Monitorización de la función del corazón en las larvas Drosophila melanogaster Para los estudios fisiológicos
16 de noviembre de 2009
Se presenta de varias maneras para controlar la función del corazón en la larva de Drosophila Para la evaluación de preguntas relacionadas con la función de uniones, las mutaciones de los canales iónicos, la modulación de la actividad de marcapasos y los estudios farmacológicos.
Drosophila es genéticamente atractiva para investigaciones sobre el desarrollo y la función del corazón, así como sobre la actividad subyacente del marcapasos. Este procedimiento muestra cómo preparar larvas intactas y diseccionadas, y cómo monitorear la frecuencia cardíaca. La preparación diseccionada también permite la grabación de potenciales extracelulares o intracelulares para acceder adicionalmente a la función de los canales iónicos.
Hola, soy Robin Cooper, miembro del personal docente del Departamento de Biología de la Universidad de Kentucky. Hoy mis estudiantes, Ann Cooper, Kyla Ryman, Matt Ward y Easter Boku, les mostrarán diversos procedimientos para monitorear la frecuencia cardíaca en larvas de Drosophila. El siguiente método sin restricciones se denomina granja de hormigas porque las larvas se visualizan dentro de un único plano focal.
Para una visualización óptima de las larvas, utilice un microscopio estereoscópico con un objetivo básico de dos x y un objetivo tubular de 0,5 x para obtener la mejor resolución espacial y aumento sobre un rectángulo de un centímetro por 0,5 centímetros. Las fotografías y videos pueden registrarse mediante una cámara montada en el ocular. Para comenzar este método, coloque una larva entre una capa delgada de alimento y dos portaobjetos de vidrio.
Las laminillas se mantienen separadas entre uno y 1,5 milímetros mediante espaciadores de plástico en los cuatro lados. Incline la preparación entre 20 y 45 grados durante unos minutos para favorecer que la larva mantenga la cabeza orientada hacia abajo. Ajuste el espejo del microscopio para obtener el mejor contraste del corazón o de las dos tráqueas y observar los latidos cardíacos.
El método del pegamento es un montaje permanente para inmovilizar larvas sobre un portaobjetos de vidrio. Para comenzar el método del pegamento, coloque un cubreobjetos limpio encima de un portaobjetos de vidrio. Coloque una pequeña gota de pegamento rápido en una esquina del cubreobjetos.
A continuación, enjuague las larvas con agua. Para eliminar el exceso de alimento, absorba el líquido con un trozo de tejido o con la esquina de una toalla de papel. Una vez que la larva esté bien enjuagada, levántela suavemente con pinzas limpias y colóquela sobre el portaobjetos lejos del cubreobjetos bajo el microscopio; oriente la larva sobre su vientre.
El estómago tendrá surcos horizontales tenues que corren a lo largo de él, con finos pelos negros. La parte posterior de las larvas debe quedar orientada hacia arriba y presenta dos franjas paralelas, que son las tráqueas. Utilizando un segundo par de pinzas destinado exclusivamente a manipular el pegamento, tome una pequeña cantidad de la gota situada en el extremo del portaobjetos y colóquela en la esquina del lado opuesto.
Utilice una cantidad mínima, solo la suficiente para cubrir la punta de la pinza. Tome el animal y colóquelo sobre el pegamento asegurándose de que permanezca con el lado ventral hacia abajo, con la boca negra hacia abajo.
Los ganchos deben estar en el borde o cerca del borde del cubreobjetos, los ganchos bucales y la espiral marrón. No deben tocar el pegamento. Presione suavemente sobre las larvas para aplanarlas.
Para aplicar una sustancia de prueba, lo mejor es dispensar pequeñas gotas con una jeringa cerca de la cabeza de la larva. Observe la frecuencia cardíaca contando el número de veces que los espiráculos laten en un minuto. Para observaciones más largas, las larvas pueden alimentarse in situ y humedecerse para prevenir la deshidratación. Para elaborar una placa de disección que sea utilizable bajo el microscopio, use un escalpelo para cortar un orificio de dos centímetros de diámetro en el centro de un trozo de cinta magnética y péguela sobre un portaobjetos de vidrio.
Utilice alfileres de disección que han sido doblados y pegados a clips de papel para facilitar su colocación. Durante la disección, coloque una larva de erizo de mar intacta en tercer estadio sobre la placa de disección. Con el lado dorsal hacia arriba, la tráquea debe ser visible a través de la cutícula.
Coloque dos alfileres en las larvas a cada lado de los ganchos bucales y otros dos alfileres a cada lado de las espiráculos. A continuación, agregue solución salina para mantener las larvas húmedas. Luego, realice una incisión horizontal cerca del extremo posterior, seguida de un corte longitudinal que debe continuar junto a los espiráculos hacia la cabeza del animal.
Levante un alfiler dorsal y engánchelo debajo de la cutícula. Utilice el alfiler para separar. Abra la cavidad corporal.
Repita con los otros tres alfileres. Una vez que el animal haya sido fijado abierto, retire las vísceras teniendo cuidado de no dañar la tráquea ni el corazón. Algunas estructuras, incluyendo el cerebro y algunos cuerpos grasos, están adheridas al corazón y pueden dañarlo al ser removidas.
Deje reposar la preparación en un baño salino HL tres durante tres a cinco minutos tras la disección; en esta preparación se realizan grabaciones intracelulares y de campo mientras se aplican agentes farmacológicos directamente sobre el corazón. El tiempo total para este paso de disección es de tres a seis minutos. Para realizar el estímulo eléctrico, primero es necesario fabricar electrodos focales: pase un electrodo de vidrio sobre un elemento calefactor para pulirlo con llama y formar una curva gradual de aproximadamente 45 grados; monte un electrodo focal lleno con solución salina HL tres a temperatura ambiente en el manipulador, con la punta orientada hacia abajo.
Asegúrese de que el cable del estimulador esté tocando la solución salina dentro del electrodo y de que el estimulador esté apagado. Fije una preparación fresca de disección cardíaca en el microscopio. Coloque el cable de tierra en la solución salina.
Teniendo cuidado de no tocar los alfileres ni perturbar la preparación. Mantenga el enfoque en el electrodo mientras utiliza el manipulador para moverlo hacia abajo dentro de la solución salina. Una vez en la solución salina, coloque la punta del electrodo con el lumen plano contra el corazón y en contacto ligero con este.
Una vez posicionado el electrodo, ajuste la frecuencia del estimulador a dos hertzios con el voltaje en su configuración más baja. Encienda el estimulador. Ajuste la frecuencia a aproximadamente tres hertzios y aumente lentamente el voltaje hasta que el latido cardíaco se acelere y coincida con el ritmo del estimulador.
El ritmo ahora puede manipularse mediante el estimulador. Se pueden añadir compuestos para observar si afectan la contracción o la conducción eléctrica. Para realizar grabaciones de potenciales de campo, llene un electrodo de grabación macro parche con medio de baño y colóquelo en un manipulador sobre un microscopio compuesto.
Conecte el electrodo a un amplificador y a un sistema de grabación. Utilice el manipulador para bajar el lumen del electrodo sobre el corazón de una preparación de disección fijada al microscopio. Toque muy ligeramente el corazón con la punta del electrodo.
Ahora se pueden realizar grabaciones de campo para registrar potenciales de campo desde otra región del corazón. Eleve suavemente la punta del electrodo y muévala a una nueva área con el manipulador, luego vuelva a bajar la punta para realizar grabaciones de potenciales de campo. Permita un monitoreo preciso de la frecuencia y duración de las señales eléctricas en el corazón para medir los potenciales transmembrana de los miocitos larvales.
Primero, asegúrese de que el lumen de un electrodo afilado lleno con cloruro de potasio tres molar esté plano contra el corazón a aproximadamente un ángulo de 45 grados respecto a la vertical. Una vez posicionado correctamente, toque suavemente el corazón con la punta del electrodo y golpee ligeramente la punta para introducirla en una célula. El electrodo puede utilizarse nuevamente si no está roto.
Los registros intracelulares permiten medir la base iónica del potencial de acción y las formas características de los potenciales para examinar los efectos de mutaciones en los canales iónicos o de moduladores de canales. Así que acaban de ver cómo realizar registros cardíacos, así como cómo obtener potenciales intracelulares y potenciales de campo. Puede utilizar estas técnicas para observar alteraciones cardíacas, así como manipulaciones farmacológicas y alteraciones genéticas.
Al realizar este procedimiento, es importante no tirar de una estructura relacionada que esté unida al corazón ni presionar demasiado con el electrodo focal. También con el método del pegamento, tenga cuidado de no pegar la boca o la esfera. Eso es todo.
Gracias por ver y buena suerte con sus experimentos.
Resumen
Este artículo presenta métodos para monitorear la función cardíaca en larvas de Drosophila, centrándose en la evaluación de uniones en hendidura, mutaciones en canales iónicos y actividad del marcapasos. Las técnicas incluyen preparaciones intactas y diseccionadas para un análisis detallado.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Fisiología
- Genética
Antecedentes
- Drosophila es valioso para estudiar el desarrollo y la función cardíaca.
- Comprender la actividad del marcapasos es crucial para obtener conocimientos sobre la fisiología cardíaca.
- La función de los canales iónicos puede evaluarse mediante diversos montajes experimentales.
- Los estudios farmacológicos pueden revelar los efectos de diferentes compuestos sobre la función cardíaca.
Objetivo del estudio
- Demostrar técnicas para monitorear la frecuencia cardíaca en larvas de Drosophila.
- Explorar los efectos de agentes farmacológicos sobre la función cardíaca.
- Proporcionar una metodología detallada para preparaciones intactas y diseccionadas.
Métodos Utilizados
- Método de visualización sin restricciones utilizando un microscopio estereoscópico.
- Método de adhesión para el montaje permanente de larvas en portaobjetos.
- Técnicas de disección para acceder al corazón y a la tráquea.
- Estimulación eléctrica y grabaciones del potencial de campo para evaluar la actividad cardíaca.
Resultados principales
- Monitoreo exitoso de la frecuencia cardíaca en diversas preparaciones larvarias.
- Se demostraron los efectos de agentes farmacológicos sobre las contracciones cardíacas.
- Se proporcionó un protocolo claro para la disección y colocación de electrodos.
- Se mostró la viabilidad de utilizar Drosophila en estudios cardíacos.
Conclusiones
- Las larvas de Drosophila son modelos eficaces para estudiar la función cardíaca.
- Los métodos descritos pueden adaptarse a diversas necesidades experimentales.
- Estudios futuros pueden basarse en estas técnicas para explorar más a fondo la fisiología cardíaca.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Los modelos del corazón de larva de Drosophila permiten la reducción mecanicista de riesgos en la función de canales iónicos y marcapasos en las primeras etapas del descubrimiento, apoyando la validación de dianas para vías relacionadas con el corazón. El procedimiento proporciona lecturas cuantitativas y reproducibles de la frecuencia cardíaca y la actividad eléctrica, facilitando el desarrollo de ensayos para la selección de compuestos. Este sistema ofrece un modelo genéticamente manipulable y relevante para enfermedades, para evaluar el potencial de biomarcadores traslacionales y la confianza predictiva en la identificación de compuestos líderes.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas relacionadas con la función de los canales iónicos y la actividad marcapasos en un sistema genéticamente accesible.
- Valor operativo: Facilita la reducción del riesgo biológico al permitir la aplicación directa de agentes farmacológicos sobre el corazón expuesto.
- Valor predictivo: Proporciona mediciones cuantitativas de la frecuencia cardíaca y los potenciales de membrana para evaluar la interacción con el blanco y la modulación de las vías.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera salidas estandarizadas y cuantificables (frecuencia cardíaca, potenciales de campo, grabaciones intracelulares) para la evaluación confiable de compuestos.
- Valor operativo: Permite la reproducibilidad del ensayo mediante preparaciones diseccionadas que facilitan la exposición controlada a compuestos y el control ambiental.
- Escalabilidad: Las preparaciones de corazón diseccionado pueden utilizarse en adaptaciones de formato de placas multipocillo para apoyar cribados de throughput medio.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia traslacional: La preparación del corazón larvario sirve como un sistema relevante para la enfermedad, que modela disfunciones iónicas asociadas con genes específicos vinculados a enfermedades cardíacas en mamíferos.
- Reducción mecanicista de riesgos: Permite examinar la base iónica de los potenciales de acción y los efectos de mutaciones o moduladores de canales iónicos, reduciendo la ambigüedad mecanicista.
- Continuidad predictiva: Facilita la alineación traslacional de biomarcadores al vincular la electrofisiología larvaria con mecanismos iónicos conocidos en organismos superiores.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se encaja dentro del continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos iniciales, proporcionando conocimientos mecanicistas que orientan la evaluación preclínica de riesgos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la contribución de los canales iónicos y los marcapasos a la función cardíaca mediante lecturas electrofisiológicas directas.
- Selección: Proporciona mediciones cuantitativas y reproducibles de frecuencia cardíaca y potenciales que permiten comparaciones entre condiciones genéticas o compuestos.
- Análisis: Genera datos electrofisiológicos (frecuencia cardíaca, potenciales de membrana, potenciales de campo) que ayudan a los equipos a evaluar los efectos de los compuestos sobre la conducción eléctrica y la contractilidad.
- Investigación Traducional: Se conecta con trabajos preclínicos mediante la modelización de corrientes iónicas subyacentes a los potenciales de acción, relevantes para la fisiopatología cardíaca de mamíferos.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la fenotipificación cardíaca en múltiples proyectos que involucran dianas de canales iónicos o modelos de enfermedades genéticas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva en la validación de objetivos al vincular perturbaciones genéticas o farmacológicas con lecturas funcionales cardíacas.
- Valor operativo: Proporciona preparaciones estandarizadas y escalables que reducen la variabilidad y favorecen la consistencia entre equipos.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos mecanicistas tempranos sobre riesgos cardíacos relacionados con canales iónicos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de compuestos basada en perfiles de seguridad cardíaca y de interacción con el objetivo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de Drosophila, disección y técnicas de registro electrofisiológico.
- Depende de la microscopía, manipulación de electrodos y hardware de estimulación para registros de potenciales intracelulares y de campo.
- Necesita la estandarización del momento de la disección, la composición del medio salino y la colocación de los electrodos entre diferentes usuarios y laboratorios.
- Las consideraciones para la adaptación incluyen la anatomía cardíaca y la composición iónica específicas de cada especie al extenderse a otros modelos de insectos o invertebrados.
- Las limitaciones prácticas incluyen la estabilidad de la preparación a lo largo del tiempo y el posible daño tisular durante la disección, lo cual puede afectar la calidad del registro.
