetal, tampón de suspensión que consta de 25 milimolares de HEP preparados en la solución salina equilibrada de Hank o HBSS que contiene 3% de suero de ternera fetal A, solución de 25 milimolares de hepatitis B preparada en suero de ternero fetal, anticuerpos de tinción y perlas de compensación.

Este protocolo también requiere los siguientes suministros y reactivos: tubos cónicos de 15 mililitros, tubos de flujo de poliestireno o polipropileno de 12 por 75 milímetros. Un colador de células de nylon trien azul y un hemocitómetro que clasifica los tubos de recolección también deben prepararse con anticipación para hacer esto.

A 300 microlitros de la solución de FCS de él a tubos de flujo o un mililitro de la solución FFC S de HEP a tubos cónicos de 15 mililitros. Estos deben colocarse en hielo hasta que comience el proceso de recolección. Comience generando una suspensión de una sola célula de la población celular deseada.

Si las células están aisladas, mediante este procedimiento se cultivará. Toda la preparación celular debe realizarse en una campana de cultivo de tejidos. Utilizando una técnica estéril, lavar las células una vez añadiendo tampón de tinción helado y volver a suspender las células invirtiendo el tubo varias veces.

A continuación, centrifugar las células durante siete u ocho minutos a unos 250 GS cuatro grados centígrados. Las condiciones de lavado pueden variar según el tipo de célula y la concentración. En el caso de los citos, lavar hasta 200 veces 10 hasta las seis células con 10 mililitros de tampón de tinción.

Retire con cuidado el sobrenadante por aspiración para que la célula permanezca intacta. A continuación, vuelva a suspender las células en un tampón de tinción helado a una concentración de hasta 50 veces 10 por 6 por 100 microlitros. Vuelva a suspender el pellet de la célula moviendo o agitando suavemente el tubo.

A continuación, transfiera de 0,25 a una vez 10 de las seis celdas a un nuevo tubo de flujo de poliestireno o polipropileno de 12 por 75 milímetros sobre hielo. Y deje esto a un lado para usarlo más tarde como muestra de control sin teñir en el primer tubo, agregue anticuerpos primarios a la suspensión celular para lograr la concentración final deseada. Aquí, los anticuerpos anti B 20 conjugados rojos de PE Texas se utilizan para teñir las células B, mientras que los anticuerpos anti TCR R beta conjugados ZI o 700 conjugados anti CD cuatro se utilizan para teñir las células T mezcladas moviendo la parte inferior del tubo o con luz.

A continuación, coloque las células en hielo e incube en la oscuridad durante 20 a 30 minutos. Después de la incubación, lavar las células marcadas por Resus, suspendiéndolas en 10 mililitros de suspensión helada, tampón y centrifusión como antes, después de una cuidadosa eliminación del sobrenadante. Repita este paso para lavar las células por segunda vez.

Finalmente, vuelva a suspender las células en un tampón de suspensión helado. Si los anticuerpos primarios no están directamente conjugados con un fluoro cuatro, agregue anticuerpos secundarios marcados o estreptococos AVID en conjugado a la suspensión celular y, nuevamente, incube las células en hielo en la oscuridad durante 20 a 30 minutos después de la incubación. Lave las celdas dos veces con tampón de suspensión helado.

Después de resus suspender las células en tampón de suspensión helado. Determine la concentración celular y la viabilidad utilizando un colorante vital como el azul de trian y el hemocímetro. Ajuste la concentración de celdas de 10 a 20 veces 10 a la sexta celdas por mililitro agregando tampón de suspensión para evitar obstruir la máquina de fax con grupos de celdas que pueden haber muerto durante el aislamiento.

Procedimiento y tinción. Filtre las células a través de un colador de goteo inmediatamente antes de comenzar el protocolo de clasificación. El tamaño de poro del filtro debe elegirse en función del tipo de célula para los citos, se utiliza un filtro con un tamaño de poro de 40 micrómetros.

Recoja las celdas filtradas en un tubo cónico de 15 litros o tubos de flujo de 12 por 75 milímetros dependiendo del volumen. Y coloque las células en hielo mientras el citómetro está configurado para el procedimiento de clasificación. Si utiliza perlas BD comp como controles positivos de un solo color, prepare un tubo de control para cada color utilizado en el ensayo más un tubo de control negativo sin teñir.

Después de vorexionar completamente las suspensiones de cuentas, agregue una, coloque cada una de las suspensiones de cuentas negativas y positivas en un tampón de suspensión de 100 microlitros para cada color utilizado y el control negativo. A continuación, agregue un microlitro del anticuerpo marcado a cada tubo de control positivo. En este experimento, se prepara un tubo utilizando PE Texas'Red B dos 20 anticuerpos.

Uno que utiliza anticuerpos beta ETCR fit y otro que utiliza 700 CD cuatro anticuerpos mezclados moviendo la parte inferior de los tubos e incubando durante 15 a 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Lavar las perlas una vez con dos mililitros de tinte, tampar y centrifugar a 200 Gs durante 10 minutos. Retire el sobrenadante por aspiración y vuelva a suspender el pellet de perlas en 200 a 500 microlitros de tinción.

La configuración del tampón del citómetro de flujo varía según el fabricante y solo debe ser realizada por personal debidamente capacitado. El procedimiento de clasificación de células aquí se realizará utilizando el aria de defectos BD. Antes de clasificar, seleccione la boquilla adecuada en función del tipo de célula que se vaya a clasificar.

Los tamaños disponibles para los datos aria son 70 micrómetros, 100 micrómetros y 130 micrómetros. El tamaño de la boquilla debe ser al menos tres veces el tamaño de la célula que se va a clasificar para los linfocitos, se selecciona la boquilla de 70 micrómetros. La clasificación aséptica de células se puede realizar utilizando la opción de clasificación aséptica del instrumento.

Con esta opción, todo el recorrido de la vaina se descontamina con etanol al 70% de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Asegúrese de reemplazar los filtros de vaina y reemplace el PBS con PBS estéril. Una vez que el citómetro esté listo para funcionar, coloque los tubos de recolección preenfriados que contienen montones de FCS en el dispositivo de recolección apropiado.

Los dispositivos de recolección disponibles pueden contener hasta dos tubos cónicos de 15 mililitros. Cuatro tubos de 12 por 75 milímetros o cuatro micro tubos. Use tubos de 12 por 75 milímetros para recolectar menos de 1.5 veces 10 a la sexta celdas y tubos cónicos de 15 mililitros para recolectar 1.5 veces 10 a las seis a 4.5 veces 10 a la sexta celda.

Coloque el dispositivo de recogida adecuado en la cámara de recogida de clasificación. Dirija los flujos laterales hacia el dispositivo de recolección instalado para clasificaciones multicolor. Primero se calibra el citómetro para tener en cuenta la superposición espectral entre los detectores.

El ejemplo que se muestra aquí ilustra la superposición entre los espectros de emisión de ajuste E y pe. Esta superposición que se muestra en el área sombreada oscura se denomina desbordamiento. En este caso, el desbordamiento de PE se detectaría en el canal de ajuste E y el desbordamiento de ajuste e se detectaría en el canal de PE.

Este desbordamiento debe corregirse para eliminar la fluorescencia residual de un piso cuatro en otro canal. El proceso de corrección del desbordamiento se denomina compensación para realizar la compensación manual. Utilice el software de citometría para configurar una plantilla que incluya un gráfico bivariado para mostrar el FSC de dispersión directa y el SSC de dispersión lateral y un histograma para cada fluro que se utilizará.

El método para configurar estos gráficos varía según el software. Coloque el tubo de comunicación de control negativo en el puerto de carga del citómetro y comience la adquisición de datos a medida que se ejecuta la muestra. Ajuste el FSC y el SSC para colocar la población de interés en la escala.

A continuación, ajuste la configuración de PMT de fluorescencia para colocar la población negativa o la autofluorescencia en la parte del extremo izquierdo del histograma. Registre el tubo de control negativo. Retire el tubo de control negativo del puerto de carga del citómetro y reemplácelo con el primer tubo de comunicación de control positivo.

Ahora comience la adquisición. Repita este proceso para cada uno de los tubos de control positivo registrando los datos de cada tubo. Para cada control positivo, dibuje una puerta de intervalo o un cuadro alrededor de los eventos registrados en el histograma.

A continuación, dibuje otra puerta de intervalo en la parte negativa del histograma. Al hacer la compensación manual, tenga en cuenta cada fluro utilizado en el experimento ajustando la mediana de los positivos hasta que sea igual a la mediana de los negativos. Para ajustar la mediana, ajuste los valores de superposición espectral, ya sea más altos o más bajos, hasta que las medianas de cada parámetro fluorescente coincidan lo más posible.

Utilizando los ajustes establecidos con las muestras de control positivas y negativas, prepárese para el procedimiento de clasificación determinando los ajustes de marcha para la muestra experimental. Coloque el tubo de células que se van a clasificar en el puerto de carga del citómetro y comience la adquisición utilizando una velocidad de nueve a 10.000 eventos por segundo. Seleccione un diagrama de puntos para mostrar la dispersión hacia adelante frente a la dispersión lateral.

La dispersión directa es un indicador general del tamaño de la celda y se coloca en el eje x, mientras que la dispersión lateral es un indicador de la granularidad de la celda y se coloca en el eje Y. Ahora puerta la población de interés. Una vez que se hayan determinado las puertas, verifique que la temperatura del puerto de carga del citómetro esté configurada en cuatro grados Celsius.

A continuación, coloque el tubo de muestra experimental en el puerto de carga. Presione la opción de clasificación y comience la adquisición, los tubos de recolección deben colocarse en hielo a medida que se llenan. Continúe clasificando hasta que se haya recolectado el número deseado de células o hasta que el tubo de muestra esté vacío.

A continuación, detenga la clasificación seleccionando de nuevo el botón de clasificación y retire la muestra del puerto de carga. A continuación, coloque el tubo colector directamente en el puerto de carga del citómetro y adquiera de 500 a 1000 eventos. Utilizando la misma configuración utilizada para la clasificación de las células T, el procedimiento de clasificación aumentó la pureza del 21 al 99%Para las células B, la población inicial de células B del 5% se incrementó al 98% después de la clasificación.

Así que acabamos de mostrarle cómo purificar la población de células B y T a partir de citos por fax. Recuerde que los hechos se pueden usar para purificar cualquier población celular si se puede generar una suspensión de una sola célula y se dispone de los anticuerpos adecuados. Además, las células apiladas genéticamente con marcadores fluorescentes pueden purificarse fácilmente sin el uso de anticuerpos.

Además, recuerde siempre utilizar los controles adecuados para sus experimentos y compruebe siempre la configuración de su láser de citometría de flujo para asegurarse de que está utilizando los fluorocromos correctos y de utilizar las puertas adecuadas para que estén alrededor de sus poblaciones correctamente. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.