Primer captura Extensión: Secuencia de recuperación selectiva de las fuentes de ADN muy degradado

Este video explica la técnica de captura por extensión de cebadores o PECA, que permite la recuperación dirigida de secuencias de ADN a partir de fuentes de ADN altamente fragmentadas con un número extremadamente bajo de copias. Hemos utilizado esta técnica para secuenciar genomas mitocondriales completos de huesos de neandertales con más de 40 000 años de antigüedad, y el método puede emplearse para capturar cualquier región diana pequeña o polimorfismos de un solo nucleótido, y a partir de muchos individuos. Los pasos principales de este procedimiento son la amplificación por PCR de una biblioteca primaria de ADN, la cuantificación de la biblioteca amplificada mediante PCR cuantitativa, la extensión primaria sobre la biblioteca amplificada, la captura en perlas de los productos de extensión primaria para eliminar fragmentos no diana, y la elución y secuenciación de los objetivos capturados y lavados.

Hola, soy Adrian Briggs del laboratorio de Shanti Payable en el Departamento de Genética del Instituto Max Plank de Antropología Evolutiva en Leipzig. Hoy les mostraremos un procedimiento para aislar secuencias específicas de ADN de interés a partir de una fuente compleja y altamente degradada de ADN, como huesos antiguos. Hemos utilizado este procedimiento para estudiar la diversidad genética mitocondrial de Homo neanderthalensis o hombre de Neandertal.

Comencemos. El ADN utilizado en nuestro experimento proviene de huesos de neandertales de entre 40.000 y 70.000 años de antigüedad, hallados en diversos yacimientos a lo largo del rango geográfico de los neandertales. Primero, se expone el hueso durante toda una noche a luz ultravioleta para descontaminar la superficie de cualquier ADN extraño.

Se utiliza un taladro fino para producir entre 100 y 500 miligramos de polvo óseo. El ADN se extrae del polvo óseo mediante un procedimiento descrito en el artículo de 2007 «Comparación y optimización de la extracción de ADN antiguo» de Nadine Rockland y Michael Hof.Writer. A continuación, el extracto de ADN se convierte en una biblioteca de secuenciación mediante la adición de sitios cebadores universales en los extremos de todos los fragmentos de ADN, ya que una biblioteca 4 5 4 generada a partir de un hueso de Neandertal contiene solo cantidades mínimas de ADN, a veces apenas unos pocos picogramos. Esta biblioteca de ADN primaria se amplifica primero mediante PCR utilizando cebadores de PCR en emulsión que corresponden a los cebadores universales de la biblioteca.

Para preparar la mezcla de PCR para la amplificación de la biblioteca, combine los siguientes reactivos en un tubo de PCR: use 10 microlitros de tampón PCR 10 X GAMP, dos microlitros de cloruro de magnesio, dos microlitros de BSA, un microlitro de mezcla de dNTP, tres microlitros de cada uno de los cebadores MPCR 4.54 forward y reverse, un microlitro de polimerasa AmpliTaq Gold DNA, 25 microlitros de la plantilla de la biblioteca. Y finalmente, agregue 45 microlitros de agua libre de nucleasas para obtener un volumen total de 100 microlitros. La polimerasa AmpliTaq Gold DNA es estable a temperatura ambiente, por lo que no es necesario trabajar sobre hielo.

Después de preparar la reacción de PCR, coloque el tubo de PCR en un termociclador comenzando con una etapa de desnaturalización de 95 grados Celsius durante 12 minutos, seguida de 14 ciclos de 95 grados Celsius durante 30 segundos, 60 grados Celsius durante un minuto y 72 grados Celsius durante un minuto. Al final de estos 14 ciclos, establezca un paso final de cinco minutos a 72 grados Celsius, tras lo cual el tubo de PCR puede mantenerse indefinidamente a 10 grados Celsius hasta que esté listo para su uso después de completarse la amplificación por PCR, seguido de la purificación del producto de PCR utilizando una columna giratoria Kyogen MinLu según las instrucciones del fabricante; eluya el ADN de la columna con 50 microlitros de tampón EB suministrado con el kit MinLu antes de la extensión primaria y la captura del producto.

Se debe realizar una PCR cuantitativa en alícuotas de las bibliotecas no amplificadas y amplificadas con el fin de cuantificar y verificar la calidad del producto de la biblioteca amplificada. La biblioteca amplificada en 14 ciclos debe contener varios miles de veces más ADN que la biblioteca primaria. Si no es así, deben verificarse y repetirse las condiciones de amplificación.

Los cebadores de captura de extensión primaria, que se utilizarán para capturar las secuencias de interés de la biblioteca amplificada, deben diseñarse como cebadores normales de PCR para que coincidan con una región diana deseada con una temperatura de fusión ideal de 60 grados Celsius en el extremo cinco prima de cada una de estas secuencias diana en esta secuencia de cola de 12 bases, e incluir un residuo de biotina en el extremo cinco prima. Hasta 150 cebadores PEC pueden usarse juntos en una mezcla multiplex única preparada a partir de soluciones madre de 200 micromolares. Para la reacción de extensión primaria, prepare una mezcla de PCR en un tubo de PCR adecuado añadiendo cinco microlitros de tampón PCR 10 X GAMP, dos microlitros de cloruro de magnesio, un microlitro de BSA, 0,5 microlitros de dNTP, cinco microlitros de la mezcla de cebadores de captura de extensión primaria, 0,5 microlitros de ADN polimerasa tack gold, dos microlitros de ADN de la biblioteca amplificada en 14 ciclos y, finalmente, 31 microlitros de agua de grado PCR para obtener un volumen total de 50 microlitros.

Si la plantilla de la biblioteca amplificada contiene más de una vez 10 a la 12 copias por microlitro, primero se debe diluir con tampón EB para que no se añadan más de dos veces 10 a la 12 copias a la mezcla de reacción. Después de preparar el tubo de PCR, colóquelo en el termociclador y configúrelo para un único ciclo de reacción. Comience con una desnaturalización de 12 minutos a 95 grados Celsius, seguida de un minuto a 60 grados Celsius y cinco minutos a 72 grados Celsius para la extensión primaria.

Y cuando el ciclo único haya finalizado, mantener el producto de PCR a 72 grados Celsius hasta el siguiente paso. Con el fin de evitar el apareamiento inespecífico de cebadores y capturar directamente, añadir 150 microlitros de tampón PBI o PB del kit de purificación Kyogen Ute a los tubos de reacción de PCR, mientras la mezcla de reacción permanece en el termociclador mantenido a 72 grados Celsius. Al hacer esto, se inactiva la polimerasa mientras la temperatura es demasiado alta para la extensión inespecífica de los cebadores diana; cierre los tubos, vortexéelos brevemente y luego centrifugue brevemente con una centrífuga de banco para precipitar el líquido.

Utilice únicamente tampón PBI o PB en este paso, ya que otros tampones de unión como el Qiagen PM Buffer pueden interferir con el proceso de captura posterior. A continuación, retire la mezcla del tubo de PCR y transfiérala a una columna giratoria Rogen MinLu para su purificación según las instrucciones del fabricante; como se ha realizado previamente, eluya el ADN de la columna con 30 microlitros del tampón EB suministrado con el kit MinLu. Con el fin de eliminar todos los fragmentos que no se han hibridado con los cebadores PEC, se realiza un paso de captura basado en perlas.

Primero, resuspenda una solución stock de M 270 dividiendo la tira en perlas mediante vortex y retire una cantidad de perlas equivalente a 25 microlitros por muestra. Lave las perlas dos veces con 500 microlitros de tampón BW dos veces y resuspenda en el mismo volumen de BW dos veces que el volumen original de perlas tomado. Prepare 25 microlitros de la suspensión.

Para cada muestra, agregue 25 microlitros del ADN eluido y purificado a 25 microlitros de la suspensión de perlas, guardando los cinco microlitros restantes para la cuantificación posterior. Mezcle el ADN y la suspensión de perlas pipeteando hacia arriba y hacia abajo y agitando con la punta perpet, luego rote lentamente en un rotador de banco durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de la mezcla, transfiera el contenido a un tubo PCR fresco de 1,5 mililitros.

Durante el paso anterior de incubación con rotación, algo de ADN no diana puede haberse adherido a la pared del tubo. Por lo tanto, transferir la suspensión de perlas a un nuevo tubo evita la posibilidad de que este ADN no diana se libere en los productos finales. Durante el paso de elución térmica, utilice el colector de partículas magnéticas para pelotar las perlas; después de 10 a 20 segundos, todas las perlas habrán migrado a la pared, dejando un sobrenadante claro que debe eliminarse para lavar las perlas. Añada 500 microlitros de tampón BW al 1× al tubo y vortexee durante aproximadamente tres segundos a velocidad lenta.

Una vez con el tubo en posición vertical y otra con el tubo invertido, no deben quedar perlas adheridas a la pared del tubo. Utilizando una centrífuga de banco, centrifugar la suspensión durante uno a tres segundos, solo el tiempo suficiente para retirar todo el líquido de las paredes del tubo. Regrese el tubo al MPC y espere de 10 a 20 segundos hasta que todas las perlas se acumulen en un lado del tubo.

Luego retire el sobrenadante SUP. La primera lavada ya está completa. Repita este procedimiento otras cuatro veces tras la última lavada con BW y la eliminación del sobrenadante.

Añada 500 microlitros de tampón de lavado caliente una vez. Mezcle la suspensión mediante vortexado breve y centrifugado como antes, luego agite el tubo durante dos minutos a 65 grados Celsius en un agitador térmico a 1000 RPM tras un breve centrifugado, eliminando los restos de sobrenadante dentro de un minuto tras retirarlo del bloque térmico. Este paso eliminará los fragmentos que podrían estar unidos a los cebadores PEC, pero que no se extendieron en el paso de extensión del cebador. Re_suspenda el precipitado en 30 microlitros de tampón EB y transfiera la mezcla a un tubo PCR fresco de 1,5 mililitros.

Incube el tubo en el termociclador a 95 grados Celsius durante tres minutos. Pelote las perlas en el colector de partículas magnéticas. Debe tardar de 10 a 20 segundos para que el sobrenadante se aclare completamente; retire entonces el sobrenadante S y colóquelo en un tubo nuevo etiquetado.

Teniendo cuidado de no transferir ninguna perla. Conservar el sobrenadante, que contiene el producto capturado de fragmentos de ADN. Las perlas pueden descartarse en esta etapa.

Para amplificar el producto capturado, prepare una mezcla de PCR con un volumen total de 100 microlitros como se hizo en la parte dos y realice las mismas condiciones de ciclado de PCR. Nuevamente, una vez completada la amplificación por PCR del producto capturado, purifíquelo utilizando una columna para centrifugación Qiagen Ute tal como se realizó previamente en la sección dos, y eluya el ADN de la columna con 50 microlitros de tampón Eeb. El producto ya está listo para secuenciación de alto rendimiento. Diseñamos 574 cebadores PEC para cubrir todo el genoma mitocondrial de Neandertal.

Dividimos estos en cuatro mezclas multiplex y dos rondas seriales de captura por extensión primaria en bibliotecas de cinco fósiles de Neandertal procedentes de cuatro yacimientos distribuidos por Eurasia, con edades comprendidas entre 40 000 y 70 000 años, generando entre 170 000 y 500 000 secuencias por individuo y alineando los resultados con una secuencia de referencia mitocondrial. Descubrimos que el procedimiento PEC había enriquecido masivamente el ADN mitocondrial, logrando una cobertura completa a lo largo del ADN mitocondrial para cada individuo, con un promedio de entre 18 y 56,3 veces la cobertura. Con estos resultados, pudimos generar una secuencia de genoma mitocondrial completo de alta calidad para cada individuo.

A continuación, realizamos una comparación filogenética de estas secuencias con una muestra mundial de seres humanos actuales y nuestros parientes vivos más cercanos, el chimpancé y el bonobo. Esto confirmó hallazgos previos de que el ADN mitocondrial de Neandertal está estrechamente relacionado, pero es claramente distinto del de los humanos modernos. Además, la comparación entre las propias secuencias de Neandertal reveló una diversidad genética extremadamente baja en los Neandertales, inferior a la observada entre los humanos actuales en todo el mundo y similar a la de los europeos contemporáneos.

Esta evidencia, combinada con un análisis de la evolución proteica en las secuencias de neandertales, sugiere que los neandertales tuvieron un tamaño poblacional pequeño a largo plazo, lo cual es consistente con la evidencia arqueológica que indica que la densidad poblacional de los neandertales nunca alcanzó los niveles logrados por los seres humanos modernos. Acabamos de mostrarle cómo realizar la captura por extensión en primates para amplificar y capturar secuencias diana en preparación para la secuenciación de alto rendimiento. Al seguir este procedimiento, es importante respetar todas las especificaciones de temperatura en el termociclador, pero tenga en cuenta que los cebadores pueden tener temperaturas de hibridación diferentes, por lo que podría ser necesario ajustar la temperatura de hibridación según los cebadores específicos utilizados, y tener cuidado durante todos los pasos de lavado para eliminar la mayor cantidad posible de líquido.

Así que gracias por vernos y mucha suerte con sus experimentos.