Name: Perfiles de anticuerpos por los sistemas de inmunoprecipitación luciferasa (LIPS) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-10-07T17:25:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Aprende a realizar perfiles de anticuerpos mediante LIPS en células COS-1 con luciferasa Renilla. Este método eficiente permite cuantificar anticuerpos sin purificación de extractos crudos para diagnóstico.

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Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramural del NIDCR.

1. Esquemática general: Este video muestra los pasos necesarios para realizar el ensayo LIPS. Antígenos se expresan en células COS1 como recombinante luciferasa Renilla (RUC) del antígeno-fusiones, y extractos crudos obtenidos y utilizados sin purificación. El ensayo LIPS se inicia mediante la incubación de porquería e-Ruc antígeno extractos con sueros de pacientes en pocillos de microtitulación. La mezcla de antígeno-anticuerpo se transfiere a una placa de 96 pozos de filtración que contienen la proteína A / G cuentas para capturar las moléculas de IgG. Después de lavar la placa de filtro que contiene la proteína A / anticuerpo G cuentas, con destino Ruc-antígeno se mide por la adición de sustrato coelenterazine y unidades de luz se miden con un luminómetro. PARTE 1: La transfección de plásmidos para la producción de proteínas de fusión antígeno-Renilla Set-up: COS1 células se cultivan en DMEM-FCS al 10% utilizando los protocolos estándar de cultivo de tejidos. Plásmidos de luciferasa Renilla fusiones se han descrito anteriormente 1. ADN de estos plásmidos se prepara utilizando un kit de Qiagen Midiprep. El rendimiento debe ser de aproximadamente 1 mg -3. Medir la concentración de ADN y almacena como un mg 1000 / ml de solución madre a -20 ° C. Procedimiento: <ol><li> Un día antes de la transfección, dividir células COS-1 en los nuevos 100 x 20 mm platos en aproximadamente 2 x 10 6 por placa y se incuba a 37 ° C. </li><li> Al día siguiente, la células COS-1 debe ser un 80-95% confluente. Etiqueta de 1,5 ml tubos de microcentrífuga de polipropileno para cada plásmido de ADN que se transfectadas. Permita que el reactivo de transfección FuGENE-6, que se conserva a 4 ° C, para calentar a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 94 l de Opti-MEM medios de comunicación a cada tubo de microcentrífuga. A continuación añadimos 6 l de FuGENE 6 a los medios de Opti-MEM sin tocar la pared lateral. </li><li> Incubar la mezcla durante 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Añadir 1.2 g (desde el almacén de ADN 1mg/ml) de plásmido para la fusión de antígeno Renilla luciferase construir. Mezcla y se incuba la mezcla durante 15 minutos a temperatura ambiente. </li><li> La transferencia de la solución de ADN-FuGENE 6 Opti-MEM a las células por goteo de manera uniforme en los medios de comunicación de las células COS1. </li></ol> PARTE 2: Recolección de antígeno Renilla-Fusions <ol><li> Dos días después de la transfección, las células COS-1 se cosechan. Este se inicia con la eliminación de los medios de comunicación y luego enjuagar las células con 6 ml de PBS. Después de la decantación de la PBS, la pipeta a la basura cualquier PBS residual de la placa de cultivo de tejidos. </li><li> Añadir 1,4 ml de solución amortiguadora de lisis frío compuesto por 50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 1% Triton X-100, 50% de glicerol y los inhibidores de la proteasa (2 comprimidos de cóctel completo inhibidor miniprotease por 50 ml de tampón de lisis). Las células de la cosecha con un raspador de células y rápida transferencia de la mitad de la lisado de cada uno de dos tubos de 1,5 ml de microcentrífuga en hielo. </li><li> A Sonifier Branson 150 se utiliza para romper las celdas abiertas. Coloque el tubo de microcentrífuga que contiene el lisado celular en el hielo y el pulso durante 5 segundos, 5 segundos y 5 segundos con la configuración de ultrasonidos de 2, 2 y 4, respectivamente. </li><li> Centrifugar el lisado celular a 12.500 rpm durante dos vueltas 4 minutos a 4 ° C. Después de la primera vuelta, invertir suavemente los tubos para eliminar los restos poco adjunta de la pared lateral del tubo. Después de la segunda vuelta, transferir cuidadosamente el sobrenadante, sin alterar el sedimento, a partir de los dos tubos a un tubo de microcentrífuga nuevo en hielo. </li><li> Calcular las unidades de luz (UGM) por l de lisado. Para medir la LU, diluir 1 l de lisado con 8 l de PBS en un tubo de microcentrífuga nuevo. Directamente añadir 100 ml de sustrato coelenterazine 1X a la mezcla diluida y de inmediato medidas de luminiscencia en el tubo con un tubo luminómetro (20/20 n Turner Científico) con una lectura de 5 segundos. </li><li> Tienda el lisado Ruc-antígeno a -20 ° C durante 1-2 días o almacén para un período más largo de los tiempos en alícuotas a -80 ° C. </li></ol> PARTE 3: Preparación de una placa Sera Maestro <ol><li> Hacer una placa maestra sueros añadiendo primero 450 l de tampón A (50 mM Tris, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 1% Triton X-100) a cada pocillo de una placa de polipropileno de 96 pozos profundos de microtitulación . En este paso, un colorante rojo, fenol, también se pueden incluir en un buffer (concentración final es de 0,2 mg / ml en tampón A) para actuar como un marcador para el monitoreo futura incorporación de la muestra de suero y otras medidas del ensayo LIPS. </li><li> A continuación se añaden 50 l de suero de cada muestra a los diferentes pozos que contiene 450 l de tampón A. Nótese que esta es una dilución 1:10 de los sueros en buffer A. Por lo general los sueros no se agrega a los dos últimos pozos de la placa principal, ya esto está reservado para los espacios de amortiguación. </li><li> Antes de utilizar la placa principal, que es ampliamente sacudida (1-2 horas) en una plataforma de los rotadores. El suero de la placa principal es estableble de al menos 1 mes (o más) a 4 ° C, si se almacena correctamente para evitar la evaporación. </li><li> Como se describe más adelante, esta placa principal dispone de 10 l de suero diluido para ser eliminado debido a que en repetidas ocasiones el perfil de los sueros contra múltiples antígenos. Grandes y pequeñas placas maestras también pueden ser empleados. Sellar la placa con Parafilm y cuando no se está utilizando. </li></ol> PARTE 4: ensayo LIPS <ol><li> Polipropileno de 96 placas de microtitulación poco profundas y se utilizan para los sueros. En el primer paso, agregar 40 ml de un buffer a cada pocillo de la placa de 96 pocillos utilizando una micropipeta de 8 canales. </li><li> A continuación, tomar 10 l de suero diluido (1 l equivalente sueros) de la placa principal y añadir directamente a cada pocillo de la placa de trabajo utilizando una micropipeta de 8 canales. </li><li> Una mezcla maestra que contiene el extracto Ruc-antígeno está al lado de formularse de manera que 1 X 10 7 unidades de luz (LU) se añade en 50 l de tampón A a cada pocillo. Menos insumos (tan poco como 1 x 10 6) también se puede utilizar, pero el resultado en un menor rango dinámico. Hacer esta mezcla principal y pipeta de 50 l de mezcla de Ruc-antígeno en cada pocillo. </li><li> Se incuba la placa en un agitador rotatorio durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> Durante la incubación, añadir 5 l de una suspensión del 30% de proteína Ultralink A / G cuentas (Pierce Biotecnología, Rockford, IL) en PBS en el fondo de cada pocillo de una nueva placa de filtro de 96 HTS (Millipore, Bedford, MA) . </li><li> Después de la incubación de 1 hora, la transferencia de los 100 l Ruc antígeno-anticuerpo mezcla de reacción a 96 y placas de filtro HTS que contienen la proteína A / G a través de cuentas de una micropipeta de 8 canales. </li><li> Se incuba la placa de 96 pozos de filtro en un agitador rotatorio durante 1 hora más a temperatura ambiente. </li><li> A continuación se lava la placa de filtro en un colector de vacío. Cada pocillo se lava 8 veces con 100 l de tampón A, seguido por dos veces con 100 l de PBS. Esto se puede realizar manualmente o con una estación de trabajo pipeteo robótica. </li><li> Tras el último lavado, el vacío está apagado. Retire la placa del filtro y séquelo con una pila de toallas de papel o papel de filtro y asegúrese de eliminar la humedad en la parte superior e inferior de la placa. </li></ol> PARTE 5: análisis de medición de luminiscencia y datos Set-up: A Berthold LB 960 Centro microplaca luminómetro se utiliza para determinar la luminosidad en cada pocillo utilizando un solo inyector. Una vez que la máquina está encendida, lavar los inyectores con agua destilada H 2 O con el ciclo de lavado del inyector. Coelenterazine sustrato es preparado con el kit de Promega Renilla sustrato como se describe por el fabricante. Generalmente de 6 ml de la mezcla de sustrato coelenterazine 1X (es decir, 60 acciones coelenterazine l más 6 ml de 1X buffer) se prepara para el cebado de la máquina en funcionamiento un plato lleno de 96 pozos. Antes de analizar la placa, el LB Berthold 960 Centro microplaca luminómetro se ceba con sustrato coelenterazine 1X. Abrir un archivo de programa que contiene la configuración de la inyección del sustrato y la lectura de la placa. En estas mediciones, 50 l de sustrato coelenterazine se inyecta, la placa se agita durante 2 segundos, seguido de un 5 seg de lectura de luminiscencia. <ol><li> Aunque el luminómetro placa tiene la capacidad de leer toda la placa, una lectura parcial de la placa también puede ser seleccionado (en el menú de lectura). Iniciar el programa, que inicia la lectura de la placa. </li><li> Después de correr, quitar la placa del filtro de microtitulación con prontitud para evitar derrames en el luminómetro. Exportar los datos generados con el programa MikroWin en un formato Excel para su análisis. </li><li> Se recomienda la evaluación de los sueros de dos carreras independientes. Los datos se promedian para generar los valores título de LU para cada muestra. Estos valores aún se puede ajustar para restar los espacios de amortiguación. </li><li> Análisis de datos adicionales, tales como la determinación de la corte se puede calcular tomando la media más 3 o 5 desviaciones estándar de los valores de control. </li></ol>

<ol><li>Burbelo, P. D., Goldman, R., Mattson, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+immunoprecipitation+method+for+quantitatively+measuring+antibody+responses+in+clinical+sera+samples+by+using+mammalian-produced+Renilla+luciferase-antigen+fusion+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A simplified immunoprecipitation method for quantitatively measuring antibody responses in clinical sera samples by using mammalian-produced Renilla luciferase-antigen fusion proteins.</a> BMC Biotechnol. 5, 22-22 (2005).</li>
<li>Burbelo, P. D., Leahy, H. P., Iadarola, M. J., Nutman, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Four-Antigen+Mixture+for+Rapid+Assessment+of+Onchocerca+volvulus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">A Four-Antigen Mixture for Rapid Assessment of Onchocerca volvulus Infection.</a> PLoS Negl Trop Dis. 3, e438-e438 (2009).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+robust+luminescent+profiling+of+anti-La+and+other+autoantibodies+in+Sj+gren%E2%80%99s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Sensitive and robust luminescent profiling of anti-La and other autoantibodies in Sj gren’s syndrome.</a> Autoimmunity. 139, 241-245 (2009).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+antibody+quantification+and+generation+of+whole+proteome+antibody+response+profiles+using+LIPS+%28luciferase+immunoprecipitation+systems%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Rapid antibody quantification and generation of whole proteome antibody response profiles using LIPS (luciferase immunoprecipitation systems).</a> Biochem Biophys Res Commun. 352, 889-895 (2007).</li>
<li>Burbelo, P. D., Groot, S., Dalakas, M. C., Iadarola, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+definition+profiling+of+autoantibodies+to+glutamic+acid+decarboxylases+GAD65%2FGAD67+in+stiff-person+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">High definition profiling of autoantibodies to glutamic acid decarboxylases GAD65/GAD67 in stiff-person syndrome.</a> Biochem Biophys Res Commun. 366, 1-7 (2008).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+luminescence+assay+for+autoantibodies+to+mammalian+cell-prepared+insulinoma-associated+protein+2%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">A new luminescence assay for autoantibodies to mammalian cell-prepared insulinoma-associated protein 2.</a> Diabetes Care. 31, 1824-1826 (2008).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serological+diagnosis+of+human+herpes+simplex+virus+type+1+and+2+infections+by+luciferase+immunoprecipitation+system+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Serological diagnosis of human herpes simplex virus type 1 and 2 infections by luciferase immunoprecipitation system assay.</a> Clin Vaccine Immunol. 16, 366-371 (2009).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+quantitative+serological+detection+of+anti-cytomegalovirus+%28CMV%29+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Highly quantitative serological detection of anti-cytomegalovirus (CMV) antibodies.</a> Virol J. 6, 45-45 (2009).</li>
<li>Burbelo, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-antigen+mixture+containing+v-cyclin+for+serological+screening+of+human+herpesvirus+8+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Four-antigen mixture containing v-cyclin for serological screening of human herpesvirus 8 infection.</a> Clin Vaccine Immunol. 16, 621-627 (2009).</li>
<li>Ramanathan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+luciferase+immunoprecipitation+systems+assay+enhances+the+sensitivity+and+specificity+of+diagnosis+of+Strongyloides+stercoralis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">A luciferase immunoprecipitation systems assay enhances the sensitivity and specificity of diagnosis of Strongyloides stercoralis infection.</a> J Infect Dis. 198, 444-451 (2008).</li>
</ol>

LABIOS requiere la optimización del ensayo mínimo y, debido a su simplicidad, los datos de alta calidad por lo general se pueden generar con los labios en menos de dos semanas de cualquier antígeno dado. Los pasos que más tiempo se encuentra la clonación y la generación del vector de expresión apropiado plásmido que contenía la fusión Ruc-antígeno. Una vez que estos plásmidos se generan, los antígenos individuales o múltiples puede ser rápidamente probado con los labios como se describió anteriormente. Cabe señalar que los labios es muy versátiles, que el suero puede ser probado en un formato de tubo, o bien en una placa de microtitulación de filtro con la ayuda de una estación de trabajo robotizada Biomek 2 o un lavador de placas de filtración al vacío. Este sistema altamente escalable permite a los labios paralelos perfil de un grupo de humanos autoantígenos 3 o el proteoma completo de un 4 virus. Es probable que muchos perfiles diferentes de anticuerpos generados por los labios serán de utilidad para el diagnóstico de 3-9, antígeno de descubrimiento 9, siguiendo el curso de un tratamiento de 10, el control de vacunas y tiene amplias implicaciones para los estados específicos de la enfermedad y la salud pública en general.

<table><tbody><tr><td>Kit midi de plásmido HiSpeed</td><td>Qiagen</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular de 100 x 20 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE 6</td><td>Roche Group</td><td>1814443</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel completo de inhibidores de proteasas, versión mini</td><td>Roche Group</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos profundos de polipropileno, 1 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-566-120</td><td>Placa de pocillos profundos con tapa y sellado con Parafilm</td></tr><tr><td>Placa microtituladora de polipropileno</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-566-120</td><td></td></tr><tr><td>Placa de filtro HTS</td><td>EMD Millipore</td><td>MSBVN1B50</td><td></td></tr><tr><td>Proteína A/G inmovilizada Ultralink</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>53133 (10 ml)</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de ensayo de luciferasa de Renilla</td><td>Promega Corp.</td><td>E2820</td><td>Para 2000 ensayos</td></tr><tr><td>Luminómetro para microplacas Centro</td><td>Berthold Technologies</td><td>LB 960</td><td></td></tr></tbody></table>

perfiles de anticuerpos por los sistemas de inmunoprecipitación luciferasa (lips)

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS)

Tecnologías para la exhaustiva comprensión y cuantificación de perfiles de anticuerpos frente a autoantígenos y los agentes infecciosos pueden producir nuevos conocimientos sobre los mecanismos de la enfermedad y puede dilucidar los nuevos marcadores de la enfermedad substratify con diferentes características clínicas y comprender mejor la patogénesis. Hemos desarrollado un método altamente cuantitativa llamada luciferasa Sistemas de inmunoprecipitación (LIPS) para crear perfiles de los pacientes la respuesta de anticuerpos suero de autoantígenos y antígenos de patógenos asociados con la infección. A diferencia de las pruebas ELISA, los labios muy sensibles es fácil de implementar para estudiar los perfiles de respuesta serológica humoral a los antígenos diferentes en un formato universal y produce títulos de anticuerpos dinámica un alcance de hasta 6 log<sub&gt; 10</sub&gt; Para algunos antígenos. En estos estudios, el perfil cuantitativo por los labios del paciente la respuesta humoral contra los paneles de antígenos o incluso todo el proteoma de algunos patógenos (por ejemplo el VIH), suele ser más informativos que las pruebas de un solo antígeno por ELISA. Además, los labios también elimina el tiempo y el esfuerzo necesarios para producir antígenos altamente purificados, así como los pasos del ensayo de mano de obra necesaria para la optimización de ELISA estándar. Aquí les ofrecemos un protocolo detallado que describe los aspectos técnicos de la realización de ensayos de labios fácilmente perfiles de las respuestas de anticuerpos a los antígenos únicos o múltiples.

Los aspectos técnicos de la realización de los labios (Sistemas de luciferasa inmunoprecipitación) se describen. El enfoque general consiste en la expresión de genes quiméricos que codifican antígenos fusionados a Renilla luciferase (RUC) en células de mamíferos. Crudo Ruc-antígeno extractos son preparados y, sin purificación, empleados en ensayos de inmunoprecipitación para cuantificar anticuerpos.

Perfiles de anticuerpos por los sistemas de inmunoprecipitación luciferasa (LIPS)

Las tecnologías para comprender y cuantificar de manera exhaustiva los perfiles de anticuerpos frente a autoantígenos y agentes infecciosos pueden aportar nuevas perspectivas sobre la enfermedad...

Este video demuestra los pasos involucrados en la realización del ensayo de labios. Los antígenos se expresan en células CO una como fusiones recombinantes de luciferasa de luciérnaga o antígeno rook. Se obtienen extractos crudos y se utilizan sin purificación.El ensayo de lips comienza incubando extractos crudos de antígenos de alondra con SRA del paciente. En pocillos de microtitulación, la mezcla de anticuerpo y antígeno se transfiere luego a una placa de filtro de 96 pocillos que contiene perlas de proteína A G para capturar las moléculas de IgG tras lavar la placa de filtro que contiene las perlas de proteína AG. El antígeno de alondra unido al anticuerpo se mide mediante la adición de sustrato de linina y las unidades de luz se miden con un luminómetro.Hola, soy la Dra. Catherine Chang del Laboratorio de Biología Sensorial del Instituto Nacional de Investigación sobre la Salud Dental y Craneofacial. Hoy les mostraremos el procedimiento de los sistemas de inmunoprecipitación de luciferasa en lips. Utilizamos lips en nuestro laboratorio para medir títulos de anticuerpos con el fin de diagnosticar enfermedades y/o infecciones.Las subestratificaciones sirven para clasificar estados patológicos, monitorear la vacunación y otras aplicaciones relacionadas con la generación de perfiles de anticuerpos. Comencemos. Antes de iniciar la transfección, los plásmidos para fusiones de luciferasa de luciérnaga se preparan de antemano según se describe en el artículo de BMC Biotechnology.El ADN plasmídico BYO et al. 2005 se prepara utilizando un kit MIDI prep con un rendimiento de uno a tres miligramos y se almacena como una solución stock de un miligramo por mililitro a menos 20 grados Celsius. Las células Cost one utilizadas en la transfección se cultivan en DMEM con 10 % de suero bovino fetal siguiendo protocolos estándar de cultivo de tejidos. Un día antes de la transfección, se siembran las células Cost one en nuevas placas de 100 por 20 milímetros hasta alcanzar aproximadamente dos veces 10 a la seis células por placa y se incuban a 37 grados Celsius durante el día siguiente.Las células deben tener una confluencia del 80 al 95 %. Permita que el reactivo de transfección del gen FU6 se caliente a temperatura ambiente mientras espera a que el gen FU6 alcance la temperatura ambiente. Etiquete tubos microcentrífugos de polipropileno de 1,5 mililitros para cada ADN plasmídico que se transfectará, teniendo cuidado de no tocar las paredes laterales de los tubos. Añada seis microlitros del gen de fusión FU6 a los tubos, que ya deben contener 94 microlitros de medio óptimo, e incube durante cinco minutos. A temperatura ambiente, añada uno a dos microgramos del plásmido del constructo de fusión del antígeno ran Lucifer, mezcle invirtiendo el tubo varias veces, centrifugue brevemente e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos.Transfiera toda la solución óptima de fusión de ADN a las células goteándola uniformemente en el medio de los cos. Incube las células transfectadas de los cos durante dos días y luego realice la recolección. Para comenzar la recolección de la proteína de fusión, retire el medio y lave las células con seis mililitros de PBS.Extraiga cualquier residuo de PBS del recipiente de cultivo celular, agregue 1.4 mililitros de tampón de lisis frío y recoga las células con un raspador celular; luego transfiera rápidamente la mitad del lisado a cada uno de dos tubos microcentrífugos de 1.5 mililitros sobre hielo. Se utiliza un Branson SOLIDIFIER one 50 para romper las células. Coloque el tubo de microcentrífuga que contiene el lisado celular sobre hielo y aplique pulsos durante cinco segundos.Cinco segundos y cinco segundos. Con configuraciones de sonicación de dos, dos y cuatro, respectivamente. Centrifugar el lisado celular a 12,500 RPM durante dos minutos y cuatro segundos.Centrifugar a cuatro grados Celsius. Invertir suavemente los tubos entre cada centrifugación para eliminar los restos sueltos de las paredes del tubo. Luego, transferir cuidadosamente el sobrenadante, sin perturbar el precipitado, desde los dos tubos a un nuevo tubo microfuga sobre hielo.Para medir las unidades de luz o lu del lisado, diluya un microlitro de lisado con ocho microlitros de PBS en un nuevo tubo microcentrífugo; a continuación, agregue directamente 100 microlitros de un sustrato de luciferina al lisado diluido y mida inmediatamente la luminiscencia en el tubo utilizando un luminómetro de tubos con una lectura de cinco segundos. A partir de este paso, recuerde usar precauciones de seguridad al trabajar con muestras S humanas y animales. Para preparar una placa matriz de suero, que será la fuente de anticuerpos de pacientes para el perfilado de antígenos, primero agregue 450 microlitros del tampón A a cada pocillo de una placa microlitera de polipropileno de 96 pocillos profundos.En este paso, también se puede incluir el colorante rojo de fenol en el tampón A para actuar como un trazador en el seguimiento de futuras ediciones de la muestra de SRA y otros pasos del ensayo de labios. A continuación, añada 50 microlitros de suero de cada muestra a cada pocillo que contiene 450 microlitros de tampón. Una nota: esta es una dilución uno a diez de la SRA en tampón.Normalmente, no se añade SRA a los dos últimos pocillos de la placa maestra porque estos están reservados para los blancos de tampón antes de almacenar la placa maestra para su uso futuro. Se agita extensamente durante una a dos horas en una plataforma rotatoria. A 650 RPM, el suero es estable durante al menos un mes o más a cuatro grados Celsius, y la placa puede sellarse con parafina para prevenir la evaporación si se almacenará antes de realizar el ensayo de lips. Organice una hoja de cálculo que contenga los números de identificación de las muestras y sus pocillos asociados en la placa maestra. Se utilizan placas microtituladoras de polipropileno de 96 pocillos poco profundos como placas de trabajo para probar los sueros.En el primer paso, agregue 40 microlitros de tampón A a cada pocillo de la placa de 96 pocillos utilizando una micropipeta de ocho canales. A continuación, tome 10 microlitros de suero diluido de la placa maestra y añádalos directamente a cada pocillo de la placa de trabajo usando una micropipeta de ocho canales. Después de su uso, selle la placa maestra con parafilm, coloque nuevamente la tapa sobre la placa maestra, cúbrala con envoltura de plástico y almacénela a cuatro grados Celsius.Se prepara a continuación una mezcla maestra que contiene el extracto de antígeno de rook, formulada de manera que se añada un veces 10 a la séptima lu en 50 microlitros de tampón A a cada pozo. Prepare esta mezcla maestra y pipetee 50 microlitros de la mezcla de antígeno de rook en cada pozo. Cubra la placa con una tapa de poliestireno y incube en un agitador rotatorio a 100 RPM durante una hora.A temperatura ambiente durante la incubación, retire un alícuota de 1,5 mililitros de una suspensión al 30 % de perlas de proteína Ag ultra ligadas en PBS del refrigerador. Añada cinco microlitros al fondo de cada pocillo de una nueva placa HTS de filtro de 96 pocillos. Después de la incubación de la placa durante una hora, transfiera la mezcla de reacción de anticuerpo con antígeno de 100 microlitros a las placas de filtro HTS de 96 pocillos que contienen las perlas de proteína Ag utilizando una micropipeta de canal A. Incube la placa de filtro de 96 pocillos en un agitador rotatorio durante una hora adicional a 100 RPM a temperatura ambiente.A continuación, lave la placa de filtro utilizando una estación de trabajo automatizada Biome FX con un manifold de vacío; cada pocillo se lava ocho veces con 100 microlitros de tampón A, seguido de dos lavados con 100 microlitros de PBS. Tras el último lavado, se apaga el vacío. Retire la placa de filtro y séquela presionando suavemente sobre una pila de toallas de papel o papel de filtro, asegurándose de eliminar la humedad de la parte superior e inferior de la placa. Se utiliza un luminómetro Burt hold LB nine 60 Centro Microplate para determinar la luminiscencia en cada pocillo de la placa.Encienda la máquina y enjuague el inyector con agua destilada. Para cebado y funcionamiento de la máquina se utiliza el sustrato INE mediante el ciclo de lavado del inyector, y se prepara utilizando el kit de sustrato ranil de Promega siguiendo las instrucciones del fabricante; normalmente se necesitan seis mililitros de una mezcla de sustrato de excelente calidad para una placa. Cargue la mezcla de sustrato en el luminómetro y abra un archivo de programa que contenga la configuración para inyectar el sustrato y leer la placa.Para estas mediciones, se inyectan 50 microlitros de sustrato de soina. La placa se agita durante dos segundos, seguido de una lectura de luminiscencia de cinco segundos.Inicie el programa que comienza la lectura de la placa tras el ensayo y retire de inmediato la placa de filtro microtitulación para evitar derrames en el luminómetro. Los datos se exportan automáticamente desde el programa microwind a un formato Excel para su análisis posterior. Promedie los resultados de dos ensayos diferentes con los mismos sueros.Con el fin de generar valores de título lu para cada muestra, se recomienda hacerlo. Las muestras duplicadas deben mostrar una alta concordancia en los valores de título entre las dos corridas. Para la representación gráfica de los datos, los valores de título lu pueden ajustarse aún más restando los blancos de tampón, como se muestra aquí.La sensibilidad y especificidad del ensayo también se pueden calcular utilizando puntos de corte derivados de la media más tres o cinco desviaciones estándar de las muestras de control. Acabamos de mostrarle cómo medir títulos de anticuerpos utilizando LIPS; LIPS requiere una optimización mínima del ensayo y, debido a su simplicidad, puede utilizarse para generar datos de alta calidad en menos de dos semanas para cualquier antígeno dado. Al trabajar con suero humano, es importante recordar tomar las precauciones de seguridad adecuadas.Y tenga en cuenta que lifts es altamente escalable y, por ello, puede utilizarse para medir un pequeño número de muestras mediante lavado manual o una placa completa usando una estación de trabajo robótica. Debido a esta versatilidad, consideramos que lips será muy útil en el análisis seroantigénico y tendrá amplias implicaciones en el análisis de enfermedades y en la salud pública en general. Bueno, eso es todo. Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos de perfilado de anticuerpos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Un ELISA se puede convertir fácilmente a un ensayo de Luminex xMAP y, a través de los beneficios de anticuerpos de multiplexación, varios pueden ser examinados simultáneamente para identificar un par de anticuerpos óptima, dando lugar a una mayor sensibilidad y rango dinámico, mientras que reduce el coste del ensayo.

La conversión de un ELISA de captura para un ensayo de Luminex xMAP utilizando un anticuerpo Multiplex Método de detección

El video muestra el ensayo de luciferasa utilizado para cuantificar proteínas marcadas con luciferasa. El ensayo utiliza una enzima luciferasa modificada genéticamente compuesta por un fragmento grande que se une con el fragmento pequeño, que se conjuga con una proteína de interés. Las subunidades unidas forman una enzima activa que, en presencia del sustrato, libera una señal luminiscente. A continuación, esta señal se cuantifica mediante un luminómetro.

El ensayo de luciferasa: un ensayo de alto rendimiento para medir señales luminiscentes utilizando bioreporteros basados en sistemas de nanoluciferasa de ingeniería

Este vídeo demuestra el uso del ensayo ELISpot para evaluar la función de los linfocitos B secretores de anticuerpos, ASCs. Los anticuerpos secretados por las ASC interactúan con los fragmentos de anticuerpos policlonales unidos a la membrana, que son detectados por los anticuerpos IgG o IgM conjugados con enzimas. La mancha de color producida en cada pocillo indica la presencia del isotipo del anticuerpo específico, que se correlaciona con la actividad secretora de las células B.

Evaluación funcional de linfocitos B secretores de anticuerpos mediante el ensayo ELISpot

La sangre periférica humana se utiliza habitualmente para la evaluación de la respuesta inmunitaria humoral. En este trabajo, se describen los métodos para aislar las células B humanas de la sangre periférica, diferenciar las células B humanas en células B secretoras de anticuerpos (Ab) en cultivo y enumerar el total de IgM- e IgG-ASC mediante un ensayo ELISpot.

El aislamiento, diferenciación y cuantificación de Human secretoras de anticuerpos células B de sangre: ELISpot como una lectura funcional de la inmunidad humoral

Las interacciones proteína-proteína pueden ocurrir tanto en el núcleo como en el citoplasma de una célula. Para investigar estas interacciones, se aplica la coinmunoprecipitación tradicional y el ensayo moderno de ligadura de proximidad. En este estudio, comparamos estos dos métodos para visualizar la distribución de las interacciones NF90-RBM3 en el núcleo y el citoplasma.

La visualización de la interacción proteína-proteína en las fracciones nucleares y citoplasmáticas de Co-inmunoprecipitación y<em&gt; In Situ</em&gt; Ligadura ensayo de proximidad

Se demuestra un inmunoensayo de capilar usando una plataforma comercial para medir las proteínas blanco de preparaciones de proteínas totales. Además, parámetros de ensayo del tiempo de exposición, concentración y dilución de anticuerpo están optimizados para un sistema de modelo de cultivo celular.

Procedimiento y estrategias clave de la optimización para un método de inmunoensayo de basadas en electroforesis capilar automatizado

Aquí, mostramos cómo hacer un análisis de proximidad de la ligadura (PLA) visualizar heterodimerization MST1/MST2 en células fijas con alta sensibilidad.

Detección de Heterodimerization de isoformas de la proteína usando un análisis de ligadura in Situ proximidad

Aquí presentamos un biosensor basado en luciferase para cuantificar la actividad quinasa de supresor de tumor grande (LATS)-una quinasa central en la vía de señalización de hipopótamo. Este biosensor tiene diversas aplicaciones en investigación básica y traslacional destinada a investigar Hippo vía reguladores en vitro e in vivo.

Monitoreo de Hippo señalización vía actividad utilizando un Biosensor de luciferasa basado gran Tumor supresor (LATS)

El método BSelex para identificar y recuperar anticuerpos específicos de antígenos individuales de células mononucleares de sangre periférica humana combina citometría de flujo con PCR de una sola célula y clonación.

Método de cribado de una sola célula para la selección y recuperación de anticuerpos con especificidades deseadas de poblaciones de células B de memoria humana enriquecidas

El protocolo descrito describe el procedimiento para producir el complejo de proteínas de dominio de unión al receptor HiBiT y su aplicación para la detección rápida y sensible de anticuerpos contra el SARS-CoV-2.

Detección de anticuerpos de dominio de unión al receptor SARS-CoV-2 mediante un bioinformador basado en HiBiT

Aprende a realizar perfiles de anticuerpos mediante LIPS en células COS-1 con luciferasa Renilla. Este método eficiente permite cuantificar anticuerpos sin purificación de extractos crudos para diagnóstico.

Perfiles de anticuerpos por los sistemas de inmunoprecipitación luciferasa (LIPS)

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