No invasiva En Vivo Pequeños Animales MRI y MRS: Procedimientos básicos Experimental

Para comenzar este experimento, se coloca un ratón anestesiado sobre un soporte para animales que posteriormente se inserta en una bobina de radiofrecuencia o bobina RF. Antes de un experimento de MRI o MRS, la bobina RF se sintoniza entonces a la frecuencia de resonancia y se ajusta a una impedancia característica de 50 ohmios. A continuación, se realiza la adquisición de MRI o MRS tras optimizar la secuencia de pulsos; finalmente, las imágenes o espectros se analizan utilizando programas de análisis.

Hola, soy Dawn Lee del Laboratorio de Investigación R del Departamento de Radiología de la Universidad de Washington. Y yo soy David Senek, también del Laboratorio de Investigación R y de los departamentos de radiología e ingeniería bioingeniería de la Universidad de Washington. Hoy les mostraremos un procedimiento de imágenes por resonancia magnética y espectroscopía por resonancia magnética en ratones.

En nuestro laboratorio, utilizamos estos procedimientos para estudiar modelos de tumores en ratones, distrofia muscular y metabolismo muscular. Así que comencemos. Este protocolo no pretende abarcar todos los aspectos de la I-R-M/I-R-M-E en pequeños animales, sino más bien introducir los procedimientos básicos de los experimentos de I-R-M/I-R-M-E en ratones.

El objetivo es proporcionar una comprensión más profunda de los procedimientos básicos para experimentos de RM in vivo en animales pequeños, de modo que los investigadores nuevos en el campo de la RM puedan planificar mejor los componentes no relacionados con la RM en sus estudios. Así, al final, los procedimientos de RM y los no relacionados con la RM podrían integrarse sin problemas. Para comenzar los preparativos del experimento de imagen por resonancia magnética o MRI, coloque un ratón anestesiado con isoflurano en un soporte para animal con su nariz insertada en un cono nasal.

Se puede utilizar un sujetador de cabeza para la obtención de imágenes craneales, y un soporte corporal para la obtención de imágenes del cuerpo. Mantenga los ojos del animal húmedos con una pomada lubricante estéril para los ojos.

El animal debe mantenerse a una temperatura de 35 a 37 grados Celsius durante el experimento, dentro de un sistema de circulación de agua caliente. Se utiliza un sistema de monitoreo animal tanto para controlar la temperatura corporal, la respiración y el ciclo cardíaco, como para sincronizar la compuerta respiratoria y cardíaca con las adquisiciones de imágenes. A continuación, coloque una muestra estándar de agar junto al animal para monitorear cambios bruscos en la señal.

Esta muestra agrícola estándar es particularmente útil para la obtención de imágenes con múltiples cortes y múltiples puntos temporales. Cuando se detecta un cambio de señal inesperado en un corte de las imágenes adquiridas, el corte puede eliminarse. Una vez que el animal esté seguro y todos los componentes de monitoreo estén colocados, posicione el soporte del animal en el centro de una bobina de radiofrecuencia o bobina RF.

Mueva la bobina de RF al cuarto del imán e insértela en el sistema de circulación de agua tibia colocado dentro del imán. Ahora comience la adquisición de datos de MRI. Durante el período de adquisición de imágenes, ajuste el flujo del medidor a entre 0,4 y 0,8 mililitros por minuto y reduzca el vaporizador de isoflurano a entre 1,2 y 1,5 %. El gas expirado procedente del cono nasal del ratón se elimina mediante un sistema de vacío interno.

Para optimizar la recepción de la señal, sintonice la bobina de RF a la frecuencia de resonancia del protón H¹ y ajuste la impedancia característica de la bobina a 50 ohmios. Mediante el panel de sintonización en el escáner de RM, la mayoría de los escáneres de RM para humanos no requieren un proceso separado de ajuste de impedancia, excepto en procedimientos de espectroscopía por resonancia magnética (MRS). Comience el shimado utilizando una secuencia de pulso única.

El proceso de ajuste optimiza la homogeneidad del campo magnético en la región de interés. Cada escáner tiene su propio método para realizar el proceso de ajuste, incluyendo procesos automáticos de ajuste rápido, como el mapeo rápido y el ajuste por gradiente. Cuando el ajuste esté completo, optimice el pulso de RF.

Maximizando el perfil de imagen unidimensional. Las potencias del pulso de RF pueden organizarse manteniendo constante la duración del pulso y conservando un retardo de reciclado lo suficientemente largo. El TR debe ser aproximadamente de tres a cinco veces el T1 del tejido; adquirir imágenes exploratorias a lo largo de tres orientaciones ortogonales para crear imágenes axiales, coronales y sagitales.

Se puede utilizar una secuencia rápida de adquisición de imágenes para obtener las imágenes exploratorias. Las imágenes adquiridas se utilizarán para planificar la adquisición real de imágenes mediante la determinación de los planos de imagen. Durante la adquisición real de imágenes, se utiliza una secuencia de eco de espín.

Se pueden realizar dos mediciones ya sea utilizando imágenes con múltiples ecos o imágenes con eco simple y múltiples valores de T. Con el experimento de RM finalizado, analicemos la espectroscopía de resonancia magnética in vivo o MRS para el músculo esquelético de la extremidad trasera del ratón, en estado de reposo y con producción mitocondrial máxima de ATP. La producción de ATP puede determinarse mediante MRS al medir los cambios en la fosfocreatina durante e inmediatamente después de la isquemia.

Comience construyendo una férula para inducir isquemia reversible. Tome un trozo de tubo de PVC que tenga aproximadamente de cinco a siete milímetros de ancho y un diámetro interno de 12 a 15 milímetros. Perfore un orificio pequeño a través de la pared y corte un fragmento de un globo de modo que quede abierto en ambos extremos.

Los globos de calidad con helio funcionan mejor. Inserte esta pieza a través de la pieza de PVC y enróllela hacia atrás. Pegue los extremos juntos en la pared exterior de la pieza de PVC.

A continuación, utilice una funda termorretráctil para sellar los extremos del globo alrededor del tubo. Debe obtener una manga con una pared exterior sólida y una pared interior inflable. Corte un área de la funda termorretráctil y del globo alrededor del orificio roscado.

Teniendo cuidado de dejar suficiente material entre el orificio y el borde del trozo de PVC, inserte un trozo de metal no ferroso de 1,5 centímetros de longitud en el orificio del PVC. Esto le permitirá inflar la manga. Selle el área con epoxi de cinco minutos.

Ahora fije la camisa en su lugar junto a la bobina de RF en la sonda de MRS y conéctela a un manómetro externo de sig. Mom. Ahora coloque un ratón anestesiado en posición supina sobre el soporte para ratón, dentro de la sonda de MRS.

Coloque el balón lleno de líquido en el lado ventral del ratón y sujételo en su lugar con las correas de soporte para el ratón. Introduzca al ratón y al soporte corporal en la sonda de MRS. Pase una extremidad trasera a través del manguito isquémico y la bobina de MRS.

La extremidad debe estar lo más centrada posible dentro de la bobina. Esta disposición permite posicionar horizontalmente el cuerpo del animal. Dentro de un imán con orificio vertical, coloque el cuerpo de la sonda en el imán, sintonice, ajuste y nivele para optimizar la relación señal-ruido de la espectroscopía (MRS), como se describe para la resonancia magnética (MRI), excepto que en la MRS, el pulso de radiofrecuencia se optimiza maximizando la amplitud del espectro.

Ahora use resonancia magnética de fósforo-31 (P 31 MRS) para obtener espectros con alta relación señal-ruido y completamente relajados, o bien FRS para determinar las proporciones de fosfato inorgánico y fosfocreatina respecto a TP en condiciones completamente relajadas. Para realizar un experimento isquémico, primero obtenga los espectros en reposo durante aproximadamente cinco minutos. A continuación, induzca isquemia inflando el manguito a 270-300 milímetros de mercurio durante 10 a 12 minutos.

Suelte el manguito y recoja los espectros de recuperación durante cinco minutos. Los experimentos pueden repetirse en días posteriores. Ahora mostraremos algunos resultados representativos de MRI y MRS in vivo.

El ratón desnudo tiene un tumor cerebral xenoinjertado D 2 82 en su espalda y fue imagenado utilizando una secuencia convencional de eco de espín con diferentes efectos de relajación. En la imagen ponderada en T uno, el tumor aparece con una intensidad similar a la del tejido adyacente. Mientras que su imagen correspondiente en T dos visualiza claramente el tumor como una región hiperintensa.

La adquisición de múltiples ecos permite el cálculo de un mapa T2 que contiene información cuantitativa sobre la variación de T2 en el cuerpo del animal. Los cambios regionales de T2 en la región del tumor pueden monitorizarse longitudinalmente en la imagen superpuesta. Aquí se muestra un espectro de RMN de ³¹P completamente relajado de una extremidad trasera de ratón.

Este espectro representa 16 fis sumados. El orden de los picos de izquierda a derecha representa los siguientes metabolitos musculares: fosfato inorgánico pi, fosfocreatina, creatina, PCR y los fosfatos de ATP gamma, alfa y beta. Espectros de MRS de 31P recopilados durante todo el experimento dinámico de isquemia y reperfusión se muestran durante la isquemia, donde la PCR disminuye y el PI aumenta. La velocidad de disminución de la PCR durante la isquemia es igual a la producción mitocondrial basal de ATP.

La recuperación de la PCR tras la isquemia puede utilizarse para calcular la producción máxima de ATP mitocondrial. Acabamos de mostrarle cómo obtener imágenes in vivo de ratón y medir el metabolismo muscular in vivo del ratón mediante espectroscopía de resonancia magnética e imágenes por resonancia magnética. Para la espectroscopía, hemos construido una sonda de RF personalizada que permite mantener el cuerpo del ratón en posición horizontal dentro de un imán de orificio vertical.

Por lo tanto, estos experimentos pueden realizarse en cualquier sistema vertical de gran diámetro. Al llevar a cabo este procedimiento, es importante recordar realizarlo en condiciones óptimas, como un mejor ajuste y sintonización de la bobina de RF y una mejora en el flujo del campo magnético. También es fundamental monitorear el estado del animal mediante un sistema de monitoreo para mantener un estado fisiológico estable y prevenir cualquier medición artifactual potencial.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.