Derivación de células madre hematopoyéticas de células madre embrionarias murinas

Lo primero que hacemos es tomar un T 25 confluente de umsl. Así que simplemente voy a lavar con PBS y voy a agregar unas gotas de TR y dejar que actúe durante unos minutos. Puedo ver que las células se están desprendiendo de la placa. Por lo tanto, está prácticamente listo.

Vale, ahora voy a recoger las células oculares con tripsina y es recomendable dar unos golpecitos para desencadenar la tasa de tus células oculares con tripsina durante un momento, con el fin de disgregar las colonias y colocarlas en la placa UN. Esta se mantendrá en el incubador durante aproximadamente de 30 a 45 minutos. Ahora voy a centrifugar estas células para recogerlas y simplemente voy a aspirar.

Así que voy a volver a suspender en unos minutos para poder contarlas. Entonces, las suspendí nuevamente, ya hice el recuento y ahora estoy retirando una alícuota que voy a diluir a 50 mililitros, lo cual me dará la concentración adecuada para obtener cien células por gota, solo para asegurarme de que las células estén en buen estado. Ahora tenemos un reservorio.

Solo déles un pequeño movimiento de agitación nuevamente; vertemos esto en nuestro depósito. Bien, esto ya está programado. Ahí vamos.

Ahora está bastante recto. Voltéelo y déjelo a un lado. Cada dos o tres placas, lo inclino un poco para que se mueva ligeramente.

Vale, entonces son cinco placas. Ahora voy a colocarlas en el incubador. Estas son nuestras gotas colgantes que preparamos hace dos días.

Para recogerlas, simplemente agite las placas para reunir las gotas. Voy a recoger todo y trataré de hacerlo suavemente para no alterar demasiado las EV, voy a tomar cinco o seis porciones de PBS y lavaré las placas. Luego dejaremos esto durante al menos 10 minutos y los EBS se sedimentarán por gravedad.

Una vez que haya confirmado visualmente que sus cuerpos embrionarios se han asentado, retire la mayor parte del sobrenadante, pero no todo completamente, ya que no desea alterarlos. Bien. A continuación, se agitan hasta el día seis. Estos son cuerpos embrionarios que se prepararon hace seis días a partir de células madre embrionarias murinas y que normalmente recolectamos agitando ligeramente las placas.

Cuando agita las placas, los eds se agrupan un poco en el centro del recipiente y es algo más fácil manipularlos. Ahora deje que los eds sedimenten por gravedad hasta el fondo del tubo y, a continuación, retire el medio y lávelos una vez con 10 mililitros, de 10 a 12 mililitros de PBS. Bien, ahora dejaremos que estos reposen, espere un momento.

Ahora voy a retirar simplemente el P. Así que añadimos 250 microlitros de nuestra mezcla de enzimas y añadimos un mililitro, y luego simplemente los colocamos en un baño de agua a 37 grados. De vez en cuando, quizás un par de veces, pasaré y los agitaré ligeramente para mezclarlos, porque los Ed se han sedimentado. Ahora tenemos este tampón de disociación celular que es libre de enzimas y que simplemente obtenemos de gpro.

Y vamos a agregar aproximadamente ocho mililitros de esto a cada tubo. Luego, simplemente vamos a iterar con una pipeta de cinco mililitros para disociar; a medida que se repite este proceso, la mezcla se volverá muy turbia. Esta turbidez es una señal visual de que las células se están dispersando en el medio y lo están haciendo muy denso. Ahora voy a contar las células mediante exclusión con tripano; si está intentando realizar una infección o calcular un MOI, es muy importante realizar el conteo.

Así que voy a preparar simplemente un lote grande de virus más medio más células en la concentración adecuada más sulfato de proteína. Y luego me aseguro de que las células, nuevamente, estoy obsesionado con que las células no se salgan de suspensión. Por eso siempre lo hago, y también uso un tubo pequeño; trato de tener cuidado de no provocar salpicaduras excesivas durante el centrifugado a 2.500 rpm.

Así que estoy recolectando nuestras células del día 10, que han sido lavadas; guardo todos los lavados. Antes solía usar PI para yoduro de propidio, pero siete no es tan brillante. Por lo tanto, no se filtra en tantos canales, lo que resulta más limpio que.

Ahora simplemente obtenemos la variable, y esta es una buena manera de prevenir la pérdida en la aguja debido al volumen. Yo soy Shannon McKinney Freeman. Soy investigadora posdoctoral en el Laboratorio de George Families en el Hospital Pediátrico de Boston.

Hoy vamos a explicar cómo obtener una población de células trasplantables a partir de células madre embrionarias de ratón, trasplantables y del sistema hematopoyético. ¿Por qué realizamos este experimento? Bueno, sabemos que utilizando este sistema podemos obtener, en primer lugar, el protocolo definitivo que se desarrolló para derivar una población de células a partir de células madre embrionarias que tuvieran actividad de células madre hematopoyéticas, en el sentido de que fueran capaces de salvar ratones de una radiación letal, reconstituyendo su sistema hematopoyético durante mucho tiempo, durante toda la vida del organismo y en todas las líneas sanguíneas periféricas.

Por eso se desarrolló el protocolo. Ahora estamos realizando experimentos adicionales para comprender el fenotipo de la población de células dentro de esta población expandida que derivamos y que realmente median esta actividad de células madre hematopoyéticas, ya que no lo sabemos. Sabemos que la población es muy heterogénea y sabemos que la célula que realmente rescata a los ratones es extremadamente rara dentro de esta población de células.

Y por lo tanto estamos tratando básicamente de definir su fenotipo para poder purificarlo a partir de estas células muy heterogéneas. Luego, nuestro mayor interés consiste en comprender cómo se compara funcionalmente con una célula madre hematopoyética auténtica que se podría obtener de la médula ósea completa. ¿Tiene una capacidad de reconstrucción equivalente desde el punto de vista del desarrollo?, ¿parece reflejar una CME de la médula ósea adulta?

O quizás podría ser más parecido a una célula madre hematopoyética. Es posible que encuentre el desarrollo temprano, por ejemplo, en la médula ósea o en el hígado fetal. Y esto es, en última instancia, lo que estamos tratando de comprender, y queremos entender estas preguntas porque, en última instancia, nos gustaría que este protocolo sirviera de orientación para trabajos similares en los que estamos interesados al trabajar con células madre embrionarias humanas.

Y consideramos que la información que obtenemos con el sistema matemático, ya sabes, beneficiará enormemente esos experimentos futuros. Creo que hay varias cosas. En primer lugar, simplemente es un buen modelo in vitro, es un buen modelo in vitro del desarrollo.

Así que en primer lugar estamos tratando de comprender el desarrollo de las células madre hematopoyéticas. Es un sistema útil, muy sencillo, para la expresión ectópica de genes y para observar cómo estas condiciones influyen en el desarrollo de las células madre hematopoyéticas. Por tanto, resulta muy útil desde una perspectiva de la ciencia básica.

Pero en última instancia, queremos desarrollar algún tipo de terapia basada en células que podría utilizarse clínicamente para obtener, ya sabe, células madre metabólicas trasplantables a partir de células humanas. Pero eso probablemente esté aún distante en el futuro. En realidad, hemos descubierto que la parte más difícil no es tanto la obtención de las células en sí, sino que, mediante experimentos cuidadosos, hallamos un período de tiempo en el que tuvimos dificultades para lograr que las células reconstituyeran nuestros animales receptores.

Y lo que finalmente descubrimos fue que tuvimos que prestar mucha atención a la ablación de los receptores porque estas células no son capaces. Así que normalmente, cuando se realiza un trasplante en ratones con médula ósea derivada de células madre, se aplican 10 u 11 grays de radiación para ablatar a los ratones, y las células hematopoyéticas de la médula ósea son bastante capaces de rescatar a los animales de esa condición. Sin embargo, resulta que esta población de células que expandimos no es capaz de rescatar a los animales de una dosis tan alta de radiación I.

Entonces, lo que tuvimos que hacer fue ajustar muy cuidadosamente la dosis de irradiación, prestando atención al tamaño de los animales, ya que descubrimos que si los animales eran demasiado grandes y intentábamos usar la misma dosis, no se ablaban de manera efectiva. Pero una vez más, si no se irradian suficientemente los animales, entonces las células no son capaces de competir con huéspedes más resistentes.

Entonces, en realidad, una vez que descubrimos que esta era una variable importante, lo que dificultaba la observación de la actividad ab de estas células, titulamos básicamente la dosis de irradiación y también nos dimos cuenta de que la edad y el peso del animal son muy significativos; fue entonces cuando nuestros experimentos comenzaron a funcionar de manera muy reproducible. Lo que hemos descubierto es que si se utilizan animales de alrededor de 20 gramos, entre 15 y 20 gramos, y se ablacionan con 9,25 gray, esa parece ser la dosis perfecta que permite dar a estas células la ventaja que necesitan para reconstituir los ratones. Sí, y creo que esa fue una de las variables más importantes.

La otra cosa significativa sería el número de células que está inyectando. También hemos realizado titulaciones utilizando estas condiciones particulares para irradiar nuestro organismo modelo. Asimismo, hemos titulado el número de estas células no fraccionadas, este grupo heterogéneo de células que estábamos inyectando en ratones.

Y básicamente descubrimos que se necesita una dosis mínima de aproximadamente 2 millones a 5 millones de células para rescatar a los animales. Si se inyecta menos que eso, los animales no son rescatados. Y creo que eso indica, probablemente, la rareza de la célula que en realidad está mediando el rescate dentro de este compartimento heterogéneo.

Por lo tanto, considero que las variables más importantes son el número de células que se inyectan y asegurarse de que, sea cual sea el modelo de trasplante que se utilice, se trate adecuadamente con el tubo o una cuchilla para dar a las células la ventaja que necesitan para reconstituirse, pero sin excederse hasta el punto de que simplemente no sean capaces de recuperarse. Estos aspectos han sido las variables principales, las más importantes.