La encapsulación celular en hidrogeles 3D para ingeniería de tejidos

El proceso por etapas para la encapsulación de células comienza con la preparación y esterilización de moldes de hidrogel y otros materiales, seguido del aislamiento de células en poblaciones individuales, en tubos para cada conjunto de geles. A continuación, se realiza la polimerización en presencia de células, seguida del período de incubación in vitro o in vivo. El análisis posterior del comportamiento celular puede incluir pruebas de viabilidad, morfología, proliferación y diferenciación.

Hola, Amidio Kahan del laboratorio del Dr. Jason Burdick en el Departamento de Bioingeniería de la Universidad de Pensilvania. Hoy les mostraremos un procedimiento para la encapsulación celular en hidrogeles 3D para la ingeniería de tejidos. Utilizamos este procedimiento para estudiar los efectos de la composición y estructura del hidrogel sobre el comportamiento de las células encapsuladas.

Así que comencemos. Para iniciar este procedimiento, prepare una solución al 0,5 % en peso del iniciador fotocurable air cure 2 9 5 9 o I 2 9 5 9 en PBS. Mezcle e incube de dos a tres días en la oscuridad a 37 grados Celsius.

Cuando esté listo, utilice un filtro de jeringa para esterilizar la solución y almacénela a temperatura ambiente. A continuación, utilice un programa de hojas de cálculo como Microsoft Excel para calcular la cantidad de polímero y entrecruzante necesaria, tal como se muestra. A continuación se muestra ácido hialurónico funcionalizado con grupos reactivos acrilato.

También calcule la cantidad del péptido penante que contiene el dominio adhesivo funcional con los aminoácidos cisteína, arginina, glicina y aspartato. La cisteína sirve para la anclaje al polímero. Una vez determinadas las cantidades necesarias de entrecruzador polimérico y pent, péselas y coloque cada una en un tubo einor.

Ajuste la hoja de cálculo de acuerdo con ello. Para la masa real del polímero obtenido, proceda a preparar los moldes para geles. Utilice una cuchilla de afeitar para cortar las puntas de los artículos estériles envueltos individualmente.

Jeringas desechables de un mililitro. Asegúrese de realizar un corte plano para los moldes que se utilizarán en el patrón fotográfico de los geles. Por último, esterilice los moldes de jeringa y los tubos EOR con sus tapas abiertas, así como cualquier otro material necesario, colocándolos bajo una fuente de luz germicida integrada en la cabina de seguridad biológica durante 30 minutos.

Una vez finalizada la esterilización, proceda a preparar las células tras la esterilización del equipo experimental. Trabaje en la cabina y añada TEA estéril al polímero utilizado en el entrecruzamiento de tipo mical y PBS estéril al polímero utilizado para el entrecruzamiento por radicales libres. AÑADA tampón compatible a los tubos de los grupos laterales y vortexee.

Para disolver el grupo colgante que se une al ácido hialurónico alquilado mediante un tiol de un grupo INE en el péptido y así fijar el grupo colgante al polímero, añádalo a la solución polimérica y selle con parafina. Breve agitación por vórtex e incubación a 37 grados Celsius con agitación. Mientras se preparan las células, durante la unión del grupo colgante, prepare las células a encapsular, como células madre mesenquimales humanas o CMH, lavándolas con PBS.

Luego, incubar con tripsina durante un minuto a temperatura ambiente, retirar la tripsina e incubar cinco minutos más a 37 grados. A continuación, añadir medio de crecimiento para HMSc para neutralizar la tripsina y liberar las células de la superficie de la placa. Contar las células con un hemocitómetro.

Divida las células contadas en porciones que contengan el número adecuado para cada conjunto de geles. Para un conjunto de tres geles de 50 microlitros a una densidad de 10 millones de células por mililitro, separe 1,5 millones de células en un tubo cónico individual. No prepare más de cuatro geles en un conjunto individual debido al tiempo de gelificación.

A continuación, centrifugue las células a 500 RCF durante seis minutos. A temperatura ambiente, mientras las células se sedimentan, prepare la mezcla de polimerización para la reticulación con mical edición. Añada tampón al reticulador para alcanzar la concentración adecuada.

Para la reticulación por radicales libres iniciada por luz, añada la solución de I 2 9 5 9 previamente preparada a la solución polimérica. Al 10 % del volumen total del gel establecido para una concentración final de iniciador del 0,05 % en peso. Ahora las células y la mezcla de polimerización están listas para la encapsulación en el hidrogel.

Comience aspirando el sobrenadante de las células centrifugadas. Espere a que el líquido se asiente tras la aspiración inicial y aspire nuevamente para eliminar la mayor cantidad posible de medio sin alterar el botón celular. Suspender el botón celular con la solución de polímero para evitar la formación de burbujas de aire.

Pipetee lentamente la solución hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 10 veces, lo cual debería ser suficiente para distribuir las células uniformemente. Para la reacción de adición tipo mical, utilice una punta de pipeta de orificio ancho para agregar el volumen adecuado de solución de entrecruzador a la célula polimérica. Mezcle. Ajuste la pipeta al volumen individual deseado del gel.

Pipetee la solución hacia arriba y hacia abajo para homogeneizar y transferir a los moldes de las puntas de la jeringa. Realice este paso rápidamente para asegurar una distribución uniforme de las células y permita una incubación de 10 a 30 minutos en la cabina de cultivo para la reticulación. Para la reticulación por radicales libres iniciada por luz.

Aliquote el volumen adecuado en moldes de punta de jeringa. Exponga las jeringas a luz UV para la reticulación radical durante 10 minutos a 365 nanómetros. Una luz UV de cuatro milivatios por centímetro cuadrado es común para polímeros funcionalizados con ACRL.

Realice el paso rápidamente para minimizar la sedimentación celular antes de la exposición a la luz UV. Tras el entrecruzamiento, sumerja los geles en los pocillos de una placa de cultivo celular que contenga medio para incubación y análisis. El entrecruzamiento del hidrogel también puede realizarse secuencialmente.

Primero, agregue el colorante funcionalizado metolado rumina a una concentración final de 20 nanomolares en el gel. El colorante ayuda a visualizar el patrón, ya que se incorpora preferentemente en regiones del gel reticuladas de forma radical. Luego, inicie la reacción de polimerización del tipo mic, obteniendo una fracción de los enlaces cruzados teóricos para lo siguiente.

Para la reticulación mediante radicales libres, se necesitará utilizar una máscara diseñada en un programa como Adobe Photoshop o Illustrator e impresa directamente sobre máscaras de transparencia. Las dimensiones de la máscara deben coincidir con la parte superior redonda de la jeringa. Utilice pinzas esterilizadas para aplicar una máscara estéril directamente sobre la superficie del gel y expóngala a la luz para reticular el gel.

Aquí se muestran además HMC dentro de hidrogeles basados en HA una hora después del encapsulado. Dado que los hidrogeles sintetizados son típicamente transparentes, las células pueden visualizarse para evaluar su morfología mediante microscopía de luz. Las mismas células se visualizaron para evaluar su viabilidad 24 horas después del encapsulado utilizando un kit fluorescente de tinción de células vivas y muertas.

Utilizamos calcio M para detectar las células vivas y homodímero de atherium para las células muertas, y observamos una viabilidad mayor al 95 %. También utilizamos el ensayo alamar blue para determinar el nivel de proliferación celular, medido por la capacidad de las células para metabolizar el reactivo del ensayo, lo que provoca un cambio de color. La tinción celular se realizó en H HMCs siete días después de la encapsulación dentro de un hidrogel degradante y adhesivo basado en HA, utilizando procedimientos estándar de fijación y permeabilización.

El actina celular es visible mediante el uso de fitalina marcada con fluoresceína y los núcleos se tiñen con DAPI. La inmunotinción contra cullina se utiliza para la visualización de las adhesiones focales dentro de la matriz del hidrogel. La tinción histológica se realiza tras la deshidratación, inclusión en parafina y seccionado de los hidrogeles, siguiendo protocolos estándar de hidrogeles de HA con HMSC encapsuladas radicalmente polimerizadas.

Después de una semana en cultivo, se tiñeron con hematoxilina marcando los núcleos y ASIN marcando el tejido conectivo A y tinciones azules para los glucosaminoglicanos. La PCR en tiempo real se utiliza para cuantificar la diferenciación de células madre encapsuladas. Después de restar el fondo, el nivel de expresión de un gen de interés se determina por el número de ciclos en el que se alcanzó la fluorescencia umbral en comparación con una señal de referencia pasiva, que es un gen de mantenimiento constitutivamente activo. Así que acaban de ver cómo encapsular células en hidrogeles 3D y estudiar el comportamiento de las células en geles.

Al utilizar estos procedimientos, es importante garantizar la esterilidad completa de los materiales, ya sea manteniendo soluciones tampón y reactivos estériles a largo plazo o esterilizándolos con la lámpara germicida de luz ultravioleta. Eso es todo. Gracias por su atención y buena suerte con sus experimentos.