Grabación óptica de la actividad eléctrica en el conejillo de Indias Redes entérica con tintes sensibles al voltaje

Este video demuestra la disección e imagen subsecuente de preparaciones del sistema nervioso entérico estimuladas eléctricamente, utilizando el colorante sensible al voltaje natal estire perineo D cuatro A-N-E-P-P-D-H-Q. Se toma un pequeño segmento del intestino de un hámster de Guinea sacrificado y se disecciona para exponer primero la submucosa y finalmente el plexo mientérico, con el fin de realizar grabaciones ópticas. Se colocan electrodos sobre un tejido montado teñido con D cuatro A-N-E-P-P-D-H-Q tras capturar una imagen inicial de alta resolución.

Los cambios ópticos que indican actividad eléctrica se registran con la cámara de alta velocidad. Durante la adquisición de alta velocidad, se aplica una estimulación eléctrica. Luego, la imagen de alta resolución se superpone sobre el mapa de píxeles de la cámara de alta velocidad para su análisis mediante neuro plex.

Hola, soy Brian Salzberg, director del Laboratorio de Óptica Celular o loco, como nos gusta llamarlo en el Departamento de Neurociencia de la Universidad de Pensilvania. Mi nombre es Analia Obide. También soy miembro del laboratorio de óptica celular.

Hoy les mostraremos un procedimiento para registrar la actividad eléctrica de redes neuronales intactas de mamíferos utilizando colorantes sensibles al voltaje. Utilizamos este procedimiento para estudiar la conectividad neuronal dentro y entre las dos redes que componen el sistema nervioso entérico, también conocido como el segundo cerebro o el cerebro del intestino. Así que comencemos.

Comience a preparar las preparaciones submucosas y del plexo entérico extrayendo el intestino delgado de un cobayo Hartley de 150 a 200 gramos o de dos a tres semanas de edad que haya sido anestesiado mediante inhalación de isoflurano y decapitado. Luego, elimine el contenido del intestino lavando el lumen con una solución M199 DM tibia y oxigenada. Corte un segmento intestinal de ocho a diez centímetros de longitud y asegúrese de preservar la polaridad.

Trasfiera el tejido a una placa de vidrio de 10 centímetros recubierta con sardón que contenga M1 99 DM a temperatura ambiente. Coloque la placa sobre un microscopio estereoscópico con iluminación de campo oscuro. A continuación, utilizando tijeras, abra el borde mesentérico y use alfileres para insectos para montar el segmento intestinal con la mucosa hacia arriba.

Es extremadamente importante mantener una tensión uniforme para que, tras fijar el tejido, este presente una forma rectangular con las hileras de vellosidades mucosas alineadas regularmente, sosteniendo unas pinzas finas de Dumont con puntas rectas en una posición casi horizontal. Desprenda la mucosa agarrando la vellosidad en un extremo del segmento intestinal y tirando a lo largo del eje longitudinal del tejido. Continúe separando tiras de mucosa para exponer la submucosa que contiene los ganglios submucosos y la vasculatura submucosa.

A continuación, utilizando tijeras muy finas, realice un corte en la capa submucosa siguiendo la orientación de las fibras musculares circulares. Luego, levante suavemente la submucosa con la pinza fina mientras empuja el músculo circular hacia abajo con las tijeras y corte a lo largo de los bordes longitudinales.

Liberar la submucosa del resto de la preparación a medida que avanza la separación. Realice ahora un segundo corte siguiendo la orientación de las fibras musculares circulares, a una distancia de 1,5 a tres centímetros del primero, para definir el tamaño final de la preparación submucosa; el segmento submucoso resultante tiene un grosor de 30 a 50 micrómetros y presenta un aspecto etéreo. Trasfiera el segmento a otra placa syl guard que contenga M1 99 DM fresco y sujételo suavemente y sin tensión.

Luego, coloque la placa en una cámara oxigenada a temperatura ambiente para su uso posterior. El segmento intestinal original debe estar ahora desprovisto de mucosa y submucosa, y debe exponerse el músculo circular. Este segmento se utiliza ahora para obtener una preparación del plexo mientérico con el fin de exponer el plexo mientérico.

Elimine tanto como sea posible la capa de músculo circular utilizando pinzas finas de punta recta para retirar los haces de fibras desde cada lado de la preparación. El plexo mientérico expuesto no puede separarse de la capa longitudinal de músculo ni de la capa subyacente de CI. Transfiera la preparación del plexo mientérico a un nuevo recipiente recubierto con sard que contenga M1 99 M oxigenado. Luego sujete ligeramente la muestra, que contiene músculo viable. Unos minutos antes del experimento óptico, transfiera la preparación a un nuevo recipiente más pequeño, recubierto con syl guard y ya lleno con M1 99 DM que contenga dos micromolar de nefe para prevenir la contracción muscular, y sujételo firmemente colocando cuidadosamente múltiples alfileres muy finos alrededor del perímetro.

Asegúrese de que la tensión esté distribuida uniformemente y de que el tejido quede completamente plano contra la base de la protección de silicio. La preparación del tejido ya está lista para experimentos fisiológicos. Prepare una solución permanente de cinco a 50 microgramos por mililitro de DAI cuatro A-N-E-P-P-D HQ en M1 99 M con dos micromoles de nifedipina en un vial de vidrio y cúbralo con papel de aluminio.

El etanol de la solución stock debe representar menos del 0,5 % de la solución al M1 99 DM con nifedipina que cubría la preparación y sustitúyalo con la solución de colorante preparada. Utilice un volumen suficiente del marcador para cubrir completamente el tejido e incube a temperatura ambiente durante 10 a 30 minutos. Tras la incubación, lave la preparación con M1 99 M más NEFE oxigenado, reemplazando todo el contenido de la cámara.

La grabación óptica de la actividad neuronal en preparaciones estimuladas eléctricamente se realiza mediante un sistema compuesto por un microscopio de fluorescencia epiescopia invertido equipado con un divisor de imagen, una cámara de alta velocidad y baja resolución, una cámara en blanco y negro de alta resolución, un generador de estímulos controlado por computadora y un micromanipulador. Todo el aparato está montado sobre una mesa activa de aislamiento de vibraciones y rodeado por gruesas cortinas acústicas y un techo de Mylar para minimizar las vibraciones aéreas. Aunque la adquisición de imágenes desde ambas cámaras puede realizarse utilizando una sola computadora que ejecute simultáneamente Neuro Plex y Global Lab Image Two o cualquier otro software de adquisición de imágenes, la configuración mostrada aquí emplea dos computadoras, cada una controlando una cámara independiente para comenzar los experimentos ópticos.

Coloque la cámara que contiene la muestra teñida y seleccionada sobre la platina del microscopio. Dado que D cuatro A y EPPD HQ es un colorante impermeable a la membrana que fluoresce únicamente en un entorno lipídico, las neuronas sanas de una preparación entérica teñida deben presentar el aspecto de globos vacíos bajo cualquier aumento superior a 20 x al observarlas. Utilice los filtros HQ 5 35 50 para excitación, HQ 5 72 LP cuatro para emisión y un espejo dicromático de 5 65 nanómetros.

A continuación, utilizando los controles del micromanipulador, coloque una matriz lineal de electrodos múltiples en el extremo oral del tejido, asegurándose de que el electrodo esté alejado del objetivo del microscopio. Una matriz lineal que contiene 10 electrodos de tungsteno distribuidos a lo largo de un tramo de un centímetro es capaz de excitar varias vías neuronales independientes y es muy adecuada para estudiar circuitos ganglionares interconectados. Sin embargo, para los datos representativos, utilizamos un electrodo estimulador casero de dos electrodos.

Utilice cera adhesiva para colocar un electrodo de tierra en el extremo opuesto de la cámara antes de realizar una grabación funcional; adquiera una imagen en blanco y negro de alta resolución de la región de la cual se registrará la actividad eléctrica para facilitar la visualización. El contraste puede invertirse de modo que la fluorescencia aparezca oscura. Para aplicar estimulación con corriente utilizando el generador de estímulos controlado por computadora, primero programe el dispositivo seleccionando la intensidad, duración, frecuencia y número de estímulos adecuados, así como el retraso con respecto al inicio de la adquisición de datos ópticos.

Para asegurarse de que la estimulación ocurra dentro de los límites de la adquisición óptica de datos, configure el generador de estímulos como un dispositivo controlado por neuro plex. A continuación, establezca los parámetros de adquisición dentro de neuro plex indicando la frecuencia de cuadros, el número de cuadros y la ganancia de la cámara. Para obtener una definición completa de un potencial de acción, la frecuencia de cuadros debe ajustarse como mínimo a un kilohercio.

Dado que D four A y E-P-P-G-H-Q muestran una disminución de la fluorescencia durante la despolarización que está linealmente relacionada con el cambio de voltaje, invierta la visualización de las señales ópticas en neuro plex para que los potenciales de acción no aparezcan al revés. Inicie la adquisición. Recuerde adquirir una nueva imagen en blanco y negro de alta resolución de cada campo de visión antes de realizar cada una de las grabaciones funcionales.

Una vez completada la adquisición, utilice neuro plex para analizar los resultados fuera de línea. Un área de la pantalla denominada visualización de página muestra la imagen cruda de la preparación tal como fue capturada por la cámara de alta velocidad de 80 por 80 como un fotograma individual. Cuando el modo de página es marco absoluto, superponga la imagen de alta resolución adquirida con la segunda cámara sobre el mapa de píxeles de la imagen cruda utilizando los comandos de visualización de neuro plex.

Esto requiere cambiar el modo de página de traza absoluta a trazas y seleccionar la imagen superpuesta dentro del comando de visualización. Utilice el ratón para seleccionar píxeles individuales o grupos de píxeles de la imagen mostrada en la visualización de la página. Las salidas de estas regiones de interés aparecerán como trazas dentro de la ventana de visualización de trazas, revelando las magnitudes de los cambios ópticos registrados por esos píxeles en función del tiempo.

La inversión de la escala de grises en la imagen de alta resolución mejora la visualización en la pantalla del modo de trazado y se recomienda encarecidamente mostrar una salida analógica del estimulador. Seleccione el canal de salida analógica para incluirlo en la ventana de visualización del trazado. Esta salida indica el momento exacto de los estímulos aplicados durante el experimento.

Para ver los datos como una película, utilice los comandos de película dentro de neuro plex para mostrar cuadros consecutivos dentro de un conjunto de datos utilizando escalas de colores pseudocromáticos ajustadas al cambio máximo y mínimo en la intensidad de fluorescencia. Se obtuvo una imagen de un ganglio de una preparación del plexo mientérico teñida con DIA cuatro A-N-E-P-P-D-H-Q mediante una cámara de alta resolución y un objetivo de 60 x. Durante la adquisición de datos, la preparación se estimuló con una serie de cinco impulsos a 40 hercios.

Con cada pulso teniendo una amplitud de 15 miliamperios y una duración de 0,5 milisegundos, se identificaron cuatro regiones de interés o ROI y se generaron trazos para mostrar los datos ópticos promediados sobre las regiones seleccionadas en la secuencia de cuadros con pseudocolores. Las primeras regiones de respuesta óptica de la despolarización de la membrana, que indican actividad neuronal, aparecen en color amarillo a rojo. Estos datos indican que la actividad evocada por estimulación ocurre en regiones discretas de cada ganglio, transportada principalmente por axones de paso. Las ROI dos, tres y cuatro identifican neuronas individuales a diversas distancias de la ROI uno.

La figura dos muestra a 10 x de aumento las vías anatómicas a lo largo de las cuales puede propagarse la información; las flechas indican la dirección seguida por el estímulo para activar el ganglio mientérico identificado. Acabamos de mostrarle los componentes de un montaje óptico para registrar la actividad eléctrica con colorantes sensibles al voltaje y cómo, cuando esta tecnología se aplica al sistema nervioso entérico, abre la posibilidad de estudiar la conectividad funcional dentro y entre dos redes mamíferas intactas bajo el campo del microscopio. Al utilizar la tecnología de registro óptico, la atención al detalle es extremadamente importante.

Es necesario controlar cuidadosamente las fuentes de ruido, ópticas, mecánicas y eléctricas, y preservar minuciosamente la salud de la preparación. Por lo tanto, dominar todos los pasos individuales de este protocolo es esencial para lograr el éxito en el registro óptico. Eso es todo.

Muchas gracias por ver este video y mucha suerte en sus experimentos.