Perfiles de anticuerpos por los sistemas de inmunoprecipitación luciferasa (LIPS)

Este video demuestra los pasos involucrados en la realización del ensayo de labios. Los antígenos se expresan en células CO una como fusiones recombinantes de luciferasa de luciérnaga o antígeno rook. Se obtienen extractos crudos y se utilizan sin purificación.

El ensayo de lips comienza incubando extractos crudos de antígenos de alondra con SRA del paciente. En pocillos de microtitulación, la mezcla de anticuerpo y antígeno se transfiere luego a una placa de filtro de 96 pocillos que contiene perlas de proteína A G para capturar las moléculas de IgG tras lavar la placa de filtro que contiene las perlas de proteína AG. El antígeno de alondra unido al anticuerpo se mide mediante la adición de sustrato de linina y las unidades de luz se miden con un luminómetro.

Hola, soy la Dra. Catherine Chang del Laboratorio de Biología Sensorial del Instituto Nacional de Investigación sobre la Salud Dental y Craneofacial. Hoy les mostraremos el procedimiento de los sistemas de inmunoprecipitación de luciferasa en lips. Utilizamos lips en nuestro laboratorio para medir títulos de anticuerpos con el fin de diagnosticar enfermedades y/o infecciones.

Las subestratificaciones sirven para clasificar estados patológicos, monitorear la vacunación y otras aplicaciones relacionadas con la generación de perfiles de anticuerpos. Comencemos. Antes de iniciar la transfección, los plásmidos para fusiones de luciferasa de luciérnaga se preparan de antemano según se describe en el artículo de BMC Biotechnology.

El ADN plasmídico BYO et al. 2005 se prepara utilizando un kit MIDI prep con un rendimiento de uno a tres miligramos y se almacena como una solución stock de un miligramo por mililitro a menos 20 grados Celsius. Las células Cost one utilizadas en la transfección se cultivan en DMEM con 10 % de suero bovino fetal siguiendo protocolos estándar de cultivo de tejidos. Un día antes de la transfección, se siembran las células Cost one en nuevas placas de 100 por 20 milímetros hasta alcanzar aproximadamente dos veces 10 a la seis células por placa y se incuban a 37 grados Celsius durante el día siguiente.

Las células deben tener una confluencia del 80 al 95 %. Permita que el reactivo de transfección del gen FU6 se caliente a temperatura ambiente mientras espera a que el gen FU6 alcance la temperatura ambiente. Etiquete tubos microcentrífugos de polipropileno de 1,5 mililitros para cada ADN plasmídico que se transfectará, teniendo cuidado de no tocar las paredes laterales de los tubos. Añada seis microlitros del gen de fusión FU6 a los tubos, que ya deben contener 94 microlitros de medio óptimo, e incube durante cinco minutos. A temperatura ambiente, añada uno a dos microgramos del plásmido del constructo de fusión del antígeno ran Lucifer, mezcle invirtiendo el tubo varias veces, centrifugue brevemente e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos.

Transfiera toda la solución óptima de fusión de ADN a las células goteándola uniformemente en el medio de los cos. Incube las células transfectadas de los cos durante dos días y luego realice la recolección. Para comenzar la recolección de la proteína de fusión, retire el medio y lave las células con seis mililitros de PBS.

Extraiga cualquier residuo de PBS del recipiente de cultivo celular, agregue 1.4 mililitros de tampón de lisis frío y recoga las células con un raspador celular; luego transfiera rápidamente la mitad del lisado a cada uno de dos tubos microcentrífugos de 1.5 mililitros sobre hielo. Se utiliza un Branson SOLIDIFIER one 50 para romper las células. Coloque el tubo de microcentrífuga que contiene el lisado celular sobre hielo y aplique pulsos durante cinco segundos.

Cinco segundos y cinco segundos. Con configuraciones de sonicación de dos, dos y cuatro, respectivamente. Centrifugar el lisado celular a 12,500 RPM durante dos minutos y cuatro segundos.

Centrifugar a cuatro grados Celsius. Invertir suavemente los tubos entre cada centrifugación para eliminar los restos sueltos de las paredes del tubo. Luego, transferir cuidadosamente el sobrenadante, sin perturbar el precipitado, desde los dos tubos a un nuevo tubo microfuga sobre hielo.

Para medir las unidades de luz o lu del lisado, diluya un microlitro de lisado con ocho microlitros de PBS en un nuevo tubo microcentrífugo; a continuación, agregue directamente 100 microlitros de un sustrato de luciferina al lisado diluido y mida inmediatamente la luminiscencia en el tubo utilizando un luminómetro de tubos con una lectura de cinco segundos. A partir de este paso, recuerde usar precauciones de seguridad al trabajar con muestras S humanas y animales. Para preparar una placa matriz de suero, que será la fuente de anticuerpos de pacientes para el perfilado de antígenos, primero agregue 450 microlitros del tampón A a cada pocillo de una placa microlitera de polipropileno de 96 pocillos profundos.

En este paso, también se puede incluir el colorante rojo de fenol en el tampón A para actuar como un trazador en el seguimiento de futuras ediciones de la muestra de SRA y otros pasos del ensayo de labios. A continuación, añada 50 microlitros de suero de cada muestra a cada pocillo que contiene 450 microlitros de tampón. Una nota: esta es una dilución uno a diez de la SRA en tampón.

Normalmente, no se añade SRA a los dos últimos pocillos de la placa maestra porque estos están reservados para los blancos de tampón antes de almacenar la placa maestra para su uso futuro. Se agita extensamente durante una a dos horas en una plataforma rotatoria. A 650 RPM, el suero es estable durante al menos un mes o más a cuatro grados Celsius, y la placa puede sellarse con parafina para prevenir la evaporación si se almacenará antes de realizar el ensayo de lips. Organice una hoja de cálculo que contenga los números de identificación de las muestras y sus pocillos asociados en la placa maestra. Se utilizan placas microtituladoras de polipropileno de 96 pocillos poco profundos como placas de trabajo para probar los sueros.

En el primer paso, agregue 40 microlitros de tampón A a cada pocillo de la placa de 96 pocillos utilizando una micropipeta de ocho canales. A continuación, tome 10 microlitros de suero diluido de la placa maestra y añádalos directamente a cada pocillo de la placa de trabajo usando una micropipeta de ocho canales. Después de su uso, selle la placa maestra con parafilm, coloque nuevamente la tapa sobre la placa maestra, cúbrala con envoltura de plástico y almacénela a cuatro grados Celsius.

Se prepara a continuación una mezcla maestra que contiene el extracto de antígeno de rook, formulada de manera que se añada un veces 10 a la séptima lu en 50 microlitros de tampón A a cada pozo. Prepare esta mezcla maestra y pipetee 50 microlitros de la mezcla de antígeno de rook en cada pozo. Cubra la placa con una tapa de poliestireno y incube en un agitador rotatorio a 100 RPM durante una hora.

A temperatura ambiente durante la incubación, retire un alícuota de 1,5 mililitros de una suspensión al 30 % de perlas de proteína Ag ultra ligadas en PBS del refrigerador. Añada cinco microlitros al fondo de cada pocillo de una nueva placa HTS de filtro de 96 pocillos. Después de la incubación de la placa durante una hora, transfiera la mezcla de reacción de anticuerpo con antígeno de 100 microlitros a las placas de filtro HTS de 96 pocillos que contienen las perlas de proteína Ag utilizando una micropipeta de canal A. Incube la placa de filtro de 96 pocillos en un agitador rotatorio durante una hora adicional a 100 RPM a temperatura ambiente.

A continuación, lave la placa de filtro utilizando una estación de trabajo automatizada Biome FX con un manifold de vacío; cada pocillo se lava ocho veces con 100 microlitros de tampón A, seguido de dos lavados con 100 microlitros de PBS. Tras el último lavado, se apaga el vacío. Retire la placa de filtro y séquela presionando suavemente sobre una pila de toallas de papel o papel de filtro, asegurándose de eliminar la humedad de la parte superior e inferior de la placa. Se utiliza un luminómetro Burt hold LB nine 60 Centro Microplate para determinar la luminiscencia en cada pocillo de la placa.

Encienda la máquina y enjuague el inyector con agua destilada. Para cebado y funcionamiento de la máquina se utiliza el sustrato INE mediante el ciclo de lavado del inyector, y se prepara utilizando el kit de sustrato ranil de Promega siguiendo las instrucciones del fabricante; normalmente se necesitan seis mililitros de una mezcla de sustrato de excelente calidad para una placa. Cargue la mezcla de sustrato en el luminómetro y abra un archivo de programa que contenga la configuración para inyectar el sustrato y leer la placa.

Para estas mediciones, se inyectan 50 microlitros de sustrato de soina. La placa se agita durante dos segundos, seguido de una lectura de luminiscencia de cinco segundos.

Inicie el programa que comienza la lectura de la placa tras el ensayo y retire de inmediato la placa de filtro microtitulación para evitar derrames en el luminómetro. Los datos se exportan automáticamente desde el programa microwind a un formato Excel para su análisis posterior. Promedie los resultados de dos ensayos diferentes con los mismos sueros.

Con el fin de generar valores de título lu para cada muestra, se recomienda hacerlo. Las muestras duplicadas deben mostrar una alta concordancia en los valores de título entre las dos corridas. Para la representación gráfica de los datos, los valores de título lu pueden ajustarse aún más restando los blancos de tampón, como se muestra aquí.

La sensibilidad y especificidad del ensayo también se pueden calcular utilizando puntos de corte derivados de la media más tres o cinco desviaciones estándar de las muestras de control. Acabamos de mostrarle cómo medir títulos de anticuerpos utilizando LIPS; LIPS requiere una optimización mínima del ensayo y, debido a su simplicidad, puede utilizarse para generar datos de alta calidad en menos de dos semanas para cualquier antígeno dado. Al trabajar con suero humano, es importante recordar tomar las precauciones de seguridad adecuadas.

Y tenga en cuenta que lifts es altamente escalable y, por ello, puede utilizarse para medir un pequeño número de muestras mediante lavado manual o una placa completa usando una estación de trabajo robótica. Debido a esta versatilidad, consideramos que lips será muy útil en el análisis seroantigénico y tendrá amplias implicaciones en el análisis de enfermedades y en la salud pública en general. Bueno, eso es todo. Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos de perfilado de anticuerpos.