La encapsulación celular en hidrogeles 3D para ingeniería de tejidos

El proceso paso a paso para encapsular células comienza con la preparación y esterilización de moldes de hidrogel y otros materiales, seguido del aislamiento de las células en poblaciones individuales, en tubos para cada juego de gel. A continuación, se realiza la ación en presencia de células, seguida del período de incubación in vitro o in vivo. El análisis posterior del comportamiento celular puede incluir pruebas de viabilidad, morfología, proliferación y diferenciación.

Hola Amidio Kahan del laboratorio del Dr. Jason Burdick en el Departamento de Bioingeniería de la Universidad de Pensilvania. Hoy te mostraremos un procedimiento de encapsulación celular en hidrogeles 3D para la ingeniería de tejidos. Utilizamos este procedimiento para estudiar los efectos de la composición y estructura del hidrogel en el comportamiento de las células encapsuladas.

Así que comencemos. Para comenzar este procedimiento, prepare una solución al 0,5% en peso del fotoiniciador de curado por aire 2 9 5 9 o I 2 9 5 9 en PBS. Mezclar e incubar durante dos o tres días en la oscuridad a 37 grados centígrados.

Cuando esté listo, use un filtro de jeringa para esterilizar la solución y guárdela a temperatura ambiente. A continuación, utilice un programa de hoja de cálculo como Microsoft Excel para calcular la cantidad de polímero y reticulante necesaria demostrada. Aquí se encuentra el ácido hialurónico funcionalizado con grupos reactivos de acrilato.

Calcule también la cantidad del péptido penant que contiene el dominio adhesivo funcional con el aminoácido cistina, arginina, glicina y aspartato. La cistina es para adherirse al polímero. Ahora que se determinaron las cantidades requeridas de reticulante de polímero y pent, péselos y colóquelos en un tubo de einor.

Ajuste la hoja de cálculo según corresponda. Para la masa real de polímero obtenida, proceda a preparar moldes de gel. Use una hoja de afeitar para cortar las puntas de la estéril envuelta individualmente.

Jeringas desechables de un mililitro. Asegúrese de que se haga un corte plano para los moldes que se utilizarán para el patrón fotográfico de los geles. Por último, esterilice los moldes de la jeringa, los tubos EOR con las tapas abiertas y cualquier otro material necesario colocándolos debajo de una fuente de luz germicida incorporada en el armario de seguridad biológica durante 30 minutos.

Una vez completada la esterilización, proceda a preparar las células después de la esterilización del equipo experimental. Trabaje en la campana y agregue TEA estéril al polímero utilizado en la reticulación de tipo mical y PBS estéril al polímero utilizado para la reticulación de radicales libres. AGREGUE un tampón correspondiente a los tubos de la mitad colgante y al vórtice.

Para disolver, la fracción colgante se une al ácido hialurónico alquilado a través de un tiol de un grupo INE en el péptido para unir la fracción colgante al polímero, agregarla a la solución polimérica y sellar con param. Brevemente, vórtice e incube a 37 grados centígrados con mezcla. Mientras prepara las células, mientras se adhiere la fracción colgante, prepare las células para encapsularlas tryis, células madre mesenquimales humanas o HMC lavándolas con PBS.

Luego incubar con tripsina durante un minuto a temperatura ambiente, retirar la tripsina incubar cinco minutos más a 37 grados. A continuación, añada el medio de crecimiento HMSC para neutralizar la tripsina y liberar las células de la superficie de la placa. Cuente las células con un hemocitómetro.

Separe las celdas contadas en porciones que contengan el número apropiado para cada juego de geles. Para un conjunto de tres geles de 50 microlitros a una densidad de 10 millones de células por mililitro, separe 1,5 millones de células en un tubo cónico individual. No prepare más de cuatro geles en un juego individual debido al momento de la administración.

A continuación, centrifugar las células a 500 RCF durante seis minutos. A temperatura ambiente, mientras las células giran hacia abajo, prepare la mezcla de polimerización para la reticulación de la edición mical. Agregue tampón al reticulante para lograr la concentración adecuada.

Para la reticulación de radicales libres iniciada por la luz, agregue la solución I 2 9 5 9 previamente preparada a la solución polimérica. Al 10% del volumen total del fraguado de gel para una concentración del iniciador final del 0,05% en peso. Ahora las células y la mezcla de polimerización están listas para ser encapsuladas en el hidrogel.

Comience aspirando el snat de las celdas de centrífuga. Espere a que el líquido se asiente después de la aspiración inicial y vuelva a aspirar para eliminar la mayor cantidad de medios posible sin interrumpir el pellet de celda Resus. Suspenda el pellet de celda con la solución polimérica para evitar burbujas de aire.

Pipetea lentamente la solución hacia arriba y hacia abajo unas 10 veces, lo que debería ser suficiente para distribuir las células de manera uniforme. Para la reacción de adición de tipo mical, utilice una punta de pipeta de orificio ancho para añadir el volumen adecuado de solución de reticulante a la célula de polímero. Ajuste la pipeta al volumen de gel individual deseado.

Pipetear la solución hacia arriba y hacia abajo para homogeneizar y Eloqua en los moldes de la punta de la jeringa. Realice el paso rápidamente para garantizar una distribución uniforme de las células y permita una incubación de 10 a 30 minutos en la campana de cultivo para la reticulación. Para la luz inició la reticulación de radicales libres.

Alícuota el volumen apropiado en moldes de punta de jeringa. Exponga las jeringas a la luz ultravioleta para la reticulación de radicales, una exposición de 10 minutos a 365 nanómetros. La luz ultravioleta cuadrada de cuatro milivatios por centímetro cuadrado es común para los polímeros funcionalizados ACRL.

Realice el paso rápidamente para minimizar la sedimentación de las células antes de la exposición a la luz ultravioleta. Después de la reticulación, sumerja los geles en los pocillos de una placa de cultivo de tejidos que contenga medios para la incubación y el análisis. La reticulación del hidrogel también se puede realizar secuencialmente.

En primer lugar, se añade el colorante funcionalizado metolado rumine hasta una concentración final de 20 nanomolares en el gel. El tinte ayuda a visualizar el patrón, ya que se incorpora preferentemente en regiones radicalmente reticuladas del gel. Luego comience con la reacción de polimerización de tipo micrófono que produce una fracción de los enlaces cruzados teóricos para lo siguiente.

En el reticulación de radicales libres, será necesario utilizar una máscara diseñada en un programa como Adobe Photoshop o Illustrator e impresa directamente sobre máscaras de transparencia. Las dimensiones de la mascarilla deben coincidir con la parte superior redonda de la jeringa. Use pinzas esterilizadas para aplicar una mascarilla estéril directamente sobre la superficie del gel y exponerla a la luz para reticular el gel.

Además, aquí se muestran las HMC dentro de hidrogeles basados en HA una hora después de la encapsulación. Debido a que los hidrogeles sintetizados suelen ser transparentes, las células se pueden visualizar para determinar su morfología mediante microscopía óptica. Se visualizó la viabilidad de las mismas células 24 horas después de la encapsulación utilizando un kit de tinción fluorescente de muertos vivos.

Utilizamos calcio M para detectar las células vivas y homodímero de aterio para las células muertas y observamos una viabilidad superior al 95%. También utilizamos el ensayo de azul de alamar para determinar el nivel de proliferación celular medido por lo bien que las células metabolizan el reactivo del ensayo, lo que resulta en un cambio de color. La tinción celular se realizó en HMCs de H siete días después de la encapsulación dentro de un hidrogel degradable y adhesivo a base de HA y utilizando procedimientos estándar de fijación y permeabilidad.

El actón celular es visible usando la phin marcada con fluoresceína y los núcleos restringidos con dpi. La inmunotinción contra el culín se utiliza para la visualización de adherencias focales dentro de la matriz de hidrogel. La tinción histológica se realiza después de la deshidratación, la inclusión en parafina y el corte de los hidrogeles utilizando protocolos estándar de hidrogeles de HA encapsulados en HMSC radicalmente polimerizados.

Después de una semana en cultivo, se tiñeron con hemat toína marcando los núcleos y ASIN marcando el tejido conectivo A y tinciones azules para glicosaminoglicanos. En tiempo real. La PCR se utiliza para cuantificar la diferenciación de células madre encapsuladas Después de restar el fondo, el nivel de expresión de un gen de interés se determina por el número de ciclo en el que se alcanzó el umbral de fluorescencia en comparación con una señal de referencia pasiva, que es un gen de mantenimiento constitutivamente activo. Así que te acabamos de mostrar cómo encapsular células en hidrogeles 3D y estudiar el comportamiento de las células en geles.

Al utilizar estos procedimientos, es importante garantizar una esterilidad completa de los materiales, ya sea conservando soluciones tampón y reactivos estériles a largo plazo o esterilizando con la lámpara UV germicida. Así que eso es todo. Gracias por lavarte y buena suerte con tus experimentos.