Name: Ver histórico y demostración de Fisiología en la UNM de los músculos inaugural cangrejo de río (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Aprende a disecar el músculo abductor del cangrejo de río para registrar respuestas sinápticas mediante electrodos de parche macro focal. Este método permite estudiar la fisiología neuromuscular y la plasticidad sináptica en un modelo accesible y robusto.

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ver histórico y demostración de fisiología en la unm de los músculos inaugural cangrejo de río

Historical View and Physiology Demonstration at the NMJ of the Crayfish Opener Muscle

Aquí presentamos algunos de los descubrimientos clave importante hecho con el primer partido neuromuscular (UNM) la preparación de los crustáceos y ponen de manifiesto que todavía hay mucho que aprender de esta preparación del modelo. En la comprensión de la historia se puede apreciar por qué aún hoy en día esta MNJ todavía ofrece un campo de juego rico para hacer frente a preguntas sobre la función de pre-y post-sináptica y la plasticidad. La viabilidad y facilidad de acceso a la terminal para intracelulares, así como extracelular de electrofisiología e imágenes importantes ventajas. Los mecanismos que subyacen a la modulación de la cinética vesicular y la fusión dentro de las terminales de alta y baja producción-están pidiendo una investigación. La preparación también ofrece un sistema de modelo comprobable para la evaluación de cómputo y las manipulaciones para examinar las variables clave en los modelos teóricos de la función sináptica, por ejemplo, la dinámica de calcio durante el corto plazo la facilitación. La complejidad sináptica de la zona de activo y de naturaleza estadística de la liberación cuántica es también un área abierta para una futura investigación experimental y computacional.

El abridor de los músculos de la pierna cangrejos de río se presenta por su importancia histórica y la versatilidad experimental en el fenotipo muscular, la fisiología sináptica y la plasticidad.

Ver histórico y demostración de Fisiología en la UNM de los músculos inaugural cangrejo de río

Presentamos aquí algunos de los descubrimientos clave más importantes realizados con la preparación de la unión neuromuscular (NMJ) de crustáceos e ilustramos que existe...

Los músculos abridores obtenidos de una pata ambulatoria de cangrejo de río, que se automiza a partir del animal. Una vez expuesto el músculo, el patrón de inervación puede revelarse mediante diversos procedimientos de tinción. Las respuestas sinápticas en forma de facilitación a corto plazo se registran fácilmente a partir del músculo.Un electrodo macro de parche focal puede colocarse directamente sobre varicosidades identificadas a lo largo de los terminales nerviosos. Luego se registran las respuestas sinápticas, que pueden utilizarse para medir la eficacia sináptica a un nivel cualitativo desde una ubicación definida en el terminal. Hola, me llamo Ann Cooper del laboratorio del Dr. Robin Cooper en el Departamento de Biología de la Universidad de Kentucky.Hola, soy Robin Cooper. Mi estudiante y yo les mostraremos un procedimiento para diseccionar el músculo abridor de cangrejo de río y utilizarlo para registrar respuestas sinápticas con diferentes paradigmas de estimulación. Utilizamos estos procedimientos en nuestro laboratorio para estudiar la eficacia sináptica y la relación entre la ultraestructura sináptica y su función.Así que comencemos. En 1879, el zoólogo TH Huxley escribió un libro titulado The Crayfish, que aún hoy se considera una guía completa sobre la historia vital, la anatomía y la fisiología de este crustáceo. En esa época, se estaba caracterizando la innovación del músculo abridor en las patas del cangrejo de río, y ya se habían iniciado estudios fisiológicos en los músculos del cangrejo de río.De hecho, los experimentos en cangrejos de río podrían haber sido los primeros en demostrar la facilitación en la unión neuromuscular o NMJ. El Dr. Riche publicó su investigación principal en sus libros de texto médicos, que utilizaba para enseñar a los estudiantes de medicina sobre la función muscular. Durante las siguientes décadas, las uniones neuromusculares de cangrejos de río fueron descritas anatómica y fisiológicamente con respecto al desarrollo de la tensión y la anatomía.En 1961, Doodle y Kler demostraron la facilitación en el músculo abridor de la langosta y mostraron por primera vez los fenómenos de inhibición presináptica y describieron la naturaleza cualitativa de la transmisión sináptica. En esta JM en 1971, Sherman y Edward realizaron el descubrimiento fundamental de que la JM abridora en la langosta exhibía facilitación a largo plazo o LTF, además de la facilitación a corto plazo o SDF.A partir de este período, muchos investigadores se centraron en los atributos del SDF y del LTF utilizando la unión neuromuscular del músculo abridor de cangrejo de río para estudiar los mecanismos celulares. Hoy en día, la preparación del músculo abridor en el cangrejo de río sigue utilizándose para estudiar los fundamentos de la transmisión sináptica porque es fácilmente accesible y muy resistente en comparación con muchas otras. Para obtener la pata del cangrejo de río para la disección, se induce a un cangrejo de río de seis a diez centímetros de longitud corporal a automutilar su primera o segunda pata caminadora mediante una compresión fuerte en el segmento del podo Iscu.Este procedimiento no mata al cangrejo de río, que ha regresado a su tanque de contención. Coloque la pata del cangrejo de río sobre un trozo de papel de tejido en la platina del microscopio. Gire la pata hasta que el exterior quede orientado hacia arriba.Esta cara generalmente es la arqueada, colocada hacia arriba. Utilice una cuchilla de afeitar afilada para tallar la cutícula hasta que apenas la corte. En este patrón, tenga cuidado de no cortar demasiado hacia distal en el corte de dorsal a ventral, cerca de la articulación entre la vaina medular y la vaina de cobre.Deje la cutícula en su lugar por ahora; con la hoja de bisturí de afeitar, raye la cutícula en la dieta adecuada hasta cortarla ligeramente, siguiendo este patrón para el segmento de dieta adecuada en un lado. Después, repita en el otro lado, uniendo los cortes proximales para evitar seccionar el músculo abridor; mantenga la hoja inclinada hacia el músculo más cercano. Al cortar a través de la cutícula, deje la cutícula en su lugar por ahora.A continuación, sumerja la pata en solución salina para cangrejo de río en un recipiente de disección con un revestimiento protector de un centímetro de grosor en la base. Introduzca un alfiler en la esquina dorsal cordal dentro del corte de la ventana realizada en el meite para mantener la preparación fija con pinzas finas. Levante ligeramente la cutícula desde el extremo distal y, con la cuchilla, corte las fibras del músculo flexor separándolas de la cutícula de manera distal a proximal.Luego levante la ventana de la cutícula. Una vez que la cutícula esté levantada, retire cuidadosamente el tendón de la cavidad de la pata y corte el AEM en la articulación meite-CARite. Tenga cuidado de cortar solo el tendón y no el nervio principal de la pata, que se encuentra en el lado interno del tendón.Pinche el tendón en el lugar donde fue cortado con pinzas y retire el músculo flexor levantándolo en dirección cordal. Ahora están expuestos el nervio principal de la pata y el músculo extensor. Proceda al segmento de dieta adecuada y corte en la articulación entre la dieta adecuada y el lípido dactilar dita.Tire del segmento ventral de la dieta adecuada hacia abajo y hacia atrás cada tres meses para que puedan verse los músculos adheridos en la región cordal. Corte estos músculos con la cuchilla. Tenga cuidado de no cortar la rama nerviosa motora que va al músculo abridor.El músculo abridor ahora está expuesto a la solución salina. Regrese a la región más cordal del segmento meita, donde el haz nervioso de la pata generalmente contiene dos haces nerviosos separados. Seccione el haz dorsal con tijeras finas.Luego, tome el extremo cortado con pinzas y tire suavemente en dirección distal hasta alcanzar aproximadamente la mitad de la longitud del segmento meita. Esta rama nerviosa larga contiene el nervio abridor excitador. Mientras que el haz nervioso más grande contiene la neurona motora inhibitoria del músculo abridor.Corte la preparación en el segmento meita de forma diagonal de modo que un alfiler para insectos pueda insertarse a través de la cara dorsal del meita. Esto coloca la cara ventral del músculo abridor hacia arriba, de forma que quede frente al observador. A continuación, retire las fibras residuales del músculo cerrador que obstruyen la vista del músculo abridor.Al empujar las fibras contra la cutícula y fuera de la cavidad, se puede extraer suavemente con pinzas finas y luego seccionar el nervio principal de la pata que discurre junto al músculo abridor e ingresa en el lípido del dactilo. Ahora el músculo abridor queda expuesto sin ningún tejido que interfiera. Coloque la preparación del músculo abridor en una cámara de registro diseñada con un electrodo de succión de plástico, utilizando un electrodo intracelular o un electrodo de parche macro focal para registrar los potenciales postsinápticos excitatorios o EPSPs.El hecho de tener el electrodo estimulante integrado en la cámara evita la necesidad de usar un micromanipulador para colocar un pin del electrodo estimulante en la preparación dentro del recipiente de registro y colocar la rama del nervio que contiene el nervio excitador en el electrodo de succión. El músculo abridor se divide en tres regiones generales: distal, central y proximal. Aunque todo el músculo abridor está inervado por una única neurona motora, las JSN son estructuralmente diferentes y presentan diferencias específicas regionales en la eficacia sináptica.Dado que las fibras más distales se delimitan fácilmente para garantizar la consistencia entre los preparados, utilizaremos la región distal en esta demostración para provocar una respuesta evocada. El axón excitador será estimulado selectivamente mediante un estimulador grass eight eight. La región distal del músculo abridor es atravesada con un electrodo intracelular afilado lleno con cloruro de potasio tres molar.Se utiliza un amplificador modelo axon clamp dos B y una etapa de cabezal A uno XL lu para registrar los EPSP intracelulares. Puede obtenerse la facilitación a corto plazo o varios otros tipos de respuestas deseadas, al variar las condiciones del estímulo. La facilitación a corto plazo se obtiene aplicando un tren de 10 o 20 pulsos a intervalos de 10 o 22 ms, respectivamente, al nervio excitador.La frecuencia de estimulación dentro del tren puede variarse. La salida de la hierba se conecta a una unidad de aislamiento de estímulos mediante un cable conectado al alambre de plata que se encuentra dentro del electrodo de succión de plástico. El cable se fija a un alambre de plata en el baño para registrar directamente los EPSP focales sobre regiones identificables del terminal nervioso.Primero se visualizan las varicosidades sinápticas con un colorante fluorescente vital cuatro colorante dos A SP.A. Aquí se utilizará un electrodo de registro macro parche fabricado con vidrio chix. La luz del electrodo se llena con un medio salino de baño, trabajando bajo un microscopio de fluorescencia, se coloca la luz de un electrodo de registro macro parche directamente sobre una varicosidad aislada individual para evocar el terminal nervioso. El nervio motor excitador se estimula como se demostró anteriormente.Pueden registrarse respuestas espontáneas, así como respuestas evocadas de qual, a lo largo de la cadena de varicosidades visualizadas, bajando suavemente la luz del electrodo y elevándola nuevamente. Es posible el conteo directo de eventos de qual en cada varicosidad utilizando frecuencias de estimulación bajas para cada respuesta evocada. El número de eventos de qual puede determinarse para una serie de respuestas.Se cuentan los números totales de eventos de cualidad para luego estimar el contenido medio de cualidad basándose en estos conteos directos. Un enfoque para calcular el contenido medio de cualidad consiste en tomar el número total de los tipos de eventos de cualidad evocados durante la estimulación y dividirlo por el número total de ensayos de estímulo utilizando la siguiente fórmula. Aquí se muestra un conjunto de ensayos repetitivos de estimulación con 30 pulsos a 40 hercios.Observe la facilitación en cada serie y la respuesta promedio si la estimulación ha aumentado a 60 hercios. Se observa una facilitación más pronunciada al registrar con un electrodo focal sobre una varicosidad y estimular a un hercio. Se observan las respuestas qal evocadas.Acabamos de mostrarle cómo diseccionar el músculo abridor de la langosta y utilizarlo para registrar respuestas sinápticas mediante diversos paradigmas y técnicas de estimulación. Al realizar estos procedimientos, es importante recordar tratar los neuronas con cuidado, sin tirar de ellos con fuerza ni aplastarlos. Además, al colocar el electrodo focal tipo macroen parche sobre las varicosidades visualizadas, debe colocar ligeramente el electrodo sobre dichas varicosidades y luego levantarlo suavemente.Otro punto que debe recordarse es que no se debe exponer la preparación durante demasiado tiempo a la luz de mercurio, ya que esto podría dañar también la terminación nerviosa. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este artículo demuestra cómo llevar a cabo los registros electrofisiológicos de las respuestas sinápticas en el músculo extensor de la pierna a pie de un cangrejo de río y cómo las terminales nerviosas se visualizan para mostrar las diferencias morfológicas de alto y bajo rendimiento terminales nerviosas.

Las grabaciones fisiológicas de NMJs de salida de alta y baja en el músculo extensor de piernas cangrejo de río

Los experimentos muestran un método fácil para que los estudiantes adquieran experiencia en el examen de la estructura muscular, las respuestas sinápticas, los efectos de los gradientes iónicos y la permeabilidad de los potenciales de membrana. Además, una sensorial-CNS-motor de los músculos del circuito se presenta para mostrar un medio para probar los efectos de los compuestos en un circuito neuronal.

Los potenciales de membrana, las respuestas sinápticas, circuitos neuronales, neuromodulación y la histología muscular utilizando el cangrejo de río: Los ejercicios de laboratorio para estudiantes

El propósito principal de este experimento es entender cómo las neuronas sensoriales primarias transmitir la información de los movimientos y posiciones conjuntas en la información propioceptiva de un animal. Un objetivo adicional de este informe es presentar la anatomía de la preparación mediante la disección y la visualización de las neuronas bajo un microscopio de disección.

Los órganos receptores de los músculos en el abdomen del cangrejo de río: Un ejercicio de laboratorio los estudiantes en la propiocepción

En este informe se muestran las técnicas que se pueden utilizar para investigar la biología del cangrejo de río del intestino grueso. Se muestra cómo la disección de un cangrejo de río abdomen y el estudio de la anatomía asociada, la fisiología y la modulación de la actividad. La actividad peristáltica y la fuerza de las contracciones se miden con un transductor de fuerza.

La experimentación fisiológica con el intestino grueso cangrejo de río: Un ejercicio de laboratorio los estudiantes

Esta es una demostración de cómo las membranas biológicas se puede entender el uso de modelos eléctricos. También demuestran los procedimientos para el registro de potenciales de acción desde el cordón nervioso ventral de los cangrejos de río para los laboratorios de los estudiantes orientados.

Modelado de membranas biológicas con placas de circuitos y medición de señales eléctricas en los axones: Ejercicios de laboratorio para estudiantes

Técnicas fisiológicas y anatómicas se demuestran para abordar la función y la estructura de los propioceptores articulares y los receptores de la tensión muscular en las extremidades para caminar crustáceos.

Propiocepción y la tensión en los receptores de cangrejo Limbs: Ejercicios de Laboratorio Estudiante

Drosophila larval NMJ Disección

Este protocolo muestra cómo realizar técnicas de inmunohistoquímica sobre disecados larvas de Drosophila.

Drosophila larval NMJ inmunohistoquímica

A continuación se describen los métodos electrofisiológicos para la medición de la transmisión sináptica en la unión neuromuscular de larvas de Drosophila. Liberación evocada se inicia artificialmente mediante la estimulación de los axones de la neurona motora, y la transmisión a través de la UNM se puede medir por la respuesta postsináptica evocado en el músculo.

Los métodos electrofisiológicos para la grabación de los potenciales sinápticos de la UNM de larvas de Drosophila

Método para la disociación enzimática, el etiquetado de superficie y la purificación por citometría de flujo de fibro / adipogénico y progenitores miogénica del músculo esquelético murino.

Purificación de los progenitores del músculo esquelético

Aprende a disecar el músculo abductor del cangrejo de río para registrar respuestas sinápticas mediante electrodos de parche macro focal. Este método permite estudiar la fisiología neuromuscular y la plasticidad sináptica en un modelo accesible y robusto.

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